Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы Плазмиды и механизмы переноса генетической информации у бактерий 8
1.1. Конъюгация 8
1.1.1. Конъюгативные плазмиды 8
1.1.2. Генетическая организация факторов переноса 9
1.2. Мобилизация 10
1.2.1. Характеристика белков мобилизации 12
1.3. Главные семейства малых мобилизируемых плазмид 15
1.3.1. MOBQ семейство 15
1.3.2. ColEl-семейство 24
1.3.2.1. MOBHEN подсемейство 30
1.3.2.1. МОВр подсемейство 36
1.3.3. рМУ158-семейство 37
1.3.4. CloDF13 семейство 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 49
2.1. Объекты исследований 49
2.2. Выделение плазмидной ДНК 49
2.3. Очистка плазмидной ДНК в легкоплавкой агарозе 50
2.4. Клонирование плазмидной ДНК 51
2.4.1. Приготовление компетентных клеток 51
2.4.2. Приготовление векторов 51
2.4.3. Лигирование 52
2.4.4. Трансформация клеток плазмидной ДНК 52
2.5. Выделение плазмидной ДНК клонов 53
2.6. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК 53
2.7. Секвенирование плазмид со вставкой 53
2.7.1. Введение метки в праймер 54
2.7.2. Постановка реакции секвенирования 54
2.8. Определение устойчивости штамма к антибиотикам 55
2.9. Определение устойчивости штамма к тяжелым металлам 56
2.10. Конъюгация клеток бактерий 56
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 57
3.1. Рестрикционный анализ плазмиды рАН 36 4СРА штамма Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА 57
3.2. Создание геномных библиотек перекрывающихся рестрикционных фрагментов плазмиды рАН 36-4СРА 58
3.2.1. Rsa I библиотека клонов 59
3.2.2. Kzo9\ - библиотека клонов 62
3.2.2. Alul- библиотека клонов 65
3.3. Определение последовательности нуклеотидов фрагментов плазмиды рАН 36 4СРА 68
3.3.1. Секвенирование библиотеки клонов Rsa I - Kzo9I - Alul -фрагментов рАН364СРА 68
3.3.2. Секвенирование плазмиды рАНЗб 4СРА методом «праймерной прогулки» 69
3.4. Сравнительный анализ фрагмента плазмиды рАН 36-4СРА в формате базы данных GenBank 71
3.5. Филогенетическое положение генов mob плазмиды рАН 36-4СРА штамма Citrobacter hydrophila 74
3.6. Сравнительный анализ кластера mob генов плазмиды рАН36-4СРА 75
3.6.1. Сравнительный анализ последовательности нуклеотидов mob А плазмиды рАН 36-4СРА 77
3.6.2. Сравнительный анализ последовательности нуклеотидов тоЬВ плазмиды рАН 36-4СРА 80
3.6.3. Сравнительный анализ последовательности нуклеотидов тоЬС плазмиды рАН 36-4СРА 82
3.6.4. Сравнительный анализ последовательности нуклеотидов mobD плазмиды рАН 36-4СРА 84
3.7. Исследование процесса трансфера плазмиды рАН 36-4СРА С. hydrophila IBRB-36 4СРА 88
Выводы 91
Список литературы 92
- Мобилизация
- Выделение плазмидной ДНК
- Выделение плазмидной ДНК клонов
- Создание геномных библиотек перекрывающихся рестрикционных фрагментов плазмиды рАН 36-4СРА
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время проблема идентификации и
исследования молекулярно-генетических особенностей строения
экстрахромосомных элементов прокариот привлекает значительное внимание. В рамках решения этой проблемы проводится анализ разнообразия и распространения плазмид в природе, определяются особенности их взаимоотношений с клетками-хозяев, выявляются эволюционные связи и происхождение, а также изучаются механизмы горизонтального переноса генетической информации. Понимание последних напрямую связано с оценкой риска распространения в современном мире генетически модифицированных организмов (ГМО).
Согласно способности к трансферу плазмиды классифицируются на
коньюгативные (самотрансмиссибельные) и мобилизируемые
(трансмиссибельные в присутствии дополнительных коньюгационных
факторов). Коньюгативные плазмиды обладают детерминантами функций,
требующихся для реализации механизмов передачи плазмид от клетки к клетке.
Мобилизируемые плазмиды имеют небольшие размеры, они обычно несут
область мобилизации {mob), кодирующую специфические компоненты белков
мобилизации и область начала переноса (oriT) (Pansegrau W., Lanka E., 1996;
Zechner E. L., et al., 2000). Отмечено, что плазмиды, способные к мобилизации,
могут переносить генетическую информацию не только среди
грамположительных и грамотрицательных бактерий, но также в клетки
растений и эукариот (дрожжей) (Kado C.I., 1994; Bravo-Angel А. М., et al., 1999).
Как оказалось, именно мобилизируемые плазмиды имеют огромное значение в
процессах поддержания и распространения экофизиологических признаков, в
частности, деградации ксенобиотиков и устойчивости к химическим факторам
среды, включая антибиотики.
