Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
Структурно-функциональные особенности организации плазмид биодеградации
1.1. Плазмиды биодеградации бактерий 11
1.2. Особенности организации катаболической плазмиды pJP4 Alcaligenes eutrophus JMP134 15
1.2.1. Особенности организации производных плазмиды pJP4 18
1.3. Другие плазмиды биодеградации ксенобиотиков 19
1.4. Трансмиссивные свойства плазмид биодеградации 24
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований
2.1. Объекты исследований 33
2.2. Идентификация штаммов 33
2.2.1. Идентификация штаммов по признакам морфологической, морфометрической, физиологической и биохимической дифференциации 33
2.2.2. Классификация бактерий по последовательности генов 16SpPHK 34
2.3. Рост культур в жидкой питательной среде и его учет 36
2.4. Определение количества хлорфеноксиуксусных кислот в культуральной жидкости 37
2.5. Идентификация продуктов метаболизма 2,4,5-Т 37
2.6. Выделение внехромосомных элементов геномов бактерий 38
2.7. Фракционирование препаратов ДНК в агарозном геле 39
2.8. Элиминация плазмид из клеток бактерий, индуцированная бромистым этидием 40
2.9. Фракционирование препаратов плазмидной ДНК методом гель фильтрации
2.10. Обработка препаратов плазмидной ДНК рестрикционными эндонуклеазами 41
2.11. Определение размеров фрагментов ДНК 41
2.12. Иммобилизация препаратов ДНК на мембранном фильтре 42
2.13. Получение препарата радиоактивной ДНК 42
2.14. Гибридизация препаратов ДНК на фильтре 43
2.15. Физико-химические свойства и область применения хлорфеноксиуксусных кислот (4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т) 43
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1. Морфологические, морфом етрические, физиологические и биохимические признаки штаммов IBRB-36 4CPA, IBRB-21SG, IBRB-22S и IBRB-2T 45
3.2. Филогенетическое положение штаммов IBRB-36 4СРА, IBRB- 59 21SG, IBRB-22S и IBRB-2T по данным секвенирования генов 16SpPHK
3.3. Динамика деградации хлорфеноксиуксусных кислот Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S в периодической культуре
3.4. Идентификация и структурно-функциональный анализ плазмид штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S
3.4.1. Получение сферопластов и выделение плазмид 70
3.4.2. Рестрикционное картирование плазмид рСНЗб 4СРА, рРА21 SG 74 и pSM22S
3.4.3. Локализация генетических детерминант катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот на плазмидах рСНЗб 4СРА, pPA21SG и pSM22S 81
3.5. Анализ процессов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот 86 штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S
3.6. Сравнительный анализ генов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S с плазмидои pJP4 штамма Alcaligenes eutrophus JMP134
Выводы 96
Список литературы 97
- Особенности организации катаболической плазмиды pJP4 Alcaligenes eutrophus JMP134
- Идентификация штаммов по признакам морфологической, морфометрической, физиологической и биохимической дифференциации
- Элиминация плазмид из клеток бактерий, индуцированная бромистым этидием
- Локализация генетических детерминант катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот на плазмидах рСНЗб 4СРА, pPA21SG и pSM22S
Введение к работе
Актуальность проблемы. Известно, что современная практическая деятельность человека сопровождается непрерывным поступлением в биосферу токсичных синтетических соединений, которые трудно включаются в элементарные циклы обмена углерода, азота, серы и фосфора. Среди этой многочисленной группы приоритетными глобальными загрязнителями являются хлорсодержащие органические производные. Они обнаруживаются во всех объектах живой и неживой природы: в атмосферных осадках, в океанах, в почвах заповедников, в водной биоте, их присутствие отмечено во многих организмах, населяющих планету [Woodwell et al., 1971].
Судьба хлорированных производных в окружающей среде определяется рядом физико-химических факторов, в частности, отмечено, что такие производные подвергаются реакциям фотохимического разложения. Однако большинство исследований указывает на то, что основная роль в их деградации принадлежит микроорганизмам.
Среди штаммов, способных к деградации ксенобиотиков, особое место занимают бактерии. Показано, что бактерии способны трансформировать или полностью утилизировать широкий спектр органических соединений, начиная от простейших углеводородов и заканчивая достаточно сложными химически стабильными молекулами.
