Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Применение дейтерированных соединений и методы их получения 8
1.1.1. Применение дейтерированных соединений 8
1.1.2. Методы получения дейтерированных БАС 11
1.2.Влияние оксида дейтерия на рост, биохимию и физиологию микроорганизмов 13
1.2.1. Сравнительный анализ физико-химических свойств ' НгО и 2НгО 13
1.2.2. Влияние НгО на рост и морфологию микроорганизмов, феномен клеточной адаптации к 2НгО 15
1.2.3. Влияние НгО на скорость ферментативных реакций и метаболизм углерода 18
1.2.4. Влияние 2НгО на метаболизм нуклеиновых кислот, экспрессию генов и генетический контроль 19
1.2.5. Влияние НгО на физиологию микроорганизмов 20
1.3. Связь клеточного ответа на НгО и другие стрессовые факторы 20
1.3.1. Перекрестная адаптация к стрессам у микроорганизмов 21
1.3.2. Участие экзометаболитов (внеклеточных факторов) в адаптации клетки к стрессам 22
1.4. Метилотрофные бактерии как объекты изотопной биотехнологии 23
1.4.1 Основные свойства метилотрофных бактерий 24
1.4.1.1. Особенности метилотрофных бактерий 24
1.4.1.2. Характеристика первого и ключевого фермента ассимиляции метанола у ^. метилотрофных бактерии - метанолдегидрогеназы 24
1.4.2. Биотехнологический потенциал метилотрофных бактерий 28
1.4.2.1. Экзополисахариды метилотрофных бактерий 29
1.4.4.2. Генетическое исследование метилотрофных бактерий 30
1.4.3. Получение дейтерированных БАС с использованием метилотрофных бактерий.,31
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 35
2.1. Влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на кинетику роста облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741 35
2.1.1. Определение кинетических параметров роста Methylophilus sp. В-7741 в средах различного изотопного состава 36
2.1.2. Влияние содержания дейтерометанола в субстрате на рост Methylophilus sp. В-7741 42
2.1.3. Влияние ступенчатой адаптации бактерий Methylophilus sp. В-7741 к 2Н20-
содержащим средам на продолжительность лаг-фазы, цтах иУ^ 42
2.1.4. Определение оптимальных условий - температуры и рН (р2Н) - для
роста бактерий Methylophilus sp. В-7741 в дейтерированных средах 45
2.2. Оксид дейтерия как стрессовый фактор у Methylophilus sp. В-7741 47
2.2.1. Влияние условий выращивания посевного материала на параметры роста в дейтерированной среде 47
2.2.2. Определение активности каталазы в клетках, выращенных в обычной и дейтерированной среде 50.
2.2.3. Изучение биологического действия дейтерированной бесклеточной жидкости на рост Methylophilus sp. В-7741 в дейтерированной среде 54
2.3. Влияние дейтерирования на активность МДГ Methylophilus sp. В-7741 56
2.3.1. Активность МДГ в экстракте 'Н и 2Н-биомассы Methylophilus sp. В-7741 59
2.3.2. Изучение изотопного эффекта субстрата в реакции, катализируемой
МДГ Methylophilus sp. В-7741 60
2.3.3. Изучение изотопного эффекта растворителя в реакции, катализируемой МДГ Methylophilus sp. В-7741 61
2.3.4. Изучение влияния рН на активность МДГ в экстракте Н и Н-биомассы Methylophilus sp. В-7741 62
2.4. Влияние дейтерия на биосинтез ЭПС у Methylophilus sp. В-7741 62
2.4.1. Влияние питательных сред с разными уровнями содержания
дейтерия на биосинтез ЭПС 63
2.4.2. Влияние температуры и рН на биосинтез ЭПС в *Н- и 2Н-среде 64.
