Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ГК: строение и свойства, биологические функции и метаболизм у различных организмов, получение и применение.
1.1. История открытия ГК и основные этапы ее изучения . 11
1.2. Химическое строение и некоторые физико-химические свойства 15 ГК.
1.2.1.' Пространственная структура ГК. Вторичная и третичная 18
структуры ГК в водных растворах.
1.3. Нахождение и биологические функции ГК у различных организмов. 22
1.3.1. Наличие ГК у организмов разных таксонов. 22
1.3.2. ГК в тканях млекопитающих и человека. Функции ГК. 24
1.3.3. ГК как компонент капсул бактерий. 27
1.4. Метаболизм ГК. 31
1.4.1. Биосинтез ГК. Биохимические и генетические аспекты 31
процесса: ферменты, гены, регуляция.
1.4.1.1. Биохимический путь синтеза ГК. 31
1.4.1.2. Функциональные и кинетические характеристики, 34
локализация, строение и каталитический механизм действия гиалуронатсинтаз.
1.4.1.3. Характеристика оперона синтеза ГК бактерий 40
p. Streptococcus: структура, клонирование и регуляция экспрессии.
1.4.2. Катаболизм ГК у бактерий p. Streptococcus. 44
1.4.2.1. Классификация ферментов, осуществляющих 44 деполимеризацию ГК.
1.4.2.2. Гиалуронатлиаза бактерий p. Streptococcus: 45 функциональные и кинетические характеристики, строение, механизм действия.
1.4.2.3. Биологическая роль гиалуронатлиаз у бактерий p. Streptococcus. 50
1.5. Получение ГК. 51
1.5.1. Получение ГК экстракцией из животного сырья. 51
1.5.2. Получение ГК микробиологическим синтезом. 53
1.5.2.1. Штаммы-продуценты ГК. 5 3
1.5.2.2. Среды, условия и режимы культивирования штаммов-продуцентов ГК.
1.6. Практическое использование ГК. 61
1.6.1. Медицинское применение ГК. 62
1.6.2. Применение ГК в косметологии. 64
1.7. Заключение. 65
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. Материалы и методы. 67
2.1. Материалы . 67
2.2. Объекты исследования. 67
2.3. Условия культивирования S. zooepidemicus. 67
2.4. Условия проведения энзиматической деполимеризации ГК. 68
2.5. Выделение ГК из КЖ S. zooepidemicus. 69
2.6. Аналитические методы. 70
2.6.1. Анализ ГК. 71
2.6.2. Анализ глюкозы и продуктов метаболизма S. zooepidemicus. 73 2.6.3.«Определение концентрации биомассы S. zooepidemicus. 73
2.6.4. Электрофорез белков в ПААГ. 74
2.6.5. Определение молекулярной массы ГК вискозиметрическим методом. 75
2.7. Микробиологические методы исследований. 76
2.8. Аппаратурные методы исследований. 76
2.9. Методы статистической обработки результатов исследования. 77
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. Биосинтез ГК культурой S. zooepidemicus. 78
3.1. Выбор объекта исследования . 78
3.2. Выбор среды культивирования. 79
3.3. Кинетика роста и синтеза ГК штаммом & zooepidemicus В-8014 при глубинном культивировании. 82
3.4. Определение гиалуронидазной активности штамма S. zooepidemicus В-8014. 84
3.5. Получение мукоидных штаммов S. zooepidemicus воздействием 86i
УФ.
3.6. Оптимизация состава питательной среды и режимов 94
культивирования S. zooepidemicus КБ-04.
3.6.1. Оптимизация состава питательной среды методом 94
Плаккета-Бурмана.
3.6.2. Зависимость биосинтеза ГК бактериями p. Streptococcus от 98 вида источника углерода и энергии.
3.6.3. Влияние концентрации глюкозы в питательной среде на 99 рост культуры и биосинтез ГК. Определение ингибирующей концентрации глюкозы.