Вместе с тем следует отметить, что анализ разнородности и разнообразия
мобилизируемых плазмид проведен в меньшей степени, чем это сделано для
коньюгативных плазмид. Поэтому исследования особенностей строения
мобилизируемых плазмид становятся особенно важными (Francia, M.V., and
Clewell, D.B., 2002). Изучение последовательностей нуклеотидов
мобилизируемых плазмид позволяет раскрыть механизмы трансфера и установить филогенетические отношения среди членов различных таксонов. Привлечение ресурсов современных баз данных для изучения структурных особенностей генов мобилизации позволяет предложить их классификацию в семействах и подсемействах, а описание генетической организации каждого семейства, их характерных черт и отношений среди кодируемых ими белков определяет подход к характеристике глобального генного пула мобилизируемых плазмид.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась идентификация и характеристика генов системы мобилизации плазмиды рАН 36-4СРА штамма Citrobacter hydrophyla IBRB-36 4СРА.
Задачи исследования:
провести рестрикционный анализ плазмиды рАН 36-4СРА штамма Citrobacter hydrophyla IBRB-36 4СРА;
определить последовательности нуклеотидов плазмиды рАН 36-4СРА;
идентифицировать гены мобилизации плазмиды рАН 36-4СРА;
выявить филогенетическое положение генов mob плазмиды рАН 36-4СРА;
изучить структуру кластера mob генов плазмиды рАН 36-4СРА;
провести сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов генов mob А, тоЬС, тоЬВ и тоЬТ) плазмиды рАН 36-4СРА;
оценить трансфер плазмиды рАН 36-4СРА в клетки других бактерий. Научная новизна исследования. Идентифицирована
последовательность нуклеотидов кластера генов мобилизации плазмиды
рАН36-4СРА Citrobacter hydrophyla IBRB-36 4СРА. Длина последовательности
составляет 1809 п.н. Показано, что система мобилизации плазмиды рАНЗб-
4СРА объединяет 4 гена: mob А, В, С, и D. Длина тоЪК составляет 1497 п.н.,
тоЬВ - 489 п.н., тоЬС - 324 п.н., тоЬТ) - 216 п.н.
Выявлена структурная организация кластера генов мобилизации плазмиды рАН36-4СРА. Установлено, что гены тоЬВ и тоЬТ) располагаются внутри гена тоЬА, в то время как последовательность тоЬС частично перекрывается геном mob А.
Обнаружена возможность трансфера плазмиды рАН 36-4СРА в клетки штаммов Gluconobacter oxydans IBRB-2T и RaoultellaplanticolaJBRB-33 4СРА.
Практическая значимость работы. Полученные в данном исследовании результаты раскрывают молекулярно-генетические особенности строения систем мобилизации малых плазмид и вносят существенный вклад в понимание процессов их функционирования. Результаты работы могут быть применены для создания новых штаммов векторных систем в области генной инженерии.
Апробация работы. Результаты работы были обсуждены в ходе работы Первого конгресса европейских микробиологов (Словения, 2003), 1-го Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), конференции ELSO (Франция, 2004), 7-ой, 9-ой и 10-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003, 2005, 2006), международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), Всероссийской Молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005).
Гранты. Работа была проведена при содействии Государственного контракта Э0029 «Экспедиционные исследования микроорганизмов промзоны нефтехимического производства», ФЦП «Интеграция науки высшего образования России на 2002-2006 годы», РФФИ-Агидель 02-04-97911, гранта Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биоразнообразие» и программы Президиума РАН «Поддержка молодых ученых».
Публикации. Результаты диссертации изложены в 10 печатных работах, в том числе 3 статьях и публикации в базе данных NCBI (Microbial Genomes section of GenBank).
Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, обсуждения результатов исследований, выводов, списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 111 страницах, содержит 30 рисунков и 18 таблиц. Библиография включает 179 источников.
Мобилизация
Проблема переноса неконъюгативных плазмид, не обладающих набором tra генов, решается посредством процесса мобилизации.Неконъюгативные плазмиды - это, как правило, небольшие плазмиды, обладающие собственным началом переноса огії и кодирующие релаксазу. Для переноса генов от донора к реципиенту таким плазмидам необходимы коньюгативные плазмиды (Pansegrau W., Lanka Е., 1996; Zechner Е. L., et al., 2000).
Процесс передачи от одной бактериальной клетки другой неконъюгативных плазмид либо хромосомных генов с участием конъюгативных плазмид по типу плазмиднои помощи называется мобилизацией. Суть «плазмиднои помощи» заключается в перемещении неконъюгативных плазмид из клетки-донора в клетку-реципиент благодаря их взаимодействию с конъюгативной плазмидой. Перемещаемые плазмиды называются мобилизируемыми. Процесс, который сопровождаетсяфизическим объединением плазмид, получил название кондукция (Clark J., Warren G., 1979).
