Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 8
1 Литературный обзор 12
Строение, номенклатура и распространение полиненасыщенных жирных кислот 12
Биологические функции и области применения арахидоновой кислоты 15
Источники получения арахидоновой кислоты 19
Альтернативные источники получения арахидоновой кислоты 20
Скрининг продуцентов арахидоновой кислоты 24
Биосинтез полиненасыщенных жирных кислот и основы его регуляции у микроорганизмов 25
Промышленное производство арахидоновой кислоты 29
1.4 Производство арахидоновой кислоты с помощью Morderella alpina29
Глубинное культивирование 31
Поверхностное культивирование 35
Генетическая модификация продуцентов ПНЖК и их использование для получения ценных продуктов путем трансформации экзогенных липидов 36
Выделение и очистка 41
Методы разделения полиненасыщенных жирных кислот 43
Экстракция липидов и/или жирных кислот 45
Концентрирование полиненасыщенных жирных кислот и их разделение 50
Другие потенциально полезные методы концентрирования и очистки полиненасыщенных жирных кислот 58
2. Объекты, материалы и методы исследования 66
Объекты исследования 66
Материалы исследования 67
Методы исследования 70
Хранение микроорганизма 70
Изучение влияний условий культивирования на биосинтез арахидоновой кислоты у выбранного штамма 70
Определение ТТХ-редуктазной активности 71
Определение ТТХ-редуктазной активности в стандартных условиях 71
Исследование ТТХ-редуктазной активности 72
Исследование зависимости ТТХ-редуктазной активности от времени 72
Исследование зависимости ТТХ-редуктазной активности от температуры 72
Исследование зависимости ТТХ-редуктазной активности от рН 73
Исследование зависимости ТТХ-редуктазной активности от концентрации ингибитора 73
Выделение продуктов биосинтеза 74
Идентификация продуктов биосинтеза и трансформации 74
Тонкослойная хроматография 74
Хроматомасс-спектрометрия 74
Исследование влияния низких концентраций метиловых эфиров ПНЖК на всхожесть семян 75
Математическая обработка результатов опытов 76
3 Результаты и обсуждение 77
3.1 Исследование влияние состава среды на рост и липидообразование
гриба при поверхностном культивировании 77
3.1.1 Поиск основного твердого субстрата 77
3.1.2. Поиск добавок к овсяной среде 79
Влияние углеводородов 82
Влияние растительных масел и олеата натрия 83
Влияние глюкозы и глицерина 85
Влияние цитрата натрия 87
Влияние ионов Zn% Mg2+ 90
3.2 Корреляция ТТХ-редуктазной активности мицелия с содержанием
арахидоновой кислоты в липидах при росте гриба на овсяной среде с
глицерином и сульфатом цинка 92
Влияние условий на восстановление ТТХ 7- и 18-суточными мицелиями гриба 94
Корреляция ТТХ-редуктазной активности и содержания арахидоновой кислоты в липидах 18 - 23-ти суточных мицелиев, полученных на овсяных средах с различными добавками 98
Исследование динамики роста и состава липидов на перспективной среде 100
Исследование синтеза эйкозапентаеновой кислоты грибом Mortierella alpina НО
3.4.1 Двухстадийный синтез при разных температурах ПО
3.4.2 Синтез в условиях повышенной солености 112
3.4.3 Трансформация льняного масла в эйкозапентаеновую кислотуПб
3.5 Принципиальная схема получения ПНЖК 118
Различные способы выделения целевого продукта 118
Принципиальная технологическая схема получения арахидоновои кислоты культивированием гриба Mortierella alpina на плотной овсяной среде 121
3.6 Исследование биологической активности препаратов ПНЖК.... 127
Проращивание семян редиса 127
Проращивание семян пшеницы 130
Проращивание семян гороха 132
Проращивание семян фасоли 135
Проращивание семян свеклы 137
Проращивание семян моркови 138
Проращивание семян капусты 139
Проращивание семян огурцов 140
Выводы 143
Список использованных источников 145
Введение к работе