Отмечено, что способности бактерий-деструкторов обусловлены большим разнообразием ферментных систем и генетической пластичностью, которой способствует наличие внехромосомных генетических элементов — плазмид. Плазмиды детерминируют фенотипы, обуславливающие индивидуальные преимущества клеток в определенных селективных условиях. Эти преимущества могут реализовываться также через возможности периодического переноса и рекомбинации плазмидных и хромосомных генов. Предполагается, что плазмиды и мобильные элементы играют фундаментальную роль в приобретении новых катаболических функций и, следовательно, в развитии катаболических путей, которые позволяют бактериям адаптироваться и конвертировать различные загрязнители в техносфере [Van der Meer et al., 1992]. Плазмиды, по-видимому, всегда выполняли центральную роль в создании конкурентного разнообразия, служащего материалом для естественного отбора. Такая роль заключалась в увеличении числа функций, которые могут выполнять как отдельные клетки, так и популяция в целом, в случае горизонтального генетического обмена.
В настоящее время плазмиды представляют большую ценность как материал для исследований молекулярной структуры и механизмов функционирования геномов современных прокариот. Они обладают несколькими достоинствами. Плазмиды имеют относительно небольшие размеры, а это означает, что манипулировать с ними in vitro гораздо проще, чем с хромосомами. Кроме того, обычно клетки-хозяева плазмид могут существовать и размножаться без них, поэтому можно выявить те свойства, которые плазмиды сообщают клетке. Поскольку такие, детерминируемые плазмидой функции, нередко могут быть использованы для скрининга, плазмиды делают возможным проведение многих молекулярно-генетических экспериментов. В этом контексте плазмиды биодеградации, или D-плазмиды, представляют собой прекрасную модель для изучения вопросов строения, функционирования и эволюции генов, вовлеченных в реакции живых систем на условия окружающей среды, а именно, на действие ксенобиотиков. Очевидным является то, что результаты таких исследований имеют не только фундаментальное, но и большое практическое значение, так как D-плазмиды и несущие их клетки можно использовать для создания штаммов-деструкторов нового поколения.
Основные направления молекулярных исследований в области биодеградации можно сформулировать следующим образом: выявление разнообразия плазмид штаммов-деструкторов; выяснение строения и молекулярно-генетических механизмов функционирования и эволюционирования модулей ассимиляции ксенобиотиков; разработка стратегии конструирования штаммов-деструкторов с заданными свойствами in vitro; разработка основ эффективного управляемого применения биодеструкторов в качестве действующих объектов биотехнологий конверсии ксенобиотиков как альтернатива методам удаления таких соединений в «безопасные» места.
Вместе с тем следует отметить, что к настоящему моменту известно всего лишь несколько видов бактерий-деструкторов, у которых полностью или частично описаны свойства внехромосомных элементов, контролирующих деградацию хлорированных ароматических соединений. Во многом закономерности их организации и функционирования остаются неизвестными. Цель и задачи исследования.
Цель настоящей работы — выявить молекулярно-генетические особенности организации новых плазмид штаммов-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот.
Задачи: идентифицировать новые плазмиды штаммов-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот; выявить особенности структуры плазмид, а именно, установить их размеры, сайты рестрикции для некоторых редкощепящих эндонуклеаз, провести сравнительный анализ плазмид с плазмидой pJP4 Alcaligenes eutrophus JMP134;
3. провести метаболический мониторинг свойств деструкторов, в ходе которого описать количественные и качественные характеристики конверсии молекул хлорфеноксиуксусных кислот;
4, локализовать генетические детерминанты катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот на плазмидах штаммов- деструкторов.
Объекты исследований. Объектами исследования служили природные штаммы, выделенные из почв, подвергавшихся длительному воздействию факторов нефтехимического производства.