В большинстве своем одноцепочечные ДНК самотрансмиссибельных плазмид, такие как F, R100 и R64, линейно передаются от донорских клеток в реципиентные в процессе конъюгации (Willetts N., Skurray R., 1980; Willetts N., Wilkins В., 1984). Было выдвинуто предположение, что механизм переноса у самотрансмиссибельных и мобилизуемых плазмид схожий. Подобно самотрансмисибильным плазмидам, способные к мобилизации плазмиды ColEl (Warren G.J., et al., 1978), CloDF13 (van de Pol H.E., 1978), pSClOl (Nordheim Ph.D., 1979) и RSF1010 (Willetts N., Wilkins B, 1984) (возможно идентична с Rl 162 (Grinter N.J., Barth, P.T., 1976), содержат небольшой сегмент ДНК в c/s-положении, необходимый для мобилизации, так называемую область начала переноса (origin of transfer - oriT). Кроме наличия точки начала переноса, для мобилизации требуется белки кодируемые мобилизуемой плазмидой. Некоторые из них могут быть компонентами релаксирующего комплекса (Inselburg J., Appelbaum В., 1978; Lovett М.А., Helinski D.R., 1975). Предполагается, что ДНК-перенос инициируется белком, кодируемым плазмидой - ДНК-релаксазой. Релаксаза вносит разрыв в фосфодиэфирную связь специфического динуклеотида (ник-сайт) в пределах последовательности oriT. Белки релаксирующего комплекса детерминируются кластером генов mob.
Один из важнейших вопросов, возникших в последние годы при изучении мобилизации неконъюгативных плазмид, связан с выяснением роли самих неконъюгативных плазмид в мобилизации, а также с поисками белков, синтезируемых под контролем неконъюгативных плазмид и участвующих в процессе мобилизации. Исследования показали, что фактор F мобилизует плазмиду ColEl с высокой частотой, составляющей 50% частоты собственного переноса. Для обеспечения мобилизации плазмиды ColEl необходимы все гены фактора F, кроме гена traJ. Продукт гена traD необходим для мобилизации ColEl, но не плазмиды CloDF13 (Willetts N.,Skurray R., 1980). Однако, известны ґга-мутантьі плазмиды F, которые не способны к собственному переносу, но могут мобилизовать перенос неконъюгативных плазмид ColE 1 или CloDF 13. Следовательно, собственный перенос мобилизующей конъюгативной плазмиды не является существенным для мобилизации неконъюгативной плазмиды.
Исследование индуцируемых транспозоном Tnl мутантов плазмиды ColEl, которые не мобилизовались конъюгативной плазмидой на перенос, показало, что плазмида ColEl содержит генетический район, участвующий в мобилизации - mob.Белки, требуемые для мобилизации, в большинстве случаев кодируются кластером трех генов mob ABC, которые транскрибируются в разных направлениях от промоторов, смежных с начальной точкой начала переноса (orfY) (Zhang S., 1995).Критической стадией в конъюгативной мобилизации является никирование той цепи ДНК, которая затем переносится в клетку-реципиент. Разрыв вносится в релаксоме - комплексе состоящем из двух плазмид-кодируемых белков (МоЬА и MobC) (Zhang S., 1997) и ДНК orfl сайта.Mob А является основным белком релаксомы. Этот белок связывается с огїї и вносит разрыв в ту единственную цепь ДНК, которая переносится в реципиентную клетку (Perwez Т., 1999). После разрыва МоЬА ковалентно связывается с 5 -концом никированной цепи. В процессе переноса МоЬА остается ковалентно связанным с 5 -концом цепи, а так как он обладает лигазной активностью, то, вероятно, впоследствии участвует в воссоединении концов перенесенной ДНК (Meyer R., 2000).
Второй вспомогательный белок, кодируемый геном mobC, помогает в разделений цепей, увеличивая эффективность раскручивания. Частота конъюгативной мобилизации плазмиды R1162 сокращается примерно в 50раз, если в донорских клетках отсутствует белок MobC (Zhang S., 1997). В отсутствии белка MobC изменяется функционирование участка огіТ ДНК. Уменьшается сайт- и цепь-специфическое никирование белком МоЬА участка orfY, что вызывает снижение частоты мобилизации (Scherzinger Е., 1992). Кроме того, разделение цепей происходит не эффективно в регионе ник-сайта. Эти явления подтверждают модель, в которой белок MobC действует как молекулярный клин индуцированного релаксомой плавления ДНК oriY сайта. Таким образом, белок MobC вызывает расплетение ДНК в регионе ник-сайта, обеспечивая одноцепочечный субстрат, требуемый для разрыва цепи ДНК под действием белка MobA (Henderson D., 1999).
Третий ген mobB, расположенный в другой рамке считывания гена mob А, также требуется для эффективной мобилизации (Meyer R., 2000). Предполагается, что белок MobB, кодируемый этим геном, регулирует экспрессию плазмидных генов mob путем изменения стабильности релаксомы.