Актуальность работы. Полиненасыщенные жирные кислоты представляют собой уникальный класс органических веществ, играющих важную роль в биологических системах. Исследования последних четырех десятилетий вскрыли широкий спектр их функций в живых организмах. ПНЖК подвергаются биотрансформации липоксигеназами или циклооксигеназами, что приводит к образованию многочисленных низкомолекулярных регуляторов процессов, протекающих в клетках, тканях и организме в целом. Одной из самых важных ПНЖК является АК, которая выступает в роли непосредственного предшественника серии простагландинов, лейкотриенов и тромбоксанов. Основными областями применения АК являются: фармакология (предшественник различных лекарственных и профилактических препаратов применяемых при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, печени и др.); косметическая промышленность (средства по уходу за кожей); пищевая промышленность (обогащение различных продуктов питания, в том числе искусственных детских молочных смесей и др.); сельское хозяйство (высокоэффективный стимулятор роста и защитных реакций растений) и др. В настоящее время основным источником получения АК являются липидные экстракты из печени свиньи и других органов животных, что делает их крупномасштабное производство неэффективным (содержание АК оставляет не более 0,2% в пересчете на сухую массу). В течение последних двадцати лет значительные успехи были достигнуты в области биотехнологического получения АК с помощью низших грибов и морских водорослей, которые в ряде случаев позволили осуществить ее промышленное производство. Однако
существующие на сегодняшний день биотехнологии получения АК далеки от совершенства, поскольку ее выход в лабораторных условиях в лучших случаях составляет 13 г/л (Япония), а в среднем у различных исследователей около 6-Ю г/л (Россия, США, Польша и др.). В связи с этим создание эффективных отечественных биотехнологий получения АК и других ПНЖК является актуальной задачей.
Цель работы. Разработка эффективного метода получения ПНЖК на основе гриба Mortierella alpina (18-1) и исследование направлений их практического использования.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
поиск и подбор компонентов питательной среды для эффективного культивирования гриба;
исследование динамики накопления биомассы, АК и других ПНЖК на подобранной среде;
поиск экспресс-метода контроля за биосинтезом АК in vivo;
поиск условий биосинтеза других ценных ПНЖК;
обоснование принципиальной технологической схемы получения ПНЖК в оптимальных условиях;
исследование рострегулирующей активности ПНЖК. Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки в 2002-2006 гг.» (2004-2006 гг., госконтракт № 02.438.11.7003), с региональной программой РФФИ "Агидель" (2005г.), планами научно-исследовательских работ Уфимского
государственного нефтяного технического университета (2003-2006 гг.), ведомственной научной программой "Развитие научного потенциала высшей школы" (проект «Научно-образовательная деятельность музея, созданного на базе кафедры биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета», 2005-2006 гг.).
Научная новизна. Разработан метод экспресс-анализа содержания арахидоновой кислоты в мицелии гриба Mortierella alpina (18-1) в процессе культивирования на плотной овсяной среде. Найдены условия, позволяющие эффективно осуществлять биосинтез ПНЖК. В этих условиях исследована динамика состава ПНЖК в процессе культивирования. Научно обоснована принципиальная технологическая схема производства ПНЖК с помощью гриба М. alpina (18-1) на плотной овсяной среде. Показана принципиальная возможность получения практически ценной эйкозапентаеновой кислоты на основе изученного штамма М. alpina.
Практическая значимость. Разработан метод получения ПНЖК с помощью гриба М. alpina на твердой овсяной среде с выходом АК 15,3 г/кг среды. Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных работ и используются в учебном процессе при подготовке инженеров по специальности 240901 «Биотехнология» в УГНТУ.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на 55, 56, 57-й научно-технических конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ (2004-2006), V
Всероссийском научном семинаре и Молодежной научной школе «Химия и медицина» (Уфа, 2005), III Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 15-31 декабря 2005), IV, V Всероссийских научных INTERNET-конференциях «Интеграция науки и высшего образования в области био-и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2005- 2006).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 2 статьи и материалы докладов 7 конференций.
Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов, материалов и методов исследования (глава 2), обсуждения результатов (глава 3), выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 161 страницах машинописного текста, содержит 61 рисунок и 12 таблиц.
