Введение к работе
Актуальность темы. Инсулинозависимый сахарный диабет (ИЗСД) является тяжелейшим заболеванием вследствие повреждения островковой ткани поджелудочной железы (ПЖ) и сопровождается абсолютной инсулиновой недостаточностью. Сахарный диабет (СД) по распространённости занимает первое место среди эндокринологических заболеваний и третье место после сердечнососудистых и онкологических заболеваний.
Принимая во внимание угрожающие данные по статистике СД, остро встает вопрос о разработке принципиально новых подходов к его лечению, которое на сегодняшний день, как правило, является симптоматическим и не устраняет причины заболевания. Инсулинотерапия, по сути, не является лечением, это только способ отодвинуть на некоторое время наступление выраженных нарушений углеводного обмена, и, как следствие, осложнений СД. Введение больших доз инсулина не позволяет достичь желаемых результатов, т.е. полной компенсации углеводного обмена, и, тем самым, замедлить или остановить прогрессирование поздних сосудистых осложнений (Кузин М.И. с соавт., 1985; Литтман И., 1985). При этом лечение сопутствующих диабету ангиопатий эффективно только на фоне достигнутой стабилизации уровня глюкозы в крови (Дедов И.И. с соавт., 2004). Лечение СД в ветеринарии ограничивается только инсулинотерапией.
Применение экзогенного инсулина имеет ряд недостатков, связанных с постепенным развитием иммунного ответа на молекулу инсулина и потерю активности гормона. Препараты коммерческого инсулина, производимые фармкомпаниями созданы максимально приближенными к природному, однако методы генной инженерии не могут в полной мере смоделировать процессы биологического синтеза «зрелой» молекулы гормона, происходящие в -клетках ПЖ.
Другой метод лечения СД в гуманной медицине - трансплантация ПЖ или её части - связана с обязательной иммуносупрессией и обременена большим количеством этических проблем. Поэтому задача по поиску способа воздействия на причину заболевания и восстановления организмом утраченных функций остается актуальной и в медицине, и в клинической ветеринарии.
Успешное внедрение в практику экспериментальной биологии методов длительного культивирования стволовых клеток (СК) и клеток - предшественников различных тканей человека, работа с -клетками ПЖ, поиск адекватного клеточного материала, не вызывающего иммунного отторжения трансплантатов, создали предпосылки для разработки технологий заместительной клеточной и тканевой терапии. Один из таких методов - трансплантация в организм больного ИЗСД островковых клеток (ОК) ПЖ - представляется перспективным способом достижения гликемического контроля, поступления в организм эндогенного инсулина, предотвращения тяжёлых гипогликемий и сопутствующих осложнений (Скалецкий Н.Н. с соавт., 1994, Federlin K. et al., 1999).
Трансплантация -клеток ПЖ как потенциальный метод лечения диабета была внедрена в медицинскую практику более 10 лет назад, в ветеринарии этот метод не был отработан ни экспериментально, ни клинически. Однако применение этого метода будет всегда ограничиваться трудностями получения достаточного количества островков от доноров. Решением проблем тканевой трансплантации, а, следственно, лечения ИЗСД людей и животных, является разработка методов получения возобновляемых ресурсов клеток путём использования клеточных технологий.
Цель работы – разработать новые биотехнологические методы, направленные на получение инсулина in vitro, а также на лечение инсулинозависимого сахарного диабета мелких домашних животных.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Выделить из ПЖ плодов кролика, собаки, кошки -клетки, очистить; изучить их свойства и признаки in vitro.
-
Провести гибридизацию -клеток ПЖ плодов кролика с мутантной линией почки овцы, дефектной по тимидинкиназе (ПО ТК-).
-
Провести сравнительный анализ клонов межвидовых гибридных культур ПО ТК- х -клетки и отобрать клоны с высокой продукцией инсулина.
-
Адаптировать клоны с наиболее высокой продукцией инсулина к роллерно-суспензионному культивированию и получить суспензионные клоны гибридной культуры.
-
Изучить гистологическую совместимость межвидовых гибридных культур in vitro с сыворотками крови человека.
-
Разработать методы получения и культивирования примордиальных половых зародышевых клеток (ППЗК) свиньи.
-
Получить in vitro инсулин-секретирующие клетки, подобные -клеткам ПЖ, путем направленной дифференцировки эмбриональных половых клеток (ЭПК) свиньи.
