Введение к работе
Актуальность проблемы
Поиск компонентов питательных сред, ускоряющих рост бактерий - продуцентов биомассы и внеклеточных метаболитов - актуальная задача биотехнологии. Перспективными для управления метаболическими процессами у бактерий являются ауторегуляторные вещества, относящиеся по химической природе к свободным жирным кислотам (ЖК) и выполняющие регуляторную функцию по поддержанию жидкостности клеточных мембран (Светличный В.А. и др., 1983; Бабусенко Е.С. и др., 1991). ЖК с длиной цепи от Сі4 до Сго представляют собой уникальные природные вещества, которые в составе липидов являются структурными компонентами клеточных мембран, выполняют энергетические и регуляторные функции. Кроме этого, свободные ЖК обладают разнообразной биологической активностью и прежде всего - антимикробной (активны против вирусов, бактерий, грибов, водорослей, простейших) и цитотоксической (Nieman С. 1954, Desbois А.Р. et al., 2010).
Благодаря своей бактерицидной активности свободные ЖК являются компонентами врожденного неспецифического иммунитета и присутствуют на коже, в грудном молоке и кровотоке человека и животных (Nicolaides N., 1974), где выполняют защитные функции. В концентрациях, не вызывающих цитотоксического действия, ЖК, например олеиновая, разрушают клеточные стенки и приводят к гибели таких патогенов, как стрептококки и стафилококки (Chen С.Н. et al., 2011). Использование ЖК рассматривают в качестве элемента новой антимикробной стратегии как альтернативу традиционным антибиотикам, применение которых часто приводит к формированию лекарственной устойчивости у патогенных бактерий (Huang СМ. et al., 2011).
Наличие свободных жирных кислот в составе модельных мембран, состоящих из 1,2-диэлаидоил-5и-глицеро-3-фосфоэтаноламина и ЖК, способствуют образованию участков небислойной обращенной гексагональной структуры наряду с ламеллярной в широком интервале температур. Молекула жирной кислоты встраивается в мембрану, образует водородные связи с молекулами воды и соседними аминогруппами молекул фосфатидилэтаноламина и влияет на свойства бислоя (Cordomi A. et al., 2010).
Список сокращений: БКЖ - бесклеточная культуральная жидкость; ВБ -высушенная биомасса; ДФГ - 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен; ЖК - жирные кислоты; КОЕ - колониеобразующие единицы; МЭЖК - метиловые эфиры жирных кислот; ОК -олеиновая кислота; OD - оптическая плотность; СК - стеариновая кислота; ФЛ -фосфолипиды; ЭПС - экзополисахарид.
Способность свободных жирных кислот влиять на структуру биологических мембран используется в новом направлении фармакологии - мембрано-липидной терапии. Так, олеиновая кислота (ОК), увеличивая отрицательную кривизну мембраны, активирует ряд важных белков, способных ингибировать клеточную пролиферацию и индуцировать апоптоз: G-белков, протеинкиназы С, белков теплового шока. Возможно, этот механизм объясняет ускорение роста бактерий - лактобацилл, коринебактерий (Corcoran В.М. et al., 2007), а также индукцию реактивации покоящихся форм микобактерий в присутствии олеиновой кислоты (Назарова Е.В. и др., 2011). Однако, несмотря на большой научный интерес к функциям свободных ЖК в последнее время, механизм их биологической активности изучен не достаточно.
Перспективной моделью для такого рода исследований являются метилотрофные бактерии, не использующие ЖК в качестве субстрата. Работа с такими моделями исключает вероятность стимулирования роста за счет возможности метаболизировать ЖК. Многие облигатные метилотрофные бактерии, использующие в качестве единственного источника углерода доступный метанол, характеризуются способностью секретировать внеклеточные полисахариды или экзополисахариды (ЭПС) и являются перспективными продуцентами биомассы и ЭПС (Schrader J. et al., 2009; Троценко Ю.А. и др., 2010). Бактериальные ЭПС - биополимеры, обладающие уникальными реологическими свойствами, эмульгирующей активностью и способностью формировать гели. Сферы применения микробных экзополисахаридов чрезвычайно разнообразны: нефте- и горнодобывающая, текстильная, пищевая, фармацевтическая, химическая промышленности и медицина. Потребность в этих полимерах постоянно растет, однако спрос на них удовлетворяется не полностью.