Новизна исследований. Впервые показано, что штаммы-деструкторы Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S обладают плазмидами; указанные плазмиды получили следующие обозначения -рСНЗб 4СРА, pPA21SG и pSM22S. Построены рестрикционные карты плазмид рСНЗб 4СРА, pPA21SG, pSM22S и определены их размеры: длина плазмид составляет 5,4 т.п.н., 6,2 т.п.н. и 24,1 т.п.н., соответственно. Показано, что на плазмиде рСНЗб 4СРА и плазмиде pSM22S расположены гены катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот, В соответствии с этим плазмиды рСН36 4СРА и pSM22S были классифицированы как новые D-плазмиды бактерий. Обнаружено, что гены деградации хлорфеноксиуксусных кислот штамма Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG расположены вне плазмиды pPA21SG. Выявлено, что плазмиды рСНЗб 4СРА и pSM22S имеют существенные отличия от плазмиды pJP4 Alcaligenes eutrophas JMP134.
Установлено, что катаболизм 2,4,5-Т штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S происходит с образованием метилированных форм хлорфеноксиуксусных кислот и 2-гидрокси-2-гексендионовой кислоты.
Практическая значимость работы. Результаты настоящего исследования расширяют представления об особенностях организации молекулярно-генетических систем, контролирующих процессы конверсии ксенобиотиков в клетках прокариот. Полученные данные могут быть применены для создания новых штаммов-деструкторов с заданными свойствами, а также в разработках ресурсосберегающих технологий восстановления окружающей среды в сфере предприятий нефтехимического профиля.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались в ходе работы VIII-го Экологического конгресса (Корея, 2002), Первого конгресса европейских микробиологов (Словения, 2003), ХІХ-го Международного генетического конгресса (Австралия, 2003), конференции ELSO (Франция, 2004), 1-го Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), 111-го съезда биохимического общества (С.-Петербург, 2002), Международной конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий» (Оренбург, 2001), Международной конференции «Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина» (Пущи но, 2004), 4-го Международного семинара-презентации «Биотехнология 2000» (Пущино, 2000), 2-го Международного Семинара-школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Научные аспекты экологических проблем России» (Москва, 2001), 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), Ш-го съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), конференции «Молодые ученые Вол го-уральского региона на рубеже веков» (Уфа, 2001), XIV-й зимней молодежной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), 6-ой и 9-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2002, 2005).
Публикации. Результаты диссертации изложены в 16 печатных работах.
Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), изложения результатов и их обсуждения (глава 3), выводов, списка цитированной литературы, включающей 112 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 111 страницах, содержит 19 рисунков и 11 таблиц.
Гранты. Работа выполнена при поддержке ФЦНТП "Интеграция науки и высшего образования России" (Э0029), а также гранта РФФИ №02-04-97911.
Особенности организации катаболической плазмиды pJP4 Alcaligenes eutrophus JMP134
Плазмида pJP4 - катаболическая низкокопийная плазмида штамма Alcaligenes eutrophus JMP134 {Ralstonia eutropha JMP134) [Don, Pemberton, 1981]. На данной плазмиде были локализованы гены деградации 2,4-Д и 3-хлорбензола [Perkins et al., 1990; Perez-Pantoja et al., 2000, 2003]. Плазмида pJP4 кодирует устойчивость к хлориду ртути и фенилмеркурийацетату. При использовании приемов клонирования, мутагенеза транспозонами и анализа рестрикционными эндонуклеазами была создана физическая и генетическая карта pJP4 [Weightman et al., 1984; Don et al., 1985].
Было установлено, что на плазмиде pJP4 расположено несколько ключевых катаболических способностей, кодируемых tfd генами. По данным секвенирования полная последовательность pJP4 составляет 87688 нуклеотидов [Trefault et al., 2004]. I.S. You и D. Ghosal отмечали, что у Alcaligenes eutrophus плазмидные гены, специализированные на катаболизме 2,4-Д и 3-хлорбензола, организованы в 3 оперона: tfdA, tfdB и tfdCDEF. Предполагается, что регуляция этих оперонов осуществляется двумя несвязанными генами tfdR и tfdS. Анализ ДНК-последовательности выявил, что tfdR и tfdS гены идентичны и локализованы внутри инвертированной последовательности длиной 1592 п.н. Похожие структуры наблюдались и среди других плазмид, детерминирующих конверсию 2,4-Д. Ген tfdR имеет длину 888 п.н. и способен кодировать полипептид с массой 32 кДа. Выведенная последовательность аминокислот tfdR указывает, что он является членом активаторов LysR-типа, Исследование регуляции кластеров катаболических генов выявило делеционный мутант pYGIOlO, у которого отсутствует Xbal-фрагмент длиной 4,2 т.п.н., содержащий участок инвертированной последовательности, несущей tfdR и tfdS регуляторные гены, при этом указывает на то, что штаммы, содержащие pYGIOlO, становятся 2,4-Д-негативными, но 3-хлорбензол-позитивными. У in vivo рекомбинантов pYGIOlO и клонированного tfdS гена отсутствует 2,4-Д фенотип, что указывает на то, что TfdS является позитивным регулятором tfdA-экспрессии, но не tfdCDEF-экспрессии [Kaphammer et al., 1990; You, Ghosal, 1995].