-
Осуществить трансплантацию -клеток ПЖ плодов кролика лабораторным животным с экспериментальным СД и изучить влияние данной процедуры на течение заболевания.
-
Разработать метод трансплантации -клеток ПЖ плодов кролика мелким домашним животным с диагнозом СД и изучить влияние трансплантации клеток на течение заболевания.
Научная новизна. Впервые из ПЖ собак и кошек получены культуры -клеток, изучены их свойства и признаки in vitro. Оптимизированы методики выделения -клеток ПЖ плодов кроликов, разработаны методики выделения фетальных -клеток кошек и собак.
Впервые посредством слияния получена гибридная культура почка овцы х -клетки кролика (ПО ТК- х кр), способная продуцировать инсулин in vitro.
Впервые получены и прокультивированы ППЗК свиней. Проведена направленная индукция ЭПК свиньи в инсулин-секретирующие клетки.
В опытах на лабораторных животных установлено, что ксенотрансплантация -клеток ПЖ плодов кроликов нормализует течение экспериментального СД.
Впервые проведена клиническая трансплантация -клеток ПЖ плодов кроликов мелким домашним животным, больным СД. При этом доказано, что в результате трансплантации происходит снижение уровня глюкозы в крови и моче, снижение дозы либо отказ от экзогенного инсулина, уменьшение возникновения сопутствующих диабету сосудистых осложнений.
Научно-практическая значимость работы. Разработан и запатентован способ выделения -клеток кроликов, собак и кошек из плодной ПЖ на определенных сроках гестации и очистки их культивированием, а также способ лечения СД у собак и кошек, заключающийся в трансплантации -клеток непосредственно через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени, без применения иммуносупрессивной терапии (патент на изобретение РФ №2325921). Указанный способ успешно используется в ряде ветеринарных клиник.
Разработаны и утверждены «Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения».
Разработаны и утверждены «Методические рекомендации по лечению инсулинозависимого сахарного диабета (СД 1) собак и кошек методом внутрипеченочной трансплантации -клеток плодов кроликов».
Полученные результаты расширяют представление о методах клеточной инженерии, направленных на получение клеточных культур, стабильно продуцирующих инсулин.
Полученные результаты открывают перспективы, позволяющие разрабатывать способы получения клеточного материала, используемого в терапии СД.
Результаты исследования могут найти применение в теоретической и экспериментальной клеточной биологии, биотехнологии, физиологии, фармакологии и клинической ветеринарии.
Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: к.б.н. Т.А. Приданцева, к.б.н. Т.В. Гальнбек, д.б.н. Н.А. Зиновьева, д.б.н. Н.Н. Скалецкий, к.б.н. М.А.Селюгин, к.с-х.н. Ю.А.Кузнецов, к.б.н. А.С.Симонова, к.б.н. Н.Б. Савенко, Л.А. Сережина, к.б.н. Т.А. Сидорова, н.с. Н.А. Шевцова за что автор приносит им свою благодарность.
Основные положения, вынесенные на защиту:
-
Инсулино-продуцирующие и культурально - морфологические свойства культур -клеток из ПЖ плодов кроликов, собак, кошек не однозначны. Наиболее перспективным материалом для клеточной инженерии являются кроличьи -клетки.
-
Гибридизация -клеток с постоянной линией клеток почки овцы(ПО ТК-) и последующее клонирование позволяют получить культуру клеток – продуцентов инсулина in vitro.
-
Продукция инсулина в гибридных клонах зависит от длительности и метода культивирования.
-
Культивирование ЭПК свиньи в индукционной среде приводит к формированию колоний инсулин–продуцирующих клеток, подобных -клеткам ПЖ.
-
Предложенный метод терапии СД мелких домашних животных путем трансплантации очищенных -клеток ПЖ плодов кролика позволяет улучшить течение заболевания и сопутствующих ему осложнений.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: VIIth International Congress of Andrology «Andrology in the 21st Century» (Montreal, Canada, 2001); международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань, 2005); международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследовании по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008); Всероссийской научной конференции «Современные проблемы науки и образования» Российской академии естествознания (Москва, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 печатных работы, в том числе 10 в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 1 патент.
Структура и объем работы. Работа изложена на 300 страницах стандартного компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования с обсуждением полученных результатов, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы и приложение. Материалы диссертации иллюстрированы 36 таблицами, 118 рисунками. Библиографический список литературы включает 341 источник, из которых 240 - иностранных.
