Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Структурно-функциональная организация термолизин-подобных протеиназ
1.1.1. Общая характеристика молекул термолизин-подобных протеиназ 7
1.1.2. Организация активного центра 13
1.1.3. Организация субстрат-связывающего кармана 16
1.1.4. Организация сайтов связывания ионов Са"+ 19
1.2. Про-зависимый фолдинг термолизин-подобных протеиназ 24
1.3. Молекулярные основы стабилизации термолизин-подобных протеиназ 34
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 49
2.1. Микробные штаммы и плазмиды 49
2.2. Культивирование микроорганизмов 49
2.3. Выделение плазмидной ДНК 50
2.4. Выделение бактериальной ДНК Thermoactinomyces species 27а 50
2.5. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот 51
2.6. Ферментативный гидролиз ДНК 51
2.7. Конструирование библиотеки генов Thermoactinomyces species 27а 51
2.8. Трансформация клеток Bacillus subtilis AJ73 52
2.9. Трансформация клеток Escherichia coli TGI 52
2.10. Полимеразная цепная реакция 53
2.11. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 53
2.12. Анализ динамики накопления протеолитических ферментов в культуральнои жидкости штаммов-продуцентов 53
2.13. Выделение рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а 54
2.14. Электрофоретический анализ белков 55
2.15. Количественное определение белка 56
2.16. Определение молекулярной массы белка 56
2.17. Определение N-концевой аминокислотной последовательности 56
2.18. Определение протеолитической активности ферментов 56
2.19. Влияние рН на стабильность фермента 57
2.20. рН-Оптимум протеолитической активности 57
2.21. Влияние температуры на стабильность фермента 57
2.22. Температурный оптимум протеолитической активности 57
2.23. Влияние ионов кальция на стабильность фермента 58
2.24. Влияние ингибиторов 58
2.25. Определение энзиматических констант фермента 58
2.26. Локализация лидерного пептида 58
2.27. Статистическая обработка данных 58
2.28. Представление молекул 59
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 60
3.1. Клонирование гена металлопротеиназы Thermoactinomyces species 60
3.2. Характеристика клонированного фрагмента бактериальной ДНК Thermoactinomyces species 27а, несущего ген металлопротеиназы 65
3.3. Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а 66
3.4. Очистка рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а....74
3.5. Характеристика рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а 77
ВЫВОДЫ -. 83
БЛАГОДАРНОСТИ 84
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 85
- Структурно-функциональная организация термолизин-подобных протеиназ
- Микробные штаммы и плазмиды
- Клонирование гена металлопротеиназы Thermoactinomyces species
Введение к работе
Актуальность работы.
Протеолитические ферменты широко используются в современной биотехнологии. При этом физико-химические и энзиматические свойства даже тщательно подобранных биокатализаторов часто не оптимальны для конкретных технологических процессов. Успехи современной белковой инженерии позволяют рассчитывать на то, что в ближайшем будущем стандартным подходом станет конструирование ферментов с направленно модифицированными свойствами. Однако на настоящий момент наши знания о молекулярных механизмах, определяющих структурно-функциональные взаимосвязи в белковых молекулах, явно недостаточны. Для проведения исследований структурно-функциональной организации белков удобно использовать семейства родственных ферментов, отличающихся по своим физико-химическим свойствам. Такие наборы детально охарактеризованных белков с соответствующими клонированными генами позволяют проводить разнообразные эксперименты, направленные на анализ структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах. В этом плане актуален поиск новых природных ферментов с заданной специфичностью и конкретными характеристиками. С этой целью в лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН проводится скрининг коллекций различных микроорганизмов, добытых из необычных природных и промышленных источников. В результате анализа отобран ряд штаммов, которые являются продуцентами ферментов, интересных с научной точки зрения и перспективных для практического использования. Одним из таких штаммов является штамм Thermoactinomyces species 27а, который продуцирует термостабильные секреторные протеиназы, в том числе и металлопротеиназы. На данный момент протеолитические ферменты термоактиномицетов охарактеризованы недостаточно. Всё это определяет актуальность работы по клонированию, экспрессии и детальной характеристике металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а.