Исследования функционирования штаммов-деструкторов показали, что штамм A. eutrophus JMP134 (pJP4) избирательно метаболизировал хлорфенол ы. Полная деградация 2,4,6-трихлор фенола показана с использованием газовой хроматографии, однако штамм не метаболизировал 2,3,5-, 2,3,6-, 2,4,5- изомеры трихлорфенола. Вместе с тем, 40% 2,4,5-трихлорфенола минерализировалось в условиях культивирования штамма в хемостате в присутствии 2,4,6-трихлорфенола и фенола [Clement et al., 1995].
Данные, полученные при работе с клонированными генами катаболизма из pJP4, указывали на то, что, тогда как все существенные шаги деградации 2,4-Д кодируются плазмидами, превращение 3-хлорбензола в хлоркатехол специфично для хромосомных генов [Don et al., 1985].
Мутагенез pJP4 транспозонами Тп5 и Тп1771 позволил локализовать пять генов для ферментов, участвующих в этих катаболических путях. Четыре гена: tfdB, tfdC, tfdD и tfdE кодировали 2,4-дихлорфенол гидролазу, дихлоркатехол-1,2-диоксигеназу, хлормуконатциклоизомеразу и хлордиенлактонгидролазу, соответственно. Функции пятого гена tfdF не были определены; предполагается, что он может кодировать трансхлордиенлактонизомеразу. Инактивация генов tfdC, tfdD и tfdE, кодирующих превращение дихлоркатехол а в хлормалеилуксусную кислоту, препятствовала деградации штаммом — хозяином JMP134 3-хлорбензола и 2,4-Д, что указывает на то, что в путях для этих двух субстратов используются одни и те же ферменты для диссимиляции хлоркатехолов. Показано, что tfdQDiEiF] и tfd DHCHEHFH гены, составляющие плазмиду pJP4 у R. eutropha JMP134 кодируют полные ряды функциональных ферментов превращения хлоркатехолов в 3-оксоадипат, которые экс прес сируются во время роста на 2,4-Д. Однако активность tfdi-кодируемых ферментов была обычно выше, чем tfd[-кодируемых ферментов, как у штаммов дикого типа, растущих на 2,4-Д, так и у дериватов, растущих на 3-хлорбензоле, и несущих только одну модель генов tfd. Хлормуконатциклоизомераза tfdDn проявляет особые кинетические свойства с высокой активностью против 3-хлормуконата и низкой активностью против 2-хлормуконата и незамещенного муконата, объясняя, таким образом, разное фенотипическое поведение штаммов R.eutropha, содержащих различные гены tfd. Отмечено, что фермент катализирует формирование равновесия между 2-хлормуконатом и 5-хлоро- и 2-хлоромуконолактоном и очень неэффективно катализирует дегалогенирование с формированием транс-диенолактона в качестве основного продукта, отличаясь, таким образом, от всех (хлор) муконатциклоизомераз, описанных до сих пор [Laemmli et а!., 2002, 2004; Ledger et al., 2002; Plumeier et al., 2002].
Сравнение структуры плазмиды pJP4 A. eutrophus JMP134 и участка tfdR EST4021 P. putida показало, что регуляция tfd-генов сходна у разных штаммов вне зависимости от того, из какого географического района они получены [Vedler et al., 2000]. Анализ последовательностей показал, что катаболические опероны хлоркатехола плазмид pJP4, рАС27, рР51 имеют общего предшественника. Предполагается, что они значительно старше, чем опероны, возникающие под воздействием химической индустрии [Schliman, 1994].
