Введение к работе
Актуальность проблемы
Одним из перспективных направлений современной биотехнологии является генетическая инженерия растений. Генетически модифицированные (ГМ) растения играют важнейшую роль в современном сельском хозяйстве, и в последние годы в мире наблюдается устойчивая тенденция к увеличению посевных площадей и расширению сфер их использования. Обязательным условием для внедрения ГМ растений в сельское хозяйство является установление их статуса биобезопасности.
Одним из основных потенциальных рисков при выращивании ГМ растений является возможность переноса и распространения ГМ вставки в популяциях диких родичей. Поэтому при исследовании биобезопасности ГМ растений, особенно в центрах происхождения и разнообразия видов, основная роль отводится изучению генетической структуры популяций диких родичей культурного растения и выбору модельных популяций для дальнейших исследований вероятности перекрёстного опыления между видами.
Устойчивая к гербициду ГМ соя оказалась перспективной моделью для изучения потенциального риска интрогрессии ГМ вставки в популяции диких родичей. Дикая и культурная соя {Glycine max (L.) Merr.) являются факультативными перекрёстниками -вероятность перекрёстного опыления варьирует от 0 до 3 % (Kiang et al., 1992; Nakayama and Yamaguchi, 2002; Dorokhov et al., 2004), что позволяет проводить эксперименты в естественных условиях. Кроме того, ГМ соя, используемая в экспериментах и обладающая устойчивостью к гербициду, в значительной мере облегчает идентификацию межвидовых гибридов.
Для проведения оценки потенциального риска передачи признака устойчивости к гербициду в популяцию дикой сои в условиях Дальневосточного региона был осуществлён поиск репрезентативной популяции G. sofa Siebold et Zucc, которая могла бы быть использована для этих целей.
Анализируя генетическую структуру популяций дикой сои, учитывали тот факт, что юг российского Дальнего Востока (Амурская область, Приморский и Хабаровский край) граничит с Китайско-Японским центром происхождения культурных растений (Вавилов, 1926) и является центром генетического разнообразия G. soja.
Контрастность местных агроклиматических условий является одной из причин высокого генетического разнообразия дальневосточных форм дикой сои (Седова, 1989; Сеферова, 2006). Поэтому предстояло выявить наиболее репрезентативную популяцию, обладающую наибольшим генетическим полиморфизмом.
Учитывая генетическое родство видов, выделяемых в подроде Soja, для изучения внутривидового и межвидового полиморфизма были выбраны методы RAPD и ISSR-анализа. Для изучения генетического разнообразия дикой сои с помощью RAPD-анализа необходимо было подобрать дизайн праймеров, оптимизировать условия ПЦР, выбрать группу праймеров наиболее эффективных для изучения генетического полиморфизма в подроде Soja рода Glycine.
Без использования молекулярно-генетических методов при изучении генетического разнообразия дикой сои невозможно корректно изучить потенциальное влияние интрогрессии ГМ вставки в популяции G. soja и оценить саму возможность сосуществования ГМ растений и их дикорастущих родичей в центрах происхождения и видового разнообразия и, в конечном счете, наиболее полно и эффективно использовать достижения современной биотехнологии.
Данная работа направлена на развитие новых методических подходов и их использование в изучении биобезопасности ГМ растений - важного этапа при внедрении достижений современной биотехнологии в экономику страны. Исследования проводились в соответствии с законом «О генно-инженерной деятельности», разрабатывались научно-методические подходы и рекомендации для применения ГМ растений в открытых системах и проведения контроля их биобезопасности. Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось исследование генетической структуры популяций дикой сои на юге Дальнего Востока России в контексте изучения потенциального риска использования ГМ растений в центрах происхождения и разнообразия их дикорастущих родичей. В соответствии с данной целью поставлены следующие задачи:
-
Отработать методические подходы для генотипирования и выявления внутривидового полиморфизма растений рода Glycine подрода Soja с использованием высокоэффективных ISSR и RAPD-праймеров и оптимизированных условий проведения ПЦР.