Выделение плазмидной ДНК
Для выделения плазмидной ДНК применяли методику, основанную на модифицированном методе щелочного выделения Бирнбойма-Доли (Birnboim & Doly, 1979). Небольшое количество биомассы бактерий, выращенной из отдельной колонии на агаризованной среде LB с ампициллином при 37С, суспендировали в 150 мкл буфера I (50 мМ трис-HCl, рН 8.0; 5 мМ ЭДТА; 50 мкг/мл панкреатической РНКазы). Затем к полученной суспензии добавляли 150 мкл лизирующего буфера II (0.2 М NaOH рН 12.0; 1% додецил сульфата Na). После просветления смеси добавляли 150 мкл нейтрализующего раствора III (2.5 мМ ацетата калия, рН 4.5) и осторожно перемешивали. Далее смесь центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость переносили в новую микроцентрифужную пробирку, добавляли равный объем фенола, перемешивали и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 мин. Затем отбирали верхнюю фазу, переносили в новую микроцентрифужную пробирку и добавляли равный объем хлороформа и центрифугировали 5 мин. Очистку с хлороформом проводили дважды. Далее осаждали ДНК 1/10 объем CH3COONa рН 5.2 и 0.6-0.8 объем изопрапонола 20 мин при 4С. Дважды промывали осадок 70% спиртом и растворяли в 20-50 мкл воды. Плазмидную ДНК очищали от примеси хромосомной ДНК при помощи электрофореза в 0.8% легкоплавкой агарозе. По окончании электрофореза гель просматривали в длинноволновом ультрафиолете (А=320 нм) и вырезали плазмидную ДНК. Гель с плазмидной ДНК помещали в пробирки Eppendorf и плавили агарозу 10 мин при 70С, а затем охлаждали смесь при 42С 10 мин. Далее к полученной смеси добавляли фермент AgarACE из расчета 1ед/200мг 1% агарозы и инкубировали при 42С в течение 2 часов. После разрушения агарозы добавляли 1/10 объем CH3COONa рН 5.2 и 2 объем 96% этанола и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. Затем дважды промывали осадок 70%) этанолом и растворяли в 20-50 мкл воды. При комнатной температуре 10-15 мин.
Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре SmartSpec 3000. Компетентные клетки готовили по стандартной методике (Sambrook et.al., 1989). В работе использовали клетки Escherichia coli штамм DH5a, которые выращивали на среде LB. 2.5 мл суспензии клеток штамма DH5a, выращенных в течение ночи при 37С в жидкой среде LB (NaCl - 0.5%, триптон - 1%, дрожжевой экстракт -0.5%) переносили в колбу с 200 мл свежей среды LB. Культуру выращивали при температуре 37С в течение 3 часов до концентрации примерно 2 х 108 клеток/мл. Далее охлаждали культуру до 4С и все последующие операции проводили при данной температуре. Культуру переносили в охлажденные до 4С центрифужные стаканы и осаждали в течение 10 мин при 900 g. Полученный осадок ресуспендировали в 70 мл охлажденного до 4С 50мМ СаС12 и инкубировали в ледяной бане в течение 15 мин, далее клетки осаждали так, как указывалось ранее. Затем осадок ресуспендировали в 10 мл охлажденного до 4 С 50мМ СаС12, добавляли глицерин до конечной концентрации 15% и по 100 мкл клеточной суспензии переносили в 1.5 мл пробирки Eppendorf, замораживая в жидком азоте. Приготовленные таким образом компетентные клетки хранили при - 70С. Стерилизацию 50мМ СаС12 осуществляли путем фильтрования через фильтры Millipore (США) с диаметром пор 0.45 мкм.
В качестве векторной системы брали вектор pGEM-3Zf(+) Promega (США). Для получения библиотеки по липким концам молекулы вектора pGEM-3Zf(+) расщепляли по ВатШ сайту рестрикции, и далее их лигировали с Kzo9I - фрагментами плазмиды рАН 36-4СРА. Для получения библиотеки по тупым концам использовали Hinc II -фрагменты вектора pGEM-3Zf(+) и Rsal и Alul рестрикционные фрагменты плазмиды рАН 364СРА.Получение препаратов вектора проводили в 25мкл смеси, содержащей 5 мкл pGEM-3Zf(+) (100 мг/мк), 0.5 мкл рестриктазы (20 мг/мк), 2.5 мкл 10Х буфера, 17 мкл MQ. Смесь инкубировали 60 мин при температуре 37С. Далее к пробе добавляли по 1 мкл CIAP (Calf Intestine Alcaline Phosphatase - щелочная фосфотаза) (1 мг/мк), 2.8 мкл CIAP 10Х буфера и инкубировали 1 час при температуре 37С. Для проведения реакции лигирования использовали стандартную методику (Маниатис и др., 1984). Реакцию проводили в 4 мкл. смеси: лигазный буфер 10Х, 0.4 мкл. лигазы и 11.6 MQ. Полученную смесь инкубировали 12 часов при температуре 4С. К 100 мкл компетентных клеток добавляли 10-20 мкл лигазной смеси и инкубировали в течение 1 часа во льду. Далее клетки подвергали тепловому шоку при 42С в течение 90 сек и охлаждали до комнатной температуры. Затем добавляли 1 мл среды LB и пробирки помещали в термостат на 1 час при 37С. По окончании инкубации суспензию клеток рассевали на чашки с агаризованной средой LB, содержащей 50 ед/мл ампициллина, 50мкг/мл изопропил P-D-тиогалактопиранозида (IPTG) и 40 мкг/мл х-галактозы (X-GAL) необходимых для цветной селекции клонов. Клетки выращивали в термостате при 37С в течение ночи. Для проверки компетентности проводили трансформацию клеток интактной плазмидой pGEM-5Zf(+), имеющей ген устойчивости к ампициллину, по методике, описанной выше. В качестве контроля чистоты эксперимента проводили посев трансформированных клеток на ту же среду. Плазмиду выделяли из небольшого количества биомассы, выращенной из посева штрихом на агаризованной среде LB с ампициллином при 37С. Выделение проводили согласно рекомендациям фирмы Promega для технологии Wizard. Полученные препараты плазмидной ДНК хранили при - 18С. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК проводился по стандартной методике (Маниатис и др., 1984). Образцы анализировали в 0,8% агарозном геле. В качестве маркеров использовали препараты 1 т.п.н. DNA и 100 т.п.н. DNA ladder (Сибэнзим, Россия), а также препарат плазмиды pGEM-3Zf(+) после рестрикции Pvu II. Определение размеров фрагментов ДНК проводили с использованием пакета программ Gel Analysis. Секвенирование проводили по методу Сенгера (Sanger et.al., 1977) с использованием набора «Silver Sequencing» (Promega, США) на приборе SQ3 Sequencer (Hoefer, США).