Плазмида pJP4 относится к Inc PI-группе и является конъюгативной плазмидой широкого ряда хозяев. Интересной особенностью штамма Ralstonia eutropha JMP134 (pJP4) и некоторых других видов подвижных бактерий является то, что они могут передвигаться в направлении 2,4-Д в процессе хемотаксиса. Клетки дикого типа R. eutropha могли хемотаксически притягиваться к 2,4-Д в тестах на чашках и в тестах с капиллярами. Хемотактический ответ индуцировался ростом на 2,4-Д и зависел от наличия катаболической плазмиды pJP4, которая содержит tfd-гены деградации 2,4-Д. Обнаружено, что tfd-кластер также кодирует пермеазу для 2,4-Д, обозначенную как TfdK. Мутанты не обнаруживают хемотаксиса к 2,4-Д, даже если они растут на 2,4-Д со скоростью, присущей дикому типу [Hawkins, Harwood, 2002].
Идентификация штаммов по признакам морфологической, морфометрической, физиологической и биохимической дифференциации
Использовали следующий состав реакционной смеси для ПЦР: праймеры - по 25 пмол каждого; 10Х буфер - 2,5 мкл; 2 мМ dNTP - 2,5 мкл; BioTaq полимераза («Диалат», Москва, 5Е/мкл) - 0,2 мкл; ДНК-матрица-50 нг; Н20 - до 25 мкл.
Реакцию проводили по следующей схеме: 30 циклов: 94С - 0,5 мин; 45С - 1 мин, 72С - 1 мин; окончательная полимеризация - 7 мин. Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см. Фотографирование полученных данных проводили при помощи системы видеодокументации BioDocII, производства («Biometra», Германия).
Выделение и очистку продуктов ПЦР, соответствующих различным областям гена, проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps Promega, (США), согласно рекомендациям производителя. Секвенирование ПЦР-продуктов проводили с использование набора реактивов Silver Sequencing, Promega, США, согласно рекомендациями производителя, с незначительными модификациями. При этом для секвенирования использовали как внешние, так и внутренние праймеры и чтение проводили в двух направлениях.
Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов был проведен с помощью сервера BLASTA. Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий с помощью программы CLUSTAL.W [Thompson et al., 1994]. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON [Van de Peer, De Wachter, 1994]. Для окончательного анализа были секвенированы полные последовательности генов 16S рРНК, по номенклатуре Е. coli примерно соответствующих позициям с 30-го по 1500-й нуклеотид.
Посевной бактериальный материал получали при выращивании культур в разбавленном МПБ (1МПБ:7Н20) с добавлением хлорфеноксиуксусных кислот до конечной концентрации 100 мг/л при температуре 30С. Полученный посевной материал высевали в количестве 0,01% от объема в жидкую питательную среду, содержащую в г/л: NH4CI - 1, К2НР04 - 5, MgS04-7H20 - 0,05, FeS04-7H20 - 0,005, CuS04-5H20 -0,001, ZnS04 - 0,0008,2,4,5 - 0,1. pH среды доводили до 6,8-7,0.
Материал культивировали в термостатированных установках УВМТ-12-250 при 115-120 об/мин. Контроль роста культур вели с использованием фотоколориметра КФК-2 по изменению оптической плотности клеточной суспензии OD59o при длине волны 590 нм и чувствительности равной 2.
Определение количества хлорфенокснуксусных кислот в культуральной жидкости проводили используя модифицированные методы определения микроколичеств пестицидов [Методы определения микроколичеств пестицидов, 1984]. Для анализов отбирали пробы культуральной жидкости объемом 10 мл. Клетки штамма удаляли из проб центрифугированием в течение 30 мин при 5 тыс. об/мин. Затем рН жидкости доводили до 2,0, добавляя 1-2 капли 1н НС1. Далее из проб 3-кратно экстрагировали хлорфеноксиуксусные кислоты равными объемами хлороформа. Хлороформ после экстракции удаляли отгонкой на вакуумном роторном испарителе. Экстракты хлорфенокснуксусных кислот метилировали, затем переводили в гексан и проводили их фракционирование методом тонкослойной хроматографии. Тонкослойную хроматографию .проводили на пластинах силуфол UV-254 (Чехия). Образцы сканировали в камере Хромоскана (Jouce-Loebl) при длине волны 260-280 им, после чего пластины окрашивали 0,001% раствором бромкрезолового зеленого в 96% этаноле для визуальной оценки результатов хроматографии. Определение количества хлорфенокснуксусных кислот проводили по калибровочному графику для чистого стандарта.