3.6.4. Определение оптимальных значений рН для синтеза ГКкультурой S. zooepidemicus КБ-04. 102
3.6.5. Влияние катионов двухвалентных металлов на синтез ГК штаммом S. zooepidemicus КБ-04. 104
3.6.6. Влияние аэрации ферментационной среды на синтез ГКS. zooepidemicus. ГК как фактор защиты от токсического действия кислорода. 107
3.6.7. Биосинтез ГК штаммом S. zooepidemicus КБ-04 при глубинном культивировании с рН-статированием и подпитками по субстрату. 114
3.7. Заключение. 116
Глава 4. Деполимеризация ГК стрептококковой гиалуронатлиазой. 117
4.1. Выбор объектов исследования. 117
4.2. Реологические свойства растворов различных образцов ГК. 119
4.3. Кинетика деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой.
4.3.1.-Кинетическая схема деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой. 127
4.3.2. Вискозиметрический метод наблюдения за ходом реакции деполимеризации ГК. 129
4.3.3. Вискозиметрическое определение активности бактериальных гиалуронатлиаз.
4.3.4. Спектрофотометрический метод кинетических исследований расщепления ГК и определение активности стрептококковой гиалуронатлиазы.
4.3.5. Определение продуктов деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой методом ВЭЖХ. 135
4.3.6. Инактивация стрептококковой гиалуронатлиазы в ходе 136 деполимеризации ГК.
4.3.7. Определение оптимальных условий функционирования 140 стрептококковой гиалуронатлиазы.
4.4. Биологическая функция гиалуронатлиаз как ферментов катаболизма ГК, снабжающих бактерии p. Streptococcus источником углерода и энергии. 141
4.5. Получение фракций низкомолекулярной ГК с заданной 144 молекулярной массой путем энзиматической деполимеризации высокомолекулярной ГК.
4.6. Определение ГК методом ВЭЖХ по продуктам ее энзиматической деградации стрептококковой гиалуронатлиазой. 146
4.7. Заключение. 149
Основные результаты и выводы. 150
Список использованной литературы. 152
Введение к работе
В конце XX - начале XXI века наметилась отчетливая тенденция к повсеместному внедрению в промышленность различных биопроцессов и к замене традиционных способов производства целого ряда веществ, имеющих медицинское, косметическое, пищевое, кормовое или иное назначение, на биотехнологические способы получения. Одновременно с этим раскрытие функций и механизмов биологического действия ряда биополимеров способствует созданию все новых продуктов и препаратов на их основе. Одним из таких биополимеров животного происхождения является гиалуроновая кислота (ГК). Прогресс в понимании биологических функций ГК [1] привел и, безусловно, еще приведет к расширению сфер применения данного гликозаминогликана в составе различных медицинских, косметических, ветеринарных препаратов и дальнейшему увеличению спроса на биополимер. При этом уже сейчас наблюдается определенный дефицит ГК высокой и относительно небольшой молекулярной массы, что отражается на высокой цене полисахарида, особенно по сравнению с аналогичными соединениями растительного, животного или микробного происхождения.
Традиционный способ получения ГК основан на экстракции биополимера из различных органов млекопитающих и птиц, например из стекловидного тела глаза крупного рогатого скота, гребней кур или пупочных канатиков новорожденных. Даже при беглом анализе животных источников ГК видно, что сырьевая база промышленного получения данного полисахарида весьма ограничена и не может полностью удовлетворить постоянно растущий спрос на ГК. К тому же поставки данного сырья могут носить сезонный или неравномерный характер. Данных недостатков лишен биотехнологический способ получения ГК, основанный на культивировании микроорганизмов-продуцентов ГК. Сырьем для получения полисахарида микробиологическим синтезом являются доступные соединения и компоненты: глюкоза, дрожжевой экстракт (ДЭ), минеральные соли и т. п. Производство ГК на основе микробиологического синтеза не зави сит от сезонных поставок животного сырья, а также легко масштабируется и перепрофилируется в случае изменения конъюнктуры рынка.