Все операции проводили согласно рекомендациям производителя с незначительными модификациями. Определение последовательностей выполнялось с использованием универсальных плазмидных праймеров Ml 3(F) и M13(R). Мечение праймеров осуществляли с помощью полинуклеотидкиназы (ПНК). Для реакции брали 0.1 пкМ праймера, Іед. ПНК, 0.3 МБк аденозин-5 (у -5-і Р) трифосфата и ПНК-буфер следующего состава: 0,05М имидазол-HCl, рН 4,0; 0.018 М MgC12; 5мМ ДТТ; 0.1мМ спермидин; 0.1мМ ЭДТА; 0.1 мМ аденозинтрифосфат (АДФ). Смесь инкубировали 15 мин при 37С, затем фермент инактивировали нагреванием 5 мин при 65С. К 0.1 пМ меченого праймера добавляли 1/10 объема 10х буфера (50 мМ трис-HCl (рН 9.0); 2 мМ MgC12); 2.5 ед. Taq DNA Polymerase (Sequencing Grade, Promega, USA); 1-2 пкМ плазмидной ДНК и соответствующие терминирующие нуклеотидные смеси (Silver Sequence d/ddNTP Mixes, Promega, USA). Сверху наслаивали по 15 мкл минерального масла. Реакции проводили в ДНК-амплификаторе (Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler, USA) со следующим температурно-временным профилем амплификации: первый цикл - 94С 9 мин; 55С 30с; 72С 1 мин; последующие 30 циклов - 94С х 30 с, 55С х 30 с и 72С х 1 мин; заключительный цикл - 7 мин при 72С. По окончании реакции добавляли стоп-раствор следующего состава: ЮмМ NaOH; 95% формамид; 0,05% бромфеноловый синий; 0,05% ксилен цианол. Продукты реакции отделяли от масла и хранили в морозильной камере при - 18С. Электрофорез проводили на приборе SQ3 Sequencer (Hoefer,CIIIA) в 7%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) толщиной 0,19 мм в денатурирующих условиях (в присутствии 7М мочевины). Последовательность нуклеотидов в ДНК считывали непосредственно с радиоавтографов гелей (Чемерис и др., 1999).
Выделение плазмидной ДНК клонов
Плазмиду выделяли из небольшого количества биомассы, выращенной из посева штрихом на агаризованной среде LB с ампициллином при 37С. Выделение проводили согласно рекомендациям фирмы Promega для технологии Wizard. Полученные препараты плазмидной ДНК хранили при - 18С. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК проводился по стандартной методике (Маниатис и др., 1984). Образцы анализировали в 0,8% агарозном геле. В качестве маркеров использовали препараты 1 т.п.н. DNA и 100 т.п.н. DNA ladder (Сибэнзим, Россия), а также препарат плазмиды pGEM-3Zf(+) после рестрикции Pvu II. Определение размеров фрагментов ДНК проводили с использованием пакета программ Gel Analysis. Секвенирование проводили по методу Сенгера (Sanger et.al., 1977) с использованием набора «Silver Sequencing» (Promega, США) на приборе SQ3 Sequencer (Hoefer, США). Все операции проводили согласно рекомендациям производителя с незначительными модификациями. Определение последовательностей выполнялось с использованием универсальных плазмидных праймеров Ml 3(F) и M13(R). Мечение праймеров осуществляли с помощью полинуклеотидкиназы (ПНК). Для реакции брали 0.1 пкМ праймера, Іед. ПНК, 0.3 МБк аденозин-5 (у -5-і Р) трифосфата и ПНК-буфер следующего состава: 0,05М имидазол-HCl, рН 4,0; 0.018 М MgC12; 5мМ ДТТ; 0.1мМ спермидин; 0.1мМ ЭДТА; 0.1 мМ аденозинтрифосфат (АДФ). Смесь инкубировали 15 мин при 37С, затем фермент инактивировали нагреванием 5 мин при 65С. К 0.1 пМ меченого праймера добавляли 1/10 объема 10х буфера (50 мМ трис-HCl (рН 9.0); 2 мМ MgC12); 2.5 ед. Taq DNA Polymerase (Sequencing Grade, Promega, USA); 1-2 пкМ плазмидной ДНК и соответствующие терминирующие нуклеотидные смеси (Silver Sequence d/ddNTP Mixes, Promega, USA). Сверху наслаивали по 15 мкл минерального масла.