Для идентификации продуктов метаболизма 2,4,5-Т проводили отбор проб культуральной жидкости в ходе инкубации штаммов. Пробы освобождали от бактериальных клеток центрифугированием в течение 30 мин при 5 тыс. об/мин. Далее из проб 3-кратно экстрагировали равными объемами хлороформа и эфира 2,4,5-Т и продукты ее деградации. После экстракции хлороформ и эфир удаляли отгонкой на роторном вакуумном испарителе. Экстракты 2,4,5-Т и интермедиаты ее деградации метилировали свежеприготовленным диазометаном, затем переводили в гексан и подвергали анализу.
Пробы анализировали на хроматомасс-спектрометре NERMAG R-30-10 с хроматографом Carlo Erba MEGA 5360. Анализ проводили при следующих условиях: размер капиллярной колонки 15 м х 0,25 мм, привитая фаза ДВ-1, гексан в качестве растворителя, скорость нагрева 3,5 мин, температура колонки от 80С до 250С, интерфейса 250С, инжектора 200С. Масс-спектры электронного удара получали при температуре источника ионов 250С, энергии электронов 70 эВ.
Идентификацию полученных соединений проводили анализируя совокупность данных о сроках удерживания соединений в хроматографической колонке и данных анализа масс-спектров, основанных на зависимости структура - характер распада. Данные интерпретировали, используя «внутренний интеллект» системы обработки данных MS HP ChemStation, содержащей библиотеку из 138 тыс. масс-спектров Base Date WILEY138L.
Элиминация плазмид из клеток бактерий, индуцированная бромистым этидием
В ходе первого этапа работы были исследованы морфологические, морфометрические, физиологические и биохимические признаки выбранных для исследований бактерий Коллекции штаммов-деструкторов ИБ УНЦ РАН, а именно культур IBRB-36 4СРА, IBRB-21SG, IBRB-22S и IBRB-2T.
Анализ морфологических признаков показал, что клетки культуры IBRB-36 4СРА представляют собой подвижные палочки разной длины с закругленными концами, до сферических. Колонии полупрозрачные, с неровным краем, выпуклые. Окраска по Граму отрицательная.
При исследовании препаратов биомассы изучаемого штамма в просвечивающем электронном микроскопе было установлено, что микробная популяция представлена двумя группами клеток, различающихся между собой по электронной плотности и по размерам (рис. 1, табл. 2, 3).
К первой группе были отнесены все клетки с высокой электронной плотностью и компактной структурой цитоплазмы ( 71%). В эту группу вошли клетки овальной и кокковидной формы, а также короткие палочки, имеющие довольно высокую электронно-оптическую плотность. Размеры клеток варьировали в пределах 0,55-0,5/0,76-5,0 мкм (рис.1, табл. 2,3). Следует также отметить, что некоторые клетки данной группы образовывали почкоподобные клеточные структуры и мелкие клетки (микроклетки) округлой и реже овальной формы диаметром 0,2-0,3 мкм. Известно, что такие формы бактерий могут образовываться при старении культуры. Во вторую группу вошли клетки с более рыхлой структурой цитоплазмы и низкой электронно-оптической плотностью ( 29% от всего числа микробов в образце). Размеры этих микробов колебались в пределах 0,6/0,8-2,0 мкм (рис. 1,табл. 2, 3). Далее было проведено исследование физиолого-биохимических признаков штамма. Установлено, что для культуры характерен аэробный рост в диапазоне температур от +10 С до +37 С, оптимум рН среды - 6,8. Клетки не метаболизировали дульцит, мочевину, эскулин, фенилаланин, при использовании глюкозы, ксилозы, арабинозы, сорбита, галактозы, целлобиозы наблюдалось образование кислоты и газа. Бактерии не осуществляли гидролиз желатины, но были активны в отношении казеина, проявляли амилазную, оксидазную, каталазную, аргининдегидролазную, казеиназную, лецитиназную активность, осуществляли восстановление нитратов. В присутствии 2% NaCl наблюдался относительный рост, при концентрации 5% NaCl рост бактерий отсутствовал.