Выделение ГК из животного сырья часто осложняется тем, что в тканях и органах млекопитающих и птиц (например, в гребнях кур) биополимер находится в комплексе с белками, протеогликанами, и, кроме того, в животном сырье часто присутствуют родственные гликозаминогликаны [2]. Дешевые препараты косметического назначения для наружного применения могут содержать небольшое количество животных белков и других сопутствующих биополимеров, но содержание белков в препаратах ГК медицинского назначения недопустимо. Получение ГК микробиологическим синтезом вследствие отсутствия в культуральной жидкости (КЖ) примесных гликозаминогликанов и связанных с ГК белков предусматривает относительно легкую и недорогую очистку, поэтому препараты "биотехнологической" ГК отличаются более высокими показателями качества (чистотой, а иногда и молекулярной массой), а также меньшей себестоимостью. Биотехнологический способ позволяет получать ГК с заранее известными характеристиками и показателями качества, поскольку возможности контроля технологических параметров при данном методе производства существенно шире. В то же время при традиционном получении ГК следует учитывать зависимость содержания биополимера и его молекулярной массы от возраста животного, его здоровья и даже сезонного времени забоя [3].
Помимо вышеперечисленного использование биологических соединений животного происхождения или препаратов, выделяемых из человеческих тканей, в терапии заболеваний человека приобретает все большее число противников. Кроме возникающих этических проблем существует риск инфицирования неспецифическими к определенному хозяину вирусами (вирус птичьего гриппа) и другими инфекционными агентами. Этого недостатка лишено применение ГК, полученной биотехнологическим способом и прошедшей требуемую очистку.
В силу данных причин можно спрогнозировать, что биотехнологическое производство постепенно будет вытеснять получение ГК методом традицион ной экстракции из животного сырья. Следует отметить, что в настоящее время биотехнологическое производство ГК в России отсутствует. Отечественная ГК представлена препаратами, полученными экстракцией из гребней кур, а объем производимой ГК не удовлетворяет внутреннему спросу, что приводит к зависимости от импорта биополимера. Поэтому исследование процессов синтеза и деградации ГК микроорганизмами может лечь в основу создания биотехнологического производства ГК в России.
В последнее время появляется все больше сведений о размероспецифично-сти биологических функций и свойств ГК [4-9]: препараты ГК различной молекулярной массы стимулируют ангиогенез или проявляют антиангиогенные и противовоспалительные свойства, обладают иммуномодулирующими и антиок-сидантными свойствами. Полисахарид, фракционированный по молекулярной массе, может найти разнообразное применение в медицине и косметологии, поэтому работы по совершенствованию методов получения ГК и препаратов ее отдельных фракций с заданной молекулярной массой имеют большое научное и практическое значение.
Цель исследований. Изучить физиологические и биохимические аспекты метаболизма (биосинтеза и деградации) ГК бактериями p. Streptococcus, а также разработать научные основы управляемого культивирования и оптимизировать процесс микробиологического синтеза ГК штаммом-продуцентом, подобрав питательную среду, физико-химические условия и режимы культивирования. Исследовать процесс ферментативной деполимеризации ГК стрептококковыми гиалуронатлиазами для получения фракций полисахарида с заданной молекулярной массой и анализа ГК в биопробах сложного состава.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи;
1. Методом индуцированного мутагенеза получить высокопроизводительный штамм-продуцент ГК.
2. Произвести выбор среды для культивирования штамма-продуцента ГК, оптимизировать состав среды и физико-химические условия культивирования с целью увеличения выхода ГК.
3. Исследовать связь синтеза ГК с физиологическим состоянием культуры микроорганизмов и выявить возможные механизмы регуляции синтеза ГК. Изучить влияние степени аэрации ферментационной среды на биосинтез ГК.
4. Провести сравнительные реологические исследования растворов коммерческих препаратов и полученных образцов ГК. Определить молекулярную массу образцов ГК.
5. Исследовать кинетику деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиа-зой. Разработать метод получения препаратов ГК различной молекулярной массы, подобрав оптимальные условия проведения деполимеризации как для получения ГК низкой молекулярной массы, так и для осуществления полного гидролиза ГК.
6. Разработать метод определения концентрации ГК в сложных многокомпонентных смесях и биологических объектах, включающих разнообразные сопутствующие биополимеры, используя специфичность энзиматической деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой.
Научная новизна работы.