2.5. Исследование углеводного состава ЭПС и определение степени ' включения дейтерия в ЭПС 68
2.5.1. Выделение и очистка ЭПС Methylophilus sp. В-7741 68
2.5.2. Гидролиз ЭПС Methylophilus sp. В-7741 и определение углеводного состава гидролизата хроматографическими методами 70
2.5.3. Изучение углеводного состава гидролизата ЭПС
Methylophilus sp. В-7741 методом 'Н и 13С-ЯМР спектроскопии 72
2.5.4. Определение степени включения дейтерия в ЭПС при выращивании
Methylophilus sp. В-7741 в максимально дейтерированной среде 72
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 76
3.1. Материалы 76
3.1.1. Микробиологический объект 76
3.1.2. Реагенты 76
3.1.3. Приборы 77
3.1.4. Питательные среды для культивирования Methylophilus sp. В-7741 77
3.2. Методы 77
3.2.1. Культивирование бактерий Methylophilus sp. В-7741 78
3.2.2. Ступенчатая адаптация бактерий Methylophilus sp. В-7741 к средам, приготовленным на основе 2НгО 79
3.2.3. Приготовление посевного материала, адаптированного к осмотическому и окислительному стрессу 79
3.2.4. Определение ростовых параметров 80
3.2.5. Получение бесклеточных КЖ 80
3.2.6. Определение концентрации экзополисахарида 80
3.2.7. Приготовление клеточного экстракта из Н- и Н-биомассы 81
3.2.8. Определение содержания белка в клеточных экстрактах по методу Лоури 81
3.2.9. Определение активности каталазы 82
3.2.10. Определение активности МДГ 82
3.2.11. Частичный гидролиз в 0,1 нТФУ 82
3.2.12. Полный гидролиз в 2 нТФУ 83
3.2.13. Получение 1,2,3,4,6-пента-0-ацетил-р-Б-глюкопиранозы 83
3.2.14. Ацетилирование гидролизата дейтерированного ЭПС 83
3.2.14. Анализ состава гидролизатов методом ТСХ, БХ, и ВЭЖХ 84
ВЫВОДЫ 85
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 86
- Применение дейтерированных соединений и методы их получения
- Влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на кинетику роста облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741
- Материалы
Введение к работе
Широкое применение биологически активных соединений (БАС), меченных стабильными изотопами, в частности дейтерием, в структурных и фармакокинетических исследованиях обусловило необходимость поиска новых подходов к их получению. В последние годы особое внимание уделяется разработке методов биосинтетического получения стабильномеченых БАС.
Метилотрофные бактерии являются перспективным источником различных классов стабильномеченых БАС. Перспективность метилотрофов как продуцентов дейтерированной биомассы, аминокислот, жирных кислот, экзополисахаридов и других соединений обусловлена тем, что в качестве единственного источника углерода такие бактерии способны использовать С і-соединения, например, метанол. Это делает процесс культивирования более технологичным и позволяет получить необходимые БАС с высокой степенью включения дейтерия.
Важной проблемой биосинтеза дейтерированных соединений является токсичность дейтерированной воды как одного из основных источников дейтерия. Целый ряд вопросов, которые касаются практического использования различных штаммов-продуцентов БАС для роста и биосинтеза целевых продуктов в высокодейтерированных средах, остаются до конца невыясненными из-за сложности их адаптации к оксиду дейтерия. Решение этой проблемы позволит резко увеличить возможности биосинтетического метода получения дейтерированных БАС.
Механизм и закономерности процесса адаптации и роста бактерий, в том числе метилотрофных, в высокодейтерированных средах (средах с высокими концентрациями оксида дейтерия и дейтерометанолом) не вполне понятны, хотя биологические эффекты дейтерия подробно изучались. В связи с этим, изучение биохимических и физиологических особенностей роста и биосинтеза в тяжелой воде у микроорганизмов продолжает быть актуальной задачей как для получения различных дейтерированных соединений, так и в плане изучения биологически важного феномена адаптации к оксиду дейтерия.
Многие метилотрофные бактерии характеризуются способностью секретировать внеклеточные полисахариды (ЭПС). Дейтерированные ЭПС, полученные при культивировании этих микроорганизмов в высокодейтерированной среде, являются источниками дейтерированных углеводов, используемых в настоящее время как в качестве источника углерода для выращивания гетеротрофных микроорганизмов- продуцентов дейтерированных БАС, так и прямо в различных биомедицинских исследованиях.
Цель работы JP*- Целью настоящей работы было изучение особенностей роста метилотрофных бактерий и биосинтеза ЭПС при замене метанола на дейтерометанол и воды на оксид дейтерия в культуральной среде с использованием в качестве модели новых облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741.