Работа поддержана грантами РФФИ № 00-04-48281 и № 03-04-48755.
Цель работы.
Целью данной работы является клонирование и экспрессия гена новой металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а, установление нуклеотидной
последовательности гена, выделение и очистка рекомбинантного фермента,
физико-химическая и энзиматическая характеристика металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.
Научная новизна.
Клонирован и экспрессирован в клетках Bacillus subtilis ген новой металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а. Установлена нуклеотидная
последовательность клонированного гена Thermoactinomyces sp. 27а. Новая металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а относится к семейству
термолизин-подобных протсиназ. При этом фермент Thermoactinomyces sp. 27а обладает рядом специфических особенностей, таких как наличие уникальной протяженной С-концевой аминокислотной последовательности и присутствие аминокислотных замен в сайтах связывания ионов Са2+. Выделена и очищена до электрофоретически гомогенного состояния рекомбинантная металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а. Установлены физико-химические и энзиматические характеристики нового фермента Thermoactinomyces sp. 27а.
Показано протекание С-концевого процессинга при созревании металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а в клетках Bacillus subtilis.
Практическая значимость.
Детально изученная новая металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а может быть использована в ряде биотехнологических процессов, например, при получении олигопептидов заданной структуры, а также является удобным объектом для исследования структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах. В настоящее время металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а применяется в качестве экспериментальной модели для изучения про-зависимого фолдинга термолизин-подобных протеиназ методами белковой инженерии в Институте молекулярной генетики РАН.
Положения, выносимые на защиту.
1. Клонирование и экспрессия гена новой металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а, установление его нуклеотидной последовательности.
2. Выделение и очистка рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.
3. Определение физико-химических и энзиматических характеристик новой металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.
4. Протекание С-концевого процессинга при созревании металлопротеиназы в клетках Bacillus subtilis.
Структурно-функциональная организация термолизин-подобных протеиназ
В начале второй половины прошлого века развитие молекулярной биологии и биохимии привело к значительному росту числа известных ферментов, однако до конца 50-х годов единой системы классификации ферментов не существовало. В связи с этим по инициативе Международного Союза Биохимии (The International Union of Biochemistry) и Международного Союза Теоретической и Прикладной Химии (The International Union of Pure and Applied Chemistry, ШРАС) был создан комитет, который сформулировал основные правила классификации ферментов, в том числе протеиназ. В настоящее время система классификации ферментов поддерживается Международным Союзом Биохимии и Молекулярной Биологии (The International Union of Biochemistry and Molecular Biology, IUBMB) [1].
Рис. 1. Классификация протеолитических ферментов. О — аминокислотные остатки внутри полипептидной цепи; о — аминокислотные остатки на концах полипептидной цепи; О, 1 -блокированный конец полипептидной цепи; - место гидролиза полипептидной цепи.
Экзопептидазы Аминопептдазы Ди- и трипептидилпептидазы Карбоксипептидазы Пептид илдипептидазы Дипептидазы Омега пептидазы Эндошеп тидазы Протеиназы клас сифицируются на основе оценки их специфич ности, структуры катали тического ап парата, физико-химических и энзиматических харак теристик. Наиболее существенными крите риями являются специ фичность и структура каталитического аппа рата [1]. В общем виде классификация про теиназ приведена нарис. 1. Как видно из рис. 1, протеиназы подразделяются на группы по положению расщепляемой связи в пептидной цепи - на экзо- и эндопептидазы. Представленные группы разбиваются в дальнейшем на десятки подгрупп [1,2], критерии выделения которых часто неравноценны, а в некоторых случаях не очевидны.