1. Установлено, что потеря капсул, состоящих из ГК, штаммом Streptococcus equi subsp. zooepidemicus В-8014 на поздней экспоненциальной и стационарной фазах культивирования происходит вследствие проявления штаммом гиалуро-натлиазной активности. Этим же объясняется снижение концентрации ГК в культуральной жидкости (КЖ) и "немукоидный" характер колоний, формируемых штаммом на агаризованной среде. УФ-индуцированным мутагенезом получен штамм S. equi subsp. zooepidemicus КБ-04, характеризующийся стабильностью формируемых капсул и мукоидной морфологией колоний.
2. Выявлено влияние основных компонентов предложенной питательной среды (источника углерода, азота, фосфора, солей органических и неорганических кислот) на биосинтез ГК. Обнаружено, что наибольшее отрицательное влияние на биосинтез ГК бактериями S. equi subsp. zooepidemicus оказывают ионы Mg2+.
Показано, что улучшение аэрации ферментационной среды способствует увеличению удельного выхода ГК, что связано, по-видимому, с окислением из быточных восстановительных эквивалентов НАДНг, образующихся в процессе биосинтеза ГК и затрудняющих ее дальнейший синтез, а также нарушающих окислительно-восстановительный баланс молочнокислого брожения. 4. Исследована кинетика деградации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой и показано, что незавершенность реакции деполимеризации обусловлена необратимой инактивацией стрептококковой гиалуронатлиазы, которая вызвана частичным автопротеолизом фермента. Предложен способ получения препаратов ГК различной молекулярной массы, используя метод ферментативной деполимеризации ГК. Предложен и обоснован вискозиметрический метод контроля процесса деполимеризации ГК. Разработан метод определения ГК в сложных биологических образцах, содержащих мешающие примесные биополимеры со сходной с ГК структурой, основанный на ВЭЖХ продуктов энзиматической деградации ГК.
Практическая значимость работы.
1. Впервые в России методом микробиологического синтеза получены препараты ГК. В качестве продуцентов биополимера использовались бактерии р. Streptococcus, обладающие естественной способностью к биосинтезу данного гликозаминогликана. Штамм S. equi subsp. zooepidemicus КБ-04, полученный УФ-индуцированным мутагенезом родительского штамма 5". equi subsp. zooepidemicus В-8014, характеризуется стабильностью образуемых капсул на всем протяжении культивирования. Концентрация ГК в КЖ S. equi subsp. zooepidemicus КБ-04 превышает концентрацию, достигаемую при культивировании штамма S. equi subsp. zooepidemicus В-8014 в аналогичных условиях, в 3 - 5 раз. Оптимизация состава питательной среды, физико-химических условий и режимов культивирования позволила многократно увеличить выход ГК.
2. Исследование кинетики деградации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой позволило предложить схему проведения ферментативной реакции, позволяющую добиться практически полной деполимеризации ГК, что, в свою очередь, позволило разработать метод определения концентрации ГК в сложных многокомпонентных смесях и биологических объектах, включающих разнообразные мешающие биополимеры, используя специфичность энзиматической деполимеризации ГК.
3. Методом энзиматической деполимеризации получены препараты ГК различной молекулярной массы. Показано, что вискозиметрия может использоваться для наблюдения за ходом расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой, поскольку падение вязкости растворов и уменьшение молекулярной массы ГК хорошо коррелируют.
История открытия ГК и основные этапы ее изучения
Первое упоминание о необычном полисахариде как о выделенном и охарактеризованном новом биополимере было сделано в работе Karl Meyer и John Palmer, опубликованной в Journal of Biological Chemistry в 1934 г. [10]. Из стекловидного тела бычьего глаза они выделили кислый полисахарид с крайне высокой молекулярной массой. И именно они предложили название гиалуроновая кислота (hyaluronic acid от hyaloid - стекловидный и uronic acid - уроновая кислота). По их мнению, полисахарид содержал шестиуглеродные уроновую кислоту и аминосахар, а также пентозу, не был сульфирован, и молекулярная масса повторяющегося остатка составляла примерно 450 г/моль. Действительно, ГК, как оказалось, не содержит сульфатных групп, так же как, впрочем, и пентоз, а молекулярная масса повторяющегося дисахаридного остатка равна 397 г/моль; в состав повторяющегося участка входит D-глюкуроновая кислота и N-ацетилированный D-глюкозамин.