Этапы исследования включали:
1 - Изучение влияния дейтерометанола и оксида дейтерия на ростовые характеристики облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741.
2 - Изучение возможности перекрестной адаптации к дейтерированной среде и другим W', стрессам - осмотическому и окислительному, а также изучение возможности участия внеклеточных факторов в процессе адаптации к дейтерированной среде.
3 - Изучение влияния дейтерирования на активность МДГ Methylophilus sp. В-7741. - Изучение дейтерирования ростовой среды на биосинтез ЭПС у Methylophilus sp. В-7741. - Выделение и изучение углеводного состава ЭПС; определение степени включения дейтерия в этот биополимер при максимальном дейтерировании ростовой среды.
Применение дейтерированных соединений и методы их получения
Применение дейтерированных БАС в биомедицинских и фармацевтических исследованиях. Дейтерированные органические вещества можно детектировать с большой точностью с помощью масс-спектрометрии, ЯМР, и других изотопно-чувствительных методов. Кроме того, чувствительность детектирования дейтерированных веществ гораздо выше по сравнению с детектированием веществ, меченных другими стабильными изотопами, такими как Си N [1]. Известно, что дейтерированные БАС обладают крайне низкой токсичностью (особенно по сравнению с веществами с радиоактивной меткой), поэтому дейтерированные вещества очень широко используются при изучении метаболизма питательных веществ, лекарств и токсичных соединений в организме человека и животных. Так, при изучении метаболизма глюкозы у дрожжей [2], серина и лейцина в организме человека [3], перлолирина в организме крысе [4] и флуорена в организме человека [5] были использованы дейтерированные аналоги этих БАС. Также при исследовании биосинтеза фосфатидилхолина у дрожжей были использованы дейтерированные аналоги метионина и холина [6]. Вегманн с соат. недавно разработали ряд тестов для исследования пищевой ценности N-ацетил-Ь-триптофана, используя дейтерированный L-триптофан и дейтерированный N-ацетил-Ь-триптофан [7].
Интересно, что дейтерированные формы лекарственных средств обладают иными фармакологическими свойствами по сравнению с недейтерированными формами. Вензел показал [8], что дейтерированные амфетамины проникают в головной мозг мышей и крыс быстрее, чем недейтерированные формы тех же веществ. Чаще всего изменение фармакологического действия лекарственного вещества происходит за счет изменения его метаболизма. Ключевым этапом во всех реакциях, катализируемых системой цитохрома Р450 печени, является разрыв С-Н-связи. Вещества, у которых С-Н-связь заменена на связь С- Н, обнаруживают большую устойчивость к расщеплению с помощью цитохрома Р450- Устойчивость подобных соединений к расщеплению может приводить к удлиннению времени фармакологического действия вещества.
Метаболические продукты превращения многих лекарств токсичны, дейтерирование может снизить эту токсичность, замедляя метаболические превращения этих веществ [9,10]. Некоторые дейтерированные антимикробные вещества менее подвержены расщеплению микроорганизмами, против которых они используются, следовательно, эти вещества более эффективны [11,12].
Недавно был представлен новый метод измерения пролиферации клеток путем мечения ДНК дейтероглюкозой [13]. Методика состоит в введении 2Н-глюкозы, выделении геномной ДНК, её энзиматическом гидролизе до свободных дезоксирибонуклеозидов с последующим их извлечением для анализа содержащих изотопы остатков А и/или G. Эта методика обладает многими преимуществами по сравнению с ранее используемыми методиками: в данной методике не используются радиоактивные компоненты, отсутствуют потенциально токсические метаболиты, она подходит для исследований на человеке. Этот новый метод был успешно применен для прямых измерений кинетики циркулирующих Т-клеток в нормальных и ВИЧ-1 инфицированных людях [14].