Одну из наибольших групп нротеолитических ферментов составляют металлопротеиназы. Они содержат в своем составе двухвалентный ион металла (чаще всего Znz+, Со , Mnz+, реже Са2+, Mg2+), необходимый для катализа. Это объясняет их инактивацию такими хелатирующими реагентами, как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или 1,10-фенантролином [3].
В настоящее время на основе структурных и физико-химических признаков выделяют 50 семейств металлопротеиназ, 32 из которых включают эндопептидазы, 17 -экзопептидазы, и одно (МЗ) включает ферменты обеих групп. Термолизин-подобные протеиназы (TLPs) относятся к семейству М4 [4]. Схема эволюционных взаимосвязей этого семейства представлена на рис. 2. К настоящему моменту известны полные аминокислотные последовательности (определенные непосредственно или выведенные из структуры клонированных генов) 81 фермента данного семейства, которые представляют собой группу белков, секретируемых клетками как грамм-положительных, так и грамм-отрицательных бактерий. Зрелые металлопротеиназы состоят из единой полипептидиой цепи длиной 310-320 аминокислотных остатков, имеют молекулярный вес 32-34 кДа, содержат в составе аминокислотной последовательности НЕХШ-Е мотив, участвующий в акцепции каталитически активного иона Zn"+ [5] и включают от 2 до 4 ионов Са + на молекулу [6, 7]. TLPs имеют оптимум активности при нейтральных значениях рН [3, 4, 8] и являются эндопептидазами с широкой специфичностью действия, проявляя некоторое предпочтение к гидролизу пептидных связей, образованных аминогруппами гидрофобных и ароматических аминокислотных остатков [4, 9-11]. Секреторные протеиназы бацилл (или бациллолизины), исследованию которых посвящена данная работа, относятся к семейству М4. Эти ферменты представляют собой группу близкородственных белков, секретируемых клетками бацилл различных видов (а также рядом близких грамм положительных микроорганизмов) в окружающую среду. Наиболее охарактеризованным представителем секреторных металлопротеиназ бацилл является термолизин (TLN, ЕС 3.4.24.27), который продуцируется термофильным микроорганизмом Bacillus thermoproteolyticus [12]. Сравнение аминокислотной последовательности термолизина с рядом последовательностей бациллярных TLPs, а также построенная на основе данного сравнения таблица идентичности приведены на рис. 3 и в табл. 1.
Микробные штаммы и плазмиды
В работе использовали штамм Thermoactinomyces sp. 27а из коллекции микроорганизмов Института микробиологии РАН. Штамм Bacillus subtilis AJ73 (арГ, прг"), а также плазмида рСВ22 [175] были любезно предоставлены сотрудниками ГНИИГенетика Ю.И. Иомантасом и А.В. Сорокиным. Штамм Escherichia coli TGI и плазмида pUC19 [176] были получены из коллекции Института молекулярной генетики РАН.
2.2. Культивирование микроорганизмов.
Твердые питательные среды:
- L-arap (пептон Юг/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, хлорид натрия 5 г/л, бакто-агар 15 г/л);
- молочный агар (бакто-агар 2%, обезжиренное молоко 30%).
Жидкие питательные среды:
- L-бульои (Luria-Bertani) (пептон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, хлорид
натрия 5 г/л); среды Спицайзена [177J:
& солевая основа среды Спицайзена, рН 7,0 (К2НР04-ЗН20 183,4 г/л, КН2РО4 60 г/л,
(NH4)2S04 20 г/л, Na2C6H507-5,5H20 12 г/л);
среда Спицайзена I (глюкоза (20%) 20 мл/л, казаминовые кислоты (2%) 20 мл/л,
L-триптофан (0,5%) 10 мл/л, дрожжевой экстракт (5%) 20 мл/л, MgS04 7H20 (20%)
1 мл/л, солевая основа среды Спицайзена 100 мл/л);
среда Спицайзена II (глюкоза (40%) 20 мл/л, казаминовые кислоты (2%) 1 мл/л,
L-триптофан (0,5%) 1 мл/л, MgS04-7H20 (20%) 8 мл/л, солевая основа среды
Спицайзена 100 мл/л).