Но лишь через 20 лет после выхода этой работы (несмотря на неподдельный интерес, выказанный к тому времени во всем мире к гликозаминоглика-нам) полная структура и мономерный состав ГК были окончательно установлены. Решение проблемы было связано, в первую очередь, с исследованием действия на ГК бактериальных гиалуронатлиаз и тестикулярных гиалуронидаз, а также с дальнейшим развитием гликобиологии. Тот же Meyer опубликовал в Nature в 1954 г. результаты исследования продуктов расщепления ГК [11], в статье также приводилась структурная формула дисахарида, являющегося продуктом расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой (рис. 1.1).
На протяжении всего времени, прошедшего с момента открытия, интерес к ГК в научном мире не ослабевал. Об этом свидетельствует, например, частота цитируемости или количество публикаций, посвященных структуре, синтезу, деградации, биологической роли ГК и ее применению в медицине и косметологии. Вот данные только по англоязычным работам, приводимым в обзорах MedLine: 790 статей опубликовано с 1966 по 1975; 2200 - с 1976 по 1985; около 3300 - с 1986 по 1996 [12]; около 7000 - с 1996 по 2006 гг. (собственные данные).
В течение второй половины XX века ГК была обнаружена во многих тканях и жидкостях позвоночных животных, включая человека [13], и стала применяться в разнообразных клинических приложениях, из которых наиболее значимыми являются глазная хирургия, лечение суставных заболеваний и использование ГК в инъекциях вакцин и в некоторых других лекарственных препаратах. Широкое применение ГК нашла в косметологии. В связи с этим спрос на полисахарид неуклонно растет с момента открытия вплоть до настоящего времени. Одновременно с расширяющимся применением в медицине и косметологии происходит постепенная переоценка роли ГК как пассивного структурного компонента матрикса соединительной ткани к пониманию первостепенной роли этой макромолекулы во многих динамических жизненно важных процессах от клеточной коммуникации, миграции и дифференциации до регуляции организации клеточного матрикса и метаболизма. Теперь ясно, что ГК не просто пассивная матрица соединительной ткани, а метаболически высокоактивный биополимер. Время полужизни молекулы ГК составляет от 1 - 30 недель в суставах, до менее недели в эпидермисе и всего 2-5 минут в кровотоке [14]. Иными словами, за сутки в организме 70 килограммового взрослого человека распадается и синтезируется 5 г ГК по сухому весу, что составляет одну треть всей ГК индивидуума [15]. Крайне важная роль, которую, по-видимому, играет ГК в организме человека, определяет все больший научный интерес к изучению уникальных свойств и новых перспективных способов получения ГК.
Уже отмечалось, что ГК была открыта как животный полисахарид, однако вскоре выяснилось, что биополимер распространен и среди бактерий. Kendall, Heidelberger и Dawson в 1937 г. сообщили о выделении из культуральной жидкости (КЖ) гемолитического стрептококка полисахарида, осаждающегося уксусной кислотой и этиловым спиртом [16]. Авторы предположили идентичность выделенного биополимера и ГК, что в дальнейшем полностью подтвердилось. Спустя некоторое время ряд других авторов при работе с разнообразными культурами стрептококков опубликовали похожие данные о выделении ГК [17, 18]. Стало очевидно, что этот гликозаминогликан млекопитающих распространен среди некоторых групп стрептококков, многие из которых являются патогенными или условно патогенны для человека и животных.
Материалы
Глубинное культивирование штамма-продуцента ГК S. zooepidemicus осуществляли (а) в стеклянных колбах без отбойников на 100 мл с ватно-марлевыми пробками на качалке "New Brunswick" G10 при скорости вращения платформы 100 - 150 об/мин и температуре 37 С. Аэрацию регулировали степенью заполнения колб питательной средой (объем среды в колбах варьировался от 5 до 70 мл), (б) В лабораторном биореакторе на 10 л с обечайкой из стекла, (в) в лабораторном биореакторе на 1,5 л с обечайкой из стекла. Культивирование в ферментерах осуществляли при температуре 37 С с автоматическим контролем рН среды подачей стерильного 10 % раствора NaOH при помощи автоматической системы, состоящей из рН-метра (рН-121) и блока автоматического титрования (БАТ-3). Расход подаваемого воздуха варьировал от 0,1 до 1,0 об/(об мин).