На основании совокупности выявленных морфологических, морфометрических, физиологических и биохимических признаков штамм был отнесен к роду Aeromonas и виду hydrophila [Определитель бактерий Бсрджи, 1997] и обозначен как штамм Aeromonas hydrophila IBRB-36 4СРА. Морфометрические и физиологические признаки штамма Aeromonas hydrophila IBRB-36 4СРА суммированы в таблице 4.
Исследование морфологических признаков культуры IBRB-21SG показало, что клетки штамма представляют собой подвижные палочки, при росте на МПА образуют гладкие не пигментированные колонии. Окраска клеток по Граму отрицательная.
При изучении морфологии и морфометрических параметров бактерий культуры 1BRB-21SG было установлено, что микробная популяция этой культуры на момент анализа также была гетерогенна по возрасту клеток (рис. 2 табл. 2, 3). Значительная часть бактерий в популяции (-67% от всего числа клеток) была представлена молодыми и интактными клетками, сходными по морфологии. Большинство клеток популяции имело форму коротких палочек или палочек с размерами 0,37/0,73-1,4 мкм с ровной поверхностью (рис. 2, табл. 2, 3). Исследование физиолого-биохимических признаков изучаемого штамма показало, что для него характерен аэробный рост с оптимумом в диапазоне температур от +22 С до +30 С и значениях рН среды в пределах 6-8. Штамм использовал в качестве единственного источника азота соли аммония и аминокислот. В качестве источника углерода бактерии использовали маннит. Изолят обладал оксидазной активностью, осуществлял восстановление нитратов, не использовал в качестве источников углерода целлюлозу, не осуществлял гидролиз крахмала, казеина, проявлял невысокую активность в отношении гидролиза желатины.
На основании выявленных морфологических, морфометрических, физиологических и биохимических признаков штамм был отнесен к роду Agrobacterium и виду tumefaciens [Определитель бактерий Берджи, 1997] и обозначен как штамм Agrobacterium tumefaciens IBRB-2ISG. Морфометрические и физиологические признаки штамма Agrobacterium tumefaciens IBRB-21SG приведены в таблице 5.
Изучение ультраструктуры культуры 1BRB-22S показало, что клетки представляют собой подвижные кокки и овалы размером 0,63 и 0,63/1,05 мкм с перитрихиальными жгутиками (рис. 3, табл. 2,3). При росте на МПА наблюдалось образование красноватых колоний. Окраска клеток по Граму отрицательная.
Оптимальный рост бактерий наблюдался в диапазоне от +30С до +37С, при рН 7-8, в аэробных условиях. Штамм ферментировал сахарозу маннит, мальтозу, цитрат, глюконат. Клетки обладали способностью декарбоксилировать лизин, восстанавливать нитрат, обладали каталазной активностью, проявляли активность в отношении желатины. Штамм не использовал в качестве источника питания мочевину, пектат, арабинозу, лактозу, аргинин и фенилаланин.
Локализация генетических детерминант катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот на плазмидах рСНЗб 4СРА, pPA21SG и pSM22S
На следующем этапе с использованием метода дискриминации признака был проведен поиск детерминант катаболизма 4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т на плазмидах рСНЗб 4СРА, pPA21SG, pSM22S штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4CPA, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S.
При осуществлении этой части работы к сведению было принято то, что как одно из доказательств внехромосомнои локализации генетических детерминант бактерий используется исключение из клеток внехромосомных элементов, на которых могут располагаться генетические детерминанты. Если последствием такой дискриминации является необратимая утрата исследуемых свойств, полагают, что детерминанты последних расположены вне хромосомы [Novick, 1969]. Утрата плазмид может быть достигнута обработкой клеток микроорганизмов соединениями, обладающими избирательной ДНК-тропностью [Watanabe, 1967; Кудлай с соавт., 1972]. Одним из таких соединений является бромистый этидий [Методы общей бактериологии, 1990]. Показано, что это соединение, являющееся ингибитором решшкативного синтеза плазмидной ДНК, в низких концентрациях (5-10 х 106 М, рН 7,2) вызывало у бактерий практически полную элиминацию факторов R4, R22 [Bouanchaud et al., 1968].