Культивирование микроорганизмов проводили при интенсивной аэрации. Температура и сроки выращивания варьировали в зависимости от используемых микробных культур.
2.3. Выделение плазмндной ДНК.
Плазмидную ДНК выделяли щелочным методом по стандартной методике [178].
2.4. Выделение бактериальной ДНК Thermoactinomyces species 27а.
Для выделения бактериальной ДНК Thermoactinomyces sp. 27а микробные клетки выращивали в течение 15 ч в 100 мл L-бульона, затем осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин. Осажденную биомассу промывали 0,15 М раствором NaCl и ресуспендировали в 10 мл 10 мМ трис-HCl буфера рН 8,0, содержащего 0,05 мМ ЭДТА и 20% сахарозы. К суспензии добавляли 10 мл 10 мМ трис-HCl буфера рН 8,0, содержащего 0,05 мМ ЭДТА и 10 мг/мл лизоцима, и инкубировали 60 мин при 37. После чего добавляли додецилсульфат натрия до конечной концентрации 1% с последующей инкубацией при осторожном перемешивании в течение 30 мин при 20е. Для экстракции белков к раствору добавляли один объем насыщенного фенола (80 % фенола, 20 % 0,05 М трис-HCl буфера рН 8,0, ОД % оксихинолина, 0,2 % меркаптоэтанола), перемешивали 1 ч, центрифугировали 40 мин при 4000 об/мин, отбирали водную фазу и повторяли операцию с фенолом еще 2 раза. После чего добавляли равный объем хлороформа, перемешивали в течение 10 мин и центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об/мин. Для осаждения бактериальной ДНК в водную фазу добавляли два объема этанола, 1/10 объема 5 М ацетата калия, перемешивали и выделяли ДНК, наматывая се на стеклянный капилляр. ДНК промывали 70% этанолом, после чего высушивали на воздухе и растворяли в 5 мл 10 мМ трис-HCl буфера рН 8,0, содержащего 1 мМ ЭДТА.
Качество выделенной бактериальной ДНК анализировали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле.
Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот.
Электрофорез нуклеиновых кислот [178] проводили в 1,0-2,0%-ном горизонтальном агарозном геле при напряженности электрического поля 5-10 В/см, используя 89 мМ трис-боратный буфер, содержащий 2 мМ ЭДТА, рН 7,6. Для окрашивания ДНК гель после электрофореза выдерживали 10 мин в растворе флуоресцентного красителя бромистого этидия с концентрацией 0,5 мкг/мл.
Ферментативный гидролиз ДНК.
Гидролиз ДНК рестриктирующими эдонуклеазами проводили по стандартным методикам [178]. Фрагменты, полученные при рестрикции, анализировали электрофоретически в агарозном геле. В качестве маркера для определения размеров фрагментов была использована ДНК фага Л, расщепленная эндонуклеазой Pstl.
Конструирование библиотеки генов Thermoactinomyces species 27а. Библиотека генов бактериальной ДНК Thermoactinomyces sp. 27а была сконструирована на основе плазмидного вектора рСВ22, содержащего уникальный сайт распознавания для рестриктирующей эидопуклеазы Bglll. Ограниченный гидролиз бактериальной ДНК осуществляли рестриктирующей эндонуклеазой БаиЗА в предварительно подобранных условиях с образованием фрагментов рестрикции со средним размером 2-6 т.п.н. Для подбора условий рестрикции бактериальной ДНК Thermoactinomyces sp. 27а реакционную смесь объемом 40 мкл, содержащую 5 мкг бактериальной ДНК, 4 мкл 10-ти кратного буфера D, 0Д5 ед эндонуклеазы 5а«ЗА, инкубировали при 37. При этом отбирали аликвоты на 2, 4, 8, 15 мин и помещали на ледяную баню. Размер образующихся фрагментов бактериальной ДНК анализировали электрофорезом в 1,2%-ном агарозном геле (см. раздел 2.5). В качестве маркера для определения размеров образующихся фрагментов была использована ДНК фага X, расщепленная эндонуклеазой Pstl. Таким образом, частичное расщепление бактериальной ДНК проводили в течение 12 мии при 37, при этом средняя длина полученных фрагментов составляла 2-6 т.п.н.