Реакции проводили в ДНК-амплификаторе (Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler, USA) со следующим температурно-временным профилем амплификации: первый цикл - 94С 9 мин; 55С 30с; 72С 1 мин; последующие 30 циклов - 94С х 30 с, 55С х 30 с и 72С х 1 мин; заключительный цикл - 7 мин при 72С. По окончании реакции добавляли стоп-раствор следующего состава: ЮмМ NaOH; 95% формамид; 0,05% бромфеноловый синий; 0,05% ксилен цианол. Продукты реакции отделяли от масла и хранили в морозильной камере при - 18С. Электрофорез проводили на приборе SQ3 Sequencer (Hoefer,CIIIA) в 7%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) толщиной 0,19 мм в денатурирующих условиях (в присутствии 7М мочевины). Последовательность нуклеотидов в ДНК считывали непосредственно с радиоавтографов гелей (Чемерис и др., 1999). Автоматическое секвенирование последовательностей клонированных фрагментов плазмиды рАН364СРА выполняли с помощью набора ВigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), на приборе DNA Analyzes 3730, (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям производителя. Первичный сравнительный анализ полученных de novo последовательностей с последовательностями из базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI BLAST.
Нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов плазмиды рАН364СРА редактировались с помощью программы BioEdit и выравнивались с использованием программы CLUSTALW v 1.75. Скрининг сходства секвенированных последовательностей по базе данных GenBank проводили в программе BLAST. Определение устойчивости штамма к антибиотикам проводили методом диффузии в агар с применением дисков (Лабинская, 1978). Для этого в стерильные чашки Петри наливали 2% мясопептонный агар до оптимальной толщины слоя агара, равной 4-5 мм. Перед посевом чашки подсушивали для лучшей диффузии засеваемого материала в питательную среду.
Для засева использовали по 0.2 мл 18-20 часовой культуры бактерий. Культуру равномерно распределяли по поверхности среды. Засеянные чашки 30-40 мин подсушивали в стерильных условиях при комнатной температуре. Затем на поверхности среды с помощью стерильного пинцета располагали диски, пропитанные антибиотиками. Диски с антибиотиками располагали на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки. В каждую чашку помещали по 4 диска. Чашки на 18 часов помещали в термостат при +30С вверх дном. Бактерии, чувствительные к антибиотикам, образовывали вокруг соответствующих дисков зоны угнетения роста, четко выделяющиеся на фоне сплошного роста культуры. Измерение зоны угнетения производили с помощью циркуля, учитывая, что диаметр зоны проходит через центр диска. При зоне задержки роста бактерий диаметром 1 см штамм расценивался как устойчивый, более 1 см как чувствительный. Определение устойчивости штамма к тяжелым металлам проводили с использованием селективных сред. Для этого в стерильные чашки Петри наливали агаризованную среду МПБ до оптимальной толщины слоя агара, равной 4-5 мм с 0,1 М раствора соли тяжелого металла. Перед посевом чашки подсушивали для лучшей диффузии засеваемого материала в питательную среду. Для засева использовали по 0.2 мл 18-20 часовой культуры бактерий. После посева на поверхность среды перекалывали исследуемые клетки. Чашки на 18 часов помещали в термостат при +30С. Бактерии, чувствительные к солям тяжелых металлов, образовывали вокруг соответствующих дисков зоны угнетения роста. 2.10. Конъюгация клеток бактерий Конъюгацию клеток бактерий осуществляли согласно указаниям, изложенным в руководстве «Методы общей бактериологии» (Маниатис и др., 1984). Штаммы бактерий, использовавшиеся в качестве донора и реципиента, выращивали в жидкой среде МПБ в течение ночи при +30С.
После этого по 3 мл суспензии клеток донора и реципиента засевали в колбу, содержащую 200 мл свежей среды МПБ и проводили наращивание культуры в течение 8-12 ч при +30С. После окончания инкубации, в клеточную суспензию добавляли селективные для трансконъюгантов агенты и инкубировали культуру в течение 1-2 часов в условиях аэрации. В качестве селективных агентов использовали антибиотики или соли тяжелых металлов, гены резистентности к которым были локализованны на плазмиде донора. Затем суспензию клеток рассевали в чашки Петри с агаризованной средой МПБ, содержащей соответствующие селективные для трансконъюгантов агенты и наращивали в термостате при +30С в течение 8-12 часов. Контролем чистоты эксперимента служил посев клеток штаммов, донора и реципиента на среду, содержащую селективные агенты. Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА В начале исследований методом Бирнбойма-Доли (Birnboim, Doly, 1979) из клеток штамма Citrobacter hydrophila IBRB-36-4CPA был получен препарат плазмиды рАН 36 4СРА. На основе RFLP-анализа (restriction fragment length polymorphism) с использованием BamHI, Hindi и PvuII ферментов была построена рестрикционная карта изучаемой плазмиды, позволяющая разработать стратегию ее секвенирования (Рис.13). С целью определения последовательности нуклеотидов фрагментов рАН 36-4СРА была создана библиотека перекрывающихся рестрикционных фрагментов плазмиды. Для клонирования были выбраны эндонуклеазы: Rsal, АЫ (мелкощепящие аналоги Ніпс II) и Kzo9l (мелкощепящий аналог ВатШ) (рис. 14). В качестве векторной системы использовали плазмиду pGEM-3Zf(+) Promega (США), содержащую полилинкер. Вектор pGEM-3Zf(+) расщепляли Hindi эндонуклеазой для тупого лигирования и ВатШ - для липкого. Для того чтобы свести к минимуму повторное замыкание в кольцо линейной векторной ДНК удаляли 5 - фосфаты на обоих ее концах обработкой щелочной фосфатазой. В дальнейшем проводили процедуру самолигирования вектора с последующим выделением из легкоплавкой агарозы его линейной формы. Для выполнения липкого лигирования использовался вектор pGEM-3Zf(+) расщепленный по ВатШ сайту и Kzo9l - фрагменты плазмиды рАН36-4СРА. Тупое лигирование проводили с вектором pGEM-3Zf(+) разрезанным Hindll и с Rsal- и Л/гЛ-рестрикционными фрагментами плазмиды. Для реакций лигирования использовали стандартную методику (Маниатис и др., 1984). Трансформанты выращивали на среде, содержащей ампицилин, IPTG и X-gall, используя сине-белую селекцию рекомбинантов.