Применение дейтерированных БАС в структурных и динамических исследованиях биомолекул. Интенсивное развитие техники и методологии ЯМР за последние годы способствовало исследованию пространственной структуры белков и их динамики. В отличие от рентгеноструктурного анализа, для которого требуются довольно значительные количества вещества в виде кристаллов [15,16], что возможно не для всех белков, ЯМР в его различных вариантах может дать структурную информацию для белковых растворов [17] или других некристаллических форм. Благодаря технике двумерного преобразования Фурье [18] ЯМР спектроскопия успешно применяется для определения пространственной структуры сравнительно небольших белков с молекулярной массой до 10 кД [19]. Однако для белков с большей молекулярной массой интерпретация спектральных данных ЯМР усложняется значительным перекрыванием сигналов. Для того, чтобы повысить чувствительность метода целесообразным является обогащение белка стабильными изотопами за счет использования униформно меченых белков, например, дейтерием. Так, спектры !Н-ЯМР крупных белков значительно упрощаются для интерпретации, если атомы водорода замещены на дейтерий. Этот метод был успешно использован для структурных исследований тиоредоксина [20], рибонуклеазы HI [21], циклоспорина А при его связи с белком циклофилина [22], комплекса белка МБП с р-циклодекстрином [23], а также при изучении взаимодействия между тимидилатсинтетазой и 5-флуоро-2-дезоксиуридилатом [24], и между шапероном GroEL и циклофилином А [25].
По мере развития методов генетической и белковой инженерии становится все более актуальным определение конформационных изменений не только регуляторных белков, но и фрагментов молекул нуклеиновых кислот. Дейтерирование объекта помогает и в этих случаях. Так, применение компьютерной программы позволило установить конформацию 21-членной шпильки молекулы РНК
5 -r(AGCCCGCCUAAUGAGCGGGCU)-3 даже при условии неполной ее дейтерированности. При этом не возникало сложностей с преодолением перекрывания спектров [26]
Влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на кинетику роста облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741
Использование стабильномеченых БАС в структурных и биохимических исследованиях в настоящее время постепенно вытесняет использование радиоактивных меток. Это вызвано отсутствием радиоактивной опасности, а также интенсивным развитием изотопно-чувствительной аналитической техники, прежде всего спектроскопии ЯМР.
В последние годы особое внимание уделяется разработке метода биосинтетического получения БАС, меченных стабильными изотопами, в том числе дейтерием. Этот метод заключается в культивировании микроорганизмов, в частности метилотрофных бактерий, которые способны, ассимилируя наиболее доступные и дешевые стабильно-меченые ростовые субстраты, синтезировать целевые вещества. Однако среди всего многообразия метилотрофных бактерий лишь немногие из них нашли промышленное применение. Важной задачей, поэтому является поиск новых метилотрофных продуцентов, характеризующихся высокими скоростями роста и способностью адаптироваться к росту на высокодейтерированных средах.
Methylophilus sp. В-7741 - новая облигатная метилотрофная бактерия - была выделена нами из смешанной метанолутилизирующей культуры, содержащей также грамположительные бактерии. Она имеет неподвижные клетки палочковидной формы размером 0.3-0.4x0.6-0.7 мкм. На плотной среде она образует ровные круглые колонии размером 0,5-3 мм бело-кремовой окраски. Methylophilus sp. В-7741 аэробна, реализует рибулозомонофосфатный путь ассимиляции формальдегида, в жирно-кислотном составе преобладают пальмитиновая (Сіб:о) и пальмитовакценовая (Сіб:і) кислоты, основной фосфолипид фосфатидилэтаноламин, имеет грамотрицательный тип клеточной стенки. Не способна к фиксации атмосферного азота [153].
Биосинтетическое получение высокодейтерированных БАС возможно только путем культивирования микроорганизмов на средах с возможно более полной заменой протия на дейтерий как в воде (2НгО — вместо НгО), так и в составе всех ростовых субстратов, в частности - источника углерода [142,154-156]. Для культивирования метилотрофных бактерий используют дейтерометанол С2Нз02Н вместо обычного метанола СНзОН [156].
Определение кинетических параметров роста Methylophilus sp. В-7741 в средах различного изотопного состава
Несмотря на большой интерес к биологическим эффектам дейтерия [63, 64,154], в литературе нами не обнаружено систематического исследования влияния дейтерия в широком диапазоне концентраций субстрата на ростовые характеристики микроорганизмов, т.е. на максимальную скорость роста, сродство к ростовому субстрату и выход биомассы. Первым этапом нашего исследования было определение влияния полного замещения протия дейтерием в молекуле метанола и в воде на кинетику роста культуры и выход биомассы для неадаптированных клеток.