Лигирование производили при соотношении 1 мкг ДНК вектора/2 мкг ДНК фрагментов и концентрации ДНК вектора 100 мкг/мл. Клетки Bacillus subtilis AJ73 трансформировали полученной лигазной смесью по стандартной методике (см. раздел 2.8). Колонии клеток, проявляющих протеиназную активность, отбирали по характерному свойству образовывать зоны гидролиза казеина на чашках с молочным агаром в присутствии Em.
Трансформация клеток Bacillus subtilis AJ73.
Трансформацию клеток Bacillus subtilis AJ73 проводили в два этапа:
1) получение компетентных клеток Bacillus subtilis AJ73 проводили по методу Спицайзеиа [177], выращивая культуру клеток в 5 мл L-бульонав течение 12 ч при 37 при высокой аэрации (200 об/мин). К 4,5 мл среды Спицайзена I, предварительно подогретой до 37е, добавляли 0,5 мл выросшей культуры и подращивали её при высокой аэрации (200 об/мин) в течение 4,5 ч при 37. Затем к 5 мл среды Спицайзена II, предварительно подогретой до 37? добавляли 40 мкл раствора 0,8 М MgSC 4 и вносили 0,75 мл клеточной культуры, выросшей в среде Спицайзена I. После этого клетки растили в течение 1,5 ч при высокой аэрации (200 об/мин);
2) трансформацию клеток Bacillus subtilis AilЪ проводили, добавляя к 500 мкл полученной суспензии компетентных клеток 10 мкл раствора ДНК (0,1-0,25 мкг) и инкубировали в течение 40 мин при 37. Затем смесь инкубировали ещё при 37 в течение 1 ч при высокой аэрации (200 об/мин). После чего трансформационную смесь высевали на чашки Петри с молочным агаром, содержащим 20 мкг/мл Em.
Клонирование гена металлопротеиназы Thermoactinomyces species
Штамм Thermoactinomyces sp. 27а ранее был отобран в лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН в результате скрининга микроорганизмов из коллекции Института микробиологии РАН, как продуцент термостабильных нротеолитических ферментов различных групп, в том числе и металлопротеиназ. В связи с тем, что иротеиназы микроорганизмов рода Thermoactinomyces на данный момент исследованы недостаточно, были проведены эксперименты, направленные на молекулярное клонирование и экспрессию гена нейтральной протеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.
Клонирование гена металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а проводили следующим образом:
1) выделение бактериальной ДНК Thermoactinomyces sp. 27а;
2) расщепление её на фрагменты со средней протяженностью 2-6 т.п.н. при помощи ограниченного гидролиза рестриктазой Sau3A;
3) конструирование генетической библиотеки Thermoactinomyces sp. 27а на основе двурепликонного плазмидного вектора рСВ22;
4) трансформация полученной генетической библиотекой клеток дефектного по собственным секреторным протеолитическим ферментам штамма Bacillus subtilis AJ73;
5) высев колоний на молочный агар и отбор клонов, формирующих зоны гидролиза казеина;
6) определение групповой принадлежности ферментов - продуктов экспрессии клонированных генов ингибиторным анализом.
Схема клонирования гена металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а представлена на рис. 15.