При этом было отмечено, что оптимальная концентрация агента, излечивающего бактерии от плазмид, может сильно варьировать - в 100 и даже в 1000 раз - в зависимости от природы бактерий, подвергающихся обработке [Методы общей бактериологии, 1990]. Поэтому при исследовании плазмид был проведен подбор концентраций бромистого этидия для эффективной элиминации плазмид рСНЗб 4СРА, pPA21SG и pSM22S из несущих их клеток (табл. 9). Принимая во внимание то, что согласно ряда публикаций утрата плазмид наблюдалась при тех концентрациях элиминирующего агента, при которых отмечался слабый рост культуры, из данных таблицы можно полагать, что элиминация плазмид из клеток штамма Citrobacter hydrophila IBRB-36 4CPA может быть достигнута при использовании концентрации бромистого этидиума равной 5000 мкг/мл, a Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG - 500 мкг/мл. В случае культуры Serratia marcescens IBRB-22S концентрация бромистого этидиума должна быть снижена до 50 мкг/мл. При действии бромистого этидиума на клетки Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S в выбранных концентрациях, были получены клетки с генотипом pi для каждого из штаммов. При этом факт утраты плазмид из этих клеток был подтвержден отсутствием плазмид рСНЗб 4СРА, pPA21SG и pSM22S в препаратах экстрахромосомной ДНК.
В ходе дальнейшей работы отдельные колонии штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S, утратившие плазмиды, были испытаны на потерю возможных функций, а именно способности использовать хлорфеноксиуксусные кислоты (4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т) в качестве единственного источника углерода и энергии. Для этого бактериальные колонии с генотипом pi были высеяны на агаризованную минимальную солевую среду М9 с добавлением ксенобиотиков в качестве источников углерода и энергии. В таблице 10 приведены оценки роста клеток штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА (рСНЗб 4СРА ), Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG (pPA21SG ) и Serratia marcescens IBRB-22S (pSM22S ) в указанных условиях. Контролем в этих экспериментах служили оценки роста штаммов на среде МП А без добавления ксенобиотиков. Из приведенных данных следует, что клетки штаммов Citrobacter hydwphila IBRB-36 4СРА и Serratia marcescens IBRB-22S с потерей плазмид утрачивали способность использовать 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии. Эти результаты указывают на то, что гены катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот расположены на плазмиде рСНЗб 4СРА штамма Citrobacter hydwphila IBRB-36 4СРА и плазмиде pSM22S штамма Serratia marcescens IBRB-22S. Из приведенных данных также видно, что гены деградации феноксиуксусных кислот штамма Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG расположены вне исследуемой плазмиды.
Резюмируя приведенное выше можно заключить, что плазмиды штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА и Serratia marcescens IBRB-22S могут быть классифицированы как плазмиды деградации. Из приведенного также следует, что гены катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот штамма Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG расположены вне плазмиды, а в составе хромосомы.
Следует отметить, что плазмиды деградации у псевдомонад ранее были описаны. Так, для штаммов Pseudomonas aeruginosa PAOl, Pseudomonas aeruginosa PAOl с, Pseudomonas putida было установлено, что гены деградации 2,4-Д расположены на плазмиде pROlOl [Kukor et al., 1989; Kaphammer et al., 1990; Short et al., 1990], для Pseudomonas cepacia CSV90 на плазмиде pMABl [Bhat et al., 1994], для Pseudomonas putida PPO200, Pseudomonas putida РРОЗОО и Pseudomonas putida PPO301 на плазмиде pRO103 [Kukor et al., 1989; Doyle et al., 1991], для Pseudomonas putida PaW340 и Pseudomonas sp. EST4002 на плазмиде pEST4011 [Аусмээс, Нейнару, 1990; Mae et al., 1993]. Резюмируя, подчеркнем, что у штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА и Serratia marcescens IBRB-22S D-плазмиды обнаружены впервые.