Создание геномных библиотек перекрывающихся рестрикционных фрагментов плазмиды рАН 36-4СРА
После тупого лигирования, проведенного с вектором pGEM-3Zf(+) -Hindll и с Rsal- фрагментами плазмиды был получен 41 препарат ДНК клонов. Препараты затем анализировали в 1% агарозном геле с использованием маркеров и ДНК вектора pGEM-3Zf(+) в качестве контроля (рис. 15). Рис.15. Результаты электрофоретического анализа Rsal - клонов плазмиды рАН 36-4СРА. Условные обозначения: 1, 10, 18, 22, 30, 37, 47, 48, 55 - маркер молекулярной массы ДНК 1 т.п.н. + 100 п.н.; 2,19, 31, 46, 49 - pGEM-3Zf(+); 3-9,11-12, 20-21, 23-29, 32-36, 38-45, 50-54 - Rsal - клоны плазмиды рАН 36-4СРА. Препараты плазмидной ДНК Rsal - клонов, расположенные выше вектора pGEM-3Zf(+) в 1% агарозном геле рассматривались как рекомбинантные, они подвергались дальнейшему рестрикционному анализу. Тринадцать Rsal - клонов, обозначенных: 3, 4, 8, 11, 13, 17, 19, 21, 26, 30, 33, 36, 37, расщеплялись под действием рестриктазы Pvu II и подвергались электрофоретическому анализу (рис. 16). 500 » ий Ш 200— Рис. 16. Результаты электрофоретического анализа /fa«I - клонов плазмиды рАН 36-4СРА, после рестрикции Pvull. Условные обозначения: 1 - маркер молекулярной массы ДНК 1 т.п.н. + 100 п.н.; 12,16 - маркер молекулярной массы ДНК 100 т.п.н.; 2 - pGEM-3Zf(+), рестриктированный Pvull; 3-11,13-15 - № 26, 30, 33, 36, 37, 3, 4, 8, 13, 17, 19, 11 - Rsal клоны плазмиды, рестриктированные Pvull. В результате действия рестриктазы образовывалось два (или более) фрагментов рекомбинантной ДНК.
Первый фрагмент представлял собой последовательность вектора, а второй (и остальные) фрагменты содержали вставку. Относительно фрагментов маркерной ДНК оценивался размер вставки (таб. 5). Rsal-клон № 33 по результатам рестрикции не содержал вставку и был исключен из дальнейшего анализа. Таким образом, была получена геномная библиотека из 12 Rsal-клонов, которые по результатам рестрикционного анализа разделились на 6 групп из 4, 1, 2, 1, 2 и 1 клона, соответственно (таб. 5). Таблица 5 Распределение клонов Rsal - библиотеки плазмиды рАН 36-4СРА на основании рестрикционного анализа № группы №Rsal-клона Длина 1-го фрагмента, т.п.н. Длина 2-го фрагмента, т.п.н. Длина 3-го фрагмента, т.п.н. Длина 4-го фрагмента, т.п.н. Размервставки,т.п.н. В результате лигирования по липким концам, проведенного с вектором pGEM-3Zf(+) - ВатНІ и с Хго91-фрагментами плазмиды рАН 36-4СРА, было получено 36 препаратов ДНК клонов, которые затем анализировали методом электрофореза в 1% агарозном геле с маркером и ДНК вектора pGEM-3Zf(+) в качестве контроля (рис. 17). Условные обозначения: 1,10,18 - маркер молекулярной массы ДНК 1 т.п.н. + 100 п.н.; 2, 19, 24, 31, 38 - pGEM-3Zf(+); 3-9, 11-17,19-23, 25-29, 30, 32-37,39-44 -Kzo9I - клоны плазмиды рАН 36-4СРА. Препараты плазмидной ДНК Kzo9I - клонов, расположенные выше вектора pGEM-3Zf(+) в 1 % агарозном геле, рассматривались как содержащие вставку и подвергались дальнейшему рестрикционному анализу. Восемнадцать Kzo9I- клонов, обозначены: №№ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 20, 21, 22, 23, 32, расщеплялись под действием рестриктазы Pvu II и подвергались злектрофоретическому анализу (рис. 18). 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 л Рис. 18.