Библиотека генов Thermoactinomyces sp. 27а сконструирована на базе плазмидного вектора рСВ22 ["175]. Отметим, что плазмида рСВ22 - двурепликонный вектор, способный реплицироваться в клетках Bacillus subtilis и Escherichia coli и содержащий несколько удобных сайтов рестрикции (рис. 15).
Для создания банка генов Thermoactinomyces sp. 27а частично расщепленную эндонуклеазой БаиЗА бактериальную ДНК лигировали с плазмидой рСВ22, линеаризованной эндонуклеазой Bglll, Лигазной смесью трансформировали клетки
штамма Bacillus subtilis AJ73 со сниженным уровнем собственных секреторных протсиназ. Эффективность трансформации составляла 2000-3000 колоний на мкг ДНК вектора. Колонии клеток, проявляющих протеолитическую активность, отбирали по характерному свойству образовывать зоны гидролиза казеина на чашках с молочным агаром в присутствии Em.
Для анализа представительности сконструированной библиотеки генов Thermoactinomyces sp. 27а отобрали 10 клонов-трансформантов. Из всех клонов выделили плазмиды, которые обозначили как рТ1-рТ10. Для характеристики размеров клонированных в составе плазмидного вектора фрагментов бактериальной ДНК проводили рестрикцию плазмид рТ1-рТ10 эндонуклеазой ВатШ с последующим электрофоретическим анализом образующихся фрагментов. В результате экспериментов было продемонстрировано, что все плазмиды содержали фрагменты чужеродной ДНК, причем 80% плазмид содержали вставки размером 2-6 т.п.н.
Скрининг рекомбинантных клонов, продуцирующих экстрацеллюлярные протеазы и образующих зоны гидролиза казеина на чашках с молочным агаром в присутствии Em, привел к обнаружению 10 колоний из числа около 45000, полученных в результате трансформации. Из идентифицированных колоний выделили плазмиды, которые обозначили как р1-р10. С целью подтверждения того, что способность отобранных клонов продуцировать протеолитические ферменты действительно связана с полученными рекомбинантными плазмидами, была осуществлена ретрансформация клеток Bacillus subtilis AJ73 выделенными препаратами плазмид pl-pl 0. При этом было продемонстрировано, что при трансформации плазмидами pl-plO все образующиеся колонии были способны формировать зоны гидролиза казеина на молочном агаре в присутствии Em.
Для характеристики размеров клонированных в составе плазмидного вектора вставок бактериальной ДНК Thermoactinomyces sp. 27а проводили рестрикцию плазмид pl-plO эндонуклеазой ВатШ с последующим электрофоретическим анализом образующихся фрагментов. В результате проведенных экспериментов было продемонстрировано, что плазмиды pl-plO содержали чужеродные фрагменты размером около 2,5; 2,0; 5,0; 2,3; 4,5; 3,5; 1,8; 3,0; 1,5; 2,1 т.п.н., соответственно.
Для анализа динамики накопления протеолитических ферментов в культуралыюй жидкости штаммов Bacillus subtilis AJ73, несущих плазмиды pl-plO, культуры клеток выращивали в L-бульоне в присутствии 1 мМ СаСЬ в течение 45 ч при высокой аэрации, отбирая аликвоты на различных стадиях роста для измерения общей протеолитической активности ферментов по гидролизу азоказеина. Добавление Са+ оказывает стабилизирующее действие на многие белковые молекулы, а в случае протеолитических ферментов, содержащих в своей структуре ионы кальция, способно в значительной степени препятствовать авто лити ческой деградации. Штаммы Bacillus subtilis AJ73, несущие плазмиды р9, р10 и образующие зоны гидролиза казеина на чашках с молочным агаром в присутствии Em, давали лишь незначительное накопление протеолитической активности в культуральной жидкости. Это может свидетельствовать о нестабильности ферментов при их секреции в культуральную жидкость, однако возможно и другое объяснение. В то же время штаммы Bacillus subtilis AJ73, несущие плазмиды pl-p8,