Цели и задачи работы
Изучение влияния экзогенных жирных кислот на выход биомассы и повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quay lei, а также оптимизация условий его получения и выделения.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
- исследование влияния экзогенных ЖК и их метиловых эфиров на рост и
продукцию внеклеточного полисахарида М. quaylei;
- фракционирование клеточных липидов из биомассы, полученной в присутствии
олеиновой кислоты и стеариновой кислоты (СК), а также определение жирнокислотного
состава фракций свободных ЖК и фосфолипидов;
- исследование физико-химических свойств интактных клеток М. quaylei,
выращенных в стандартных условиях и в присутствии экзогенной ОК - величины С,-
потенциала (методом электрофоретического рассеяния) и текучести мембран (по величинам анизотропии флуоресценции с использованием в качестве гидрофобного зонда 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена(ДФГ);
- оптимизация условий биосинтеза, методы выделения и очистки ЭПС, изучение
углеводного и фракционного состава ЭПС М. quaylei;
- изучение реологических и эмульгирующих свойств растворов и эмульсий,
содержащих ЭПС.
Научная новизна работы
Обнаружено ускорение роста и увеличение уровня секреции внеклеточного полисахарида облигатной метилотрофной бактерии М. quaylei в присутствии жирных кислот Ci2-Ci8 и их метиловых эфиров, экзогенно добавленных в питательную среду. Наилучшим ростовым фактором оказался олеат натрия. На основании данных о составе фракции свободных жирных кислот в клетках, величин ^-потенциала и анизотропии флуоресценции целых клеток высказано предположение о включении жирных кислот в наружную мембрану бактерии М. quaylei.
Оптимизирован состав среды культивирования М. quaylei для повышения продукции экзополисахарида (отношение C/N, концентрации фосфатов и хлорида кальция). Отработаны условия выделения, определены углеводный и фракционный состав экзополисахарида М. quaylei. Изучены эмульгирующие и реологические свойства ЭПС в составе косметических композиций.
Практическая значимость работы
В результате проведенных исследований с использованием в качестве ростовых факторов экзогенных жирных кислот и их метиловых эфиров удалось повысить выход биомассы и ЭПС М. quaylei более чем в 2 и 1,5 раза соответственно. Разработаны две альтернативные схемы выделения внеклеточного полисахарида. Было показано, что ЭПС М. quaylei является повышающим вязкость водных растворов компонентом, обладает эмульгирующей активностью и является стабилизатором эмульсий типа «масло/вода» и по реологическим свойствам не уступает ксантану и другим полимерам, использующимся в косметических и фармацевтических композициях.
Основные положения, выносимые на защиту
Ускорение роста и продукции внеклеточного полисахарида М. quaylei в присутствии экзогенных ЖК и их метиловых эфиров. Использование олеата натрия в качестве ростового фактораМ quaylei.
Ряд гидрофобных добавок по способности стимулировать рост бактерии М. quaylei:
Сі8:1>Сі8:0>Сіб:0>МЄТИЛОЛЄаТ>МЄТИЛСТЄараТ>беЗ ДОбаВОК>Сі4:0>Сі2:0-
3. Механизм взаимодействия экзогенных ЖК с клетками М. quaylei путем включения их в состав наружной мембраны и изменения физико-химических свойств поверхности клетки, а также свойств липидного бислоя.
5. Углеводный состав ЭПС М. quaylei: остатки D-глюкозы, L-рамнозы и D-галактозы в
соотношении 5:2:1, фракционный состав: основная фракция (70%) ЭПС имеет
С 1-І о
молекулярную массу от 6.8-10 до 7.9-10 г/моль, а высокомолекулярная (13%) - 2.6-10 .
6. Внеклеточный полисахарид М. quaylei образует вязкие псевдопластичные растворы с
тиксотропными свойствами и обладает эмульгирующей активностью и стабилизирует
эмульсии типа «масло/вода».
Апробация работы Основные положения диссертационной работы докладывались на IV и VI Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007 и 2011 гг).
Публикации
По материалам диссертационной работы опубликовано 3 оригинальные статьи, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, а также 2 тезисов на международных конференциях.
Структура и объем работы Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждении результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 166 источника. Работа содержит 45 рисунков и 9 таблиц.
Работа поддержана грантом № 3.1.1/9247 АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы».