-
Изучить генетическую структуру популяции G. soja, произрастающей на Приханкайской равнине. Оценить возможность использования её в качестве репрезентативной при проведении экспериментов по изучению переноса генов от культурной к дикой сое.
-
Охарактеризовать степень генетической дифференциации популяций G. soja в антропогенных и естественных ландшафтах, исходя из того, что популяции дикой сои, произрастающие в антропогенных ландшафтах, являются первичными потенциальными акцепторами ГМ вставки.
-
Изучить филогенетические взаимоотношения в подроде Soja рода Glycine, используя 1SSR и RAPD-анализ.
-
Выявить уникальные фрагменты ДНК, характерные для G. max, G. soja и G. gracilis, необходимые для надёжной идентификации видов и межвидовых гибридов.
-
Отработать методологию молекулярной идентификации гибридов сои содержащих ГМ вставку, провести первичный скрининг присутствия ГМ сои (трансформационное событие GTS 40-3-2) в земледельческом районе Приханкайской равнины юга российского Дальнего Востока.
-
Разработать рекомендации по минимизации риска «выхода» ГМ вставки в естественные популяции при внедрении ГМ сортов сои на территории Дальнего Востока России и предложить меры для сохранения генофонда дикой сои.
Научная новизна
Подобран дизайн праймеров и оптимизированы условия ПЦР для проведения популяционно-генетических и филогенетических исследований растений, относящихся к подроду Soja рода Glycine, а также поиска уникальных фрагментов.
Впервые проведен детальный анализ генетической структуры популяций G. soja юга Дальнего Востока России. Установлено высокое генетическое разнообразие естественных популяций дикой сои, сопоставимое с данными для китайских популяций, произрастающих, как считается, в центре происхождения вида. Детально охарактеризованная популяция приханкайской равнины может быть использована в качестве модельной при проведении испытаний на биобезопасность ГМ сои.
Сравнительные исследования генетического разнообразия популяций дикой сои, произрастающих в естественных и антропогенных ландшафтах, выявили пониженное генетическое разнообразие у растений G. soja, характерных для антропогенно-нарушенных фитоценозов.
По результатам молекулярно-генегаческого анализа филогенетических отношений в подроде Soja рода Glycine подтверждено, что виды G. soja, G. gracilis и G. max являются близкородственными.
Получены ДНК-фрагменты видов G. soja (ОРХ-О5450) и G. max (ОРО-О5750), которые могут быть использованы для выявления межвидовых гибридов, в случае, когда затруднено использование морфологических признаков.
Практическая ценность
Предложены праймерные системы и условия ПЦР для проведения популяционно-генетических исследований дикой сои, поиска уникальных фрагментов и филогенетических исследований в подроде Soja рода Glycine.
Установлено, что популяция G. soja, произрастающая на Приханкайской равнине, обладает генетическим разнообразием, сходным с таковым, полученным для других популяций дикой сои, произрастающих в центре происхождения вида, и может использоваться в дальнейших работах по изучению биобезопасности ГМ сои.
Для сохранения генофонда G. soja необходимо проводить систематические охранные мероприятия в верховьях рек, направленные на защиту природных популяций дикой сои, а также ввести запрет на хозяйственную деятельность на этих территориях. Структура и объём работы
Диссертация изложена на 104 страницах и состоит из Введения, 3-х глав, Выводов, Списка литературы (150 наименований). Работа включает 15 таблиц, 28 рисунков, 4 приложения. Благодарности
Автор глубоко признателен за внимание и поддержку руководителю к.б.н. Д.Б. Дорохову, директору Центра «Биоинженерия» РАН академику К. Г. Скрябину, д.б.н. Г. Н. Челоминой, директору Ботанического сада-института ДВО РАН д.б.н. А. В. Галанину, к.б.н. Н. А. Василенко, д.б.н. А. Н. Игнатову, к.б.н. С. В. Клицову, Д. Ш. Маллабаевой, Ю.Э. Гербеку.