Для культивирования применяли различные среды: МПБ, L-бульон, модифицированная среда MRS [265]. При культивировании в ферментере добавлялся пеногаситель - структол (0,02 % от рабочего объема). Стерилизация питательной среды в колбах осуществлялась автоклавированием при 0,5 ати в течение 30 мин, стерилизация ферментеров с питательной средой - автоклавированием при 1 ати в течение 30 мин, источник углерода всегда стерилизовался отдельно при 0,5 ати в течение 30 мин и в стерильных условиях вносился в питательную среду после ее охлаждения. Объем посевного материала культуры, находящейся в конце экспоненциальной фазы роста, составлял 5 % от объема среды. Длительность культивирования составляла 24 - 48 ч в зависимости от целей эксперимента.
Поверхностное культивирование осуществлялось на матрацах и чашках Петри с агаризованной питательной средой в воздушном термостате при 37 С.
Условия проведения энзиматической деполимеризации ГК. Ферментативную реакцию деполимеризации ГК, если не указано особо, проводили следующим образом. Гиалуронат натрия в количестве, учитывающем необходимое содержание ГК, растворяли при температуре 80 С в 0,05 М ацетатном буфере рН 5,5 с содержанием 10 мМ СаС12 -6Н20 и 14,5 мМ NaCl в конечном растворе. Охлаждали до 38 С и добавляли фермент в виде раствора в том же ацетатном буфере до содержания белка 0,008 или 0,08 мг/мл в конечном растворе. За ходом реакции следили 1-24 часа с помощью вискозиметриче-ской, спектроскопической и хроматографической техник. Для завершения ферментативной реакции пробы нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 мин.
Выбор объекта исследования
ГК находит все более широкое применение в составе различных медицинских и косметических препаратов (см. обзор литературы). Прогресс в понимании биологических функций данного гликозаминогликана привел и, безусловно, еще приведет к дальнейшему увеличению спроса на биополимер. Недостатки традиционного способа получения ГК экстракцией из животных и человеческих тканей, которые уже упоминались во введении, невозможность удовлетворить растущие потребности рынка, высокая стоимость ГК стимулируют развитие микробиологического или биотехнологического способа получения ГК, заставляя искать или создавать новые перспективные штаммы продуцентов, исследовать физиологические, биохимические и генетические аспекты синтеза ГК, а также оптимизировать процесс культивирования: состав сред, физико-химические условия и режимы культивирования.
Поскольку большинство микроорганизмов, обладающих способностью синтезировать ГК, является патогенами позвоночных животных, в качестве объекта исследований необходимо выбрать штамм, который, с одной стороны, будет обладать всеми закономерностями, присущими продуцентам ГК, а, с другой стороны, будет отвечать возможности осуществления требований безопасности при работе с ним. На настоящий момент одними из самых распространенных продуцентов ГК, в том числе и при промышленном получении биополимера, являются штаммы Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (S. zooepidemicus). Вид S. zooepidemicus относится к стрептококкам группы С по серологической классификации Lancefield, которые в отличие от стрептококков групп А и В в норме не вызывают заболеваний у человека, а являются представителями оппортунистической микрофлоры кожи и слизистых оболочек сельскохозяйственных животных, лишь в некоторых случаях вызывающей воспалительные процессы, маститы, нагноения [95, 97, 276]. Штамм S. zooepidemicus В- 8014 (АТСС 39920) из коллекции ВКПМ ФГУП "ГосНИИгенетика" был получен путем мутагенеза, индуцированного нитрозогуанидином, и последующей селекции и многократных пассажей на твердой питательной среде. S. zooepidemicus штамм В-8014 не проявляет гемолитической активности, являясь атте-нуированным штаммом S. zooepidemicus - продуцентом высокомолекулярной ГК. Также штамм характеризуется хорошим ростом на твердых питательных средах и в глубинных культурах. По литературным сведениям [277] капсулы, образуемые S. zooepidemicus, содержат единственный полисахарид - ГК, что существенно облегчает выделение и очистку биополимера, а также определение содержания полимера в КЖ.