Концентрацию метанола (дейтерометанола) варьировали от 0,012 до 739,5 мМ. На рис. 8 представлены зависимости удельной скорости роста ju от концентрации метанола (дейтерометанола) в НгО, 2НгО и их смесях. В НгО удельная скорость роста достигает максимального значения//тах при 3-3,5 мМ метанола (дейтерометанола) (рис. 8) и далее не меняется вплоть до 24 мМ. Дальнейшее увеличение концентрации метанола в ростовой среде приводит к уменьшению скорости роста. Для ростовых сред, содержащих оксид дейтерия, отмеченная закономерность сохраняется, однако значения Птах достигаются при более низких концентрациях метанола (дейтерометанола).
Для математической обработки данных зависимости удельной скорости роста от концентрации субстрата (метанола или дейтерометанола) была выбрана следующая формула, хорошо отражающая наблюдаемое субстратное ингибирование [157]:
Материалы
В данной работе использовали культуру новых облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741, выделенных нами из смешанной культуры и депонированных в Российскую коллекцию промышленных микроорганизмов, ГНИИГенетика (коллекционный номер ВКПМ В-7741).
В работе использовали реактивы квалификации "х.ч." отечественного производства NaOH, Na2C03, C11SO4, ЫагНР04, ЫазСбН5х5,5Н20, (натрий лимоннокислый трехзамещенный), додецилсульфат натрия, KCN, NH4CI, H2SO4, СНзСООН, CH3COONa, NaN03, MgS04x7H20, СаС12, К2НР04, КН2Р04, FeS04x7H20, ZnS04x7H20, МпС12х4Н20, СоС12х6Н20, CuCl2x5H20, NiCl2x6H20, Na2Mo04.
Использовали растворители фирмы Химед (Россия): метанол (extra pure), н-бутанол, ацетонитрил, этилацетат, глицерин, анилинфталат квалификации х.ч.
Для приготовления твердых сред, использовали бактоагар (США).
В качестве источников стабильных изотопов использовали тяжелую воду 2Н20 (99.8% ат%2Н) и С2Н302Н (99.5% ат%2Н) - производства российского научно-исследовательского центра "Изотоп" (Россия).
Для определения активности МДГ использовали реактивы Трис (Fluka Biochemika), БСА (Calbiochem, San Diego), ФМС (Германия), ДХФИФ (Россия), Фолин-Чикальтеу (Merck-Германия).
Для определения концентрации ЭПС в КЖ, использовали антрон (Россия).
Для определения активность каталазы, использовали аптечный раствор перекиси водорода (3% об.). Системы растворителей для хроматографии, система А (для ТСХ) изопропанол-вода 17:3 об/об. система Б (для нисходящей БХ): этилацетат-пиридин-вода 2:1:2 об/об/об. система В (для ВЭЖХ): ацетонитрил-вода 85:15 об/об.
Стерилизацию сред проводили в стерилизаторе "ST-174" (Венгрия).
Удаление растворителей проводили на роторном испарителе "РВО - 64" (Чехо-Словакия) при 10 мм. рт. ст. и 30С.
Для измерения рН использовали лабораторный рН-метр "рН-340"(Россия).
Для осаждения бактериальной биомассы использовали центрифуги "Г -24"(ЧССР) и "MPW- 310" (Польша).
Изучение кинетики ферментативной реакции и исследование бактериального роста проводили с использованием спектрофотометра "BECKMAN DU-6" (США), также колориметра фотоэлектрического КФК-2МП (Россия).
Культивирование бактерий проводили в термостатируемом водой шейкере Labline (США) и в воздушном обогреваемо-охлаждаемом термостате "LP-125" (Венгрия).
Для дезинтегрирования биомассы применяли ультразвуковую баню «Sonorex» (Польша).
Изучение кинетики бактериального роста проводили с помощью биофотометра "Bonet-Maury-Jouan" (Франция).
Спектры ЯМР были получены на импульсном Фурье спектрометре "Bruker WM - 250" (ФРГ) с рабочей частотой 200 МГц и 32 МГц соответственно для Н- и ,3С-ЯМР.