Результаты электрофоретического анализа Kzo9\ - клонов плазмиды рАН 36-4СРА после рестрикции PvuW. Условные обозначения: 1,9,18,19 - маркер молекулярной массы ДНК 1 т.п.н. + 100 п.н.; 2, 17 - pGEM-3Zf(+), рестриктированный Pvull; 3-8, 10-16, 20-24 - №№i, 6, 7, 10, 2, 3, 11, 8, 9, 5, 14, 13, 4, 32, 23, 22, 21, 20 Kzo9l -клоны плазмиды, рестриктированные Pvull. В результате действия эндонуклеазы, образовывалось два (или более) фрагментов рекомбинантной ДНК. Первый фрагмент представлял собой последовательность вектора, а второй (и остальные) фрагменты содержали вставку. Относительно фрагментов маркерной ДНК оценивался размер вставки (таб. 6). В результате рестрикционного анализа библиотеки Kzo9l было выявлено 18 клонов, несущих плазмиду со вставкой, при этом по результатам рестрикции клоны разделились на десять групп, содержащих соответственно: 5, 2, 2, 1, 1, 2, 1, 1, 1 и 2 клона (Рис. 18). Клоны №22 и №23 были отнесены к одной группе так как, скорее всего, содержали один и тот же фрагмент, встроившийся в вектор в противоположных ориентациях. Таблица 6 Распределение клонов Kzo9l - библиотеки плазмиды рАН 36-4СРА на основании рестрикционного анализа № группы № Kzo9I -клона Длина 1-гофрагмента,т.п.н. Длина 2-гофрагмента,т.п.н. Длина 3-гофрагмента,т.п.н.
Длина 4-гофрагмента,т.п.н. Размервставки,т.п.н. 2 32 2800 700 — — 320 3.2.2. Alul- библиотека клонов Третья Alul - библиотека образовалась в результате лигирования тупых концов молекул вектора pGEM-3Zf(+), расщепленного Hindi, и Alul-фрагментов плазмиды рАН 36-4СРА. На селективной среде, содержащей ампицилин, ИРТГ и Х-галл, были отобраны белые колонии трансформантов, из которых выделили 27 препаратов рекомбинантной ДНК. 12 3 4 5 6 7 8 9 10 1112131415161718 192021222324252627282930313233 Рис. 19. Результаты электрофоретического анализа Alul - клонов плазмиды рАНЗб 4СРА. Условные обозначения: 11,23- маркер молекулярной массы ДНК 1 т.п.н.; 1,9,12,24 - pGEM-3Zf(+)I; 3-8, 10,13-22, 25-33 - Alul - клоны плазмиды №№ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 27, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26. Alul - клоны плазмиды под номерами №№ 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, чьи фрагменты располагались выше препарата вектора в агарозном геле, подвергались рестрикционному анализу с ферментом Pvu Л с целью оценки предварительного размера вставки (Рис. 20). 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415 16 171819 202122232425 26 27282930 Рис. 20. Результаты электрофоретического анализа Alul - клонов плазмиды рАН 36-4СРА после рестрикции Pvull. Условные обозначения: 1,16,17,30 - маркер молекулярной массы ДНК 1 т.п.н.; 2,15,18 - pGEM-3Zf(+), рестриктированный Pvull; 3-14,19-29 - №№ 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11, 12,13,14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22,23,24,25,26, 27 Alul - клоны плазмиды, рестриктированные Pvull. После рестрикции 23 Alul -клона разделились на 9 групп из 4, 6, 1, 1,3, 2, 1, 4 и 1 клона, соответственно. Результаты представлены в таблице 7. Таблица 7 Распределение клонов Alul- библиотеки плазмиды рАН 36-4СРА на основании рестрикционного анализа с ферментом Pvu II № группы № Alul -клона Длина 1-гофрагмента,т.п.н. Длина 2-гофрагмента,т.п.н. Размервставки,т.п.н. 3.3.1. Секвенирование библиотеки клонов Rsa I-, Kzo9l-, Alul- фрагментов рАН 36-4СРА Сначала было проведено частичное секвенирование клонов с внутренних плазмидных праймеров Ml3(F), M13(R), что позволило прочитать нуклеотидные последовательности вставок. В результате анализа полученных данных по трем библиотекам были выявлены 11 групп клонов с идентичными сиквенс-типами (таб. 8). Таблица 8 Распределение последовательностей Rsal -, Kzo9I -и Alul -библиотек плазмиды рАН 36-4СРА по группам на основании их сиквенс-типов 1 Остальные 14 клонов представляли собой химерные артефакты и были исключены из дальнейшего рассмотрения. 3.3.2.
Секвенирование плазмиды рАН 36-4СРА методом «праймерной прогулки» На следующем этапе работы был проведен дополнительный анализ нуклеотидной последовательности фрагментов плазмиды рАН 36-4СРА с целью получения более полных данных о строении участков плазмидной ДНК. В ходе работы на основе клонированной последовательности нуклеотидов плазмиды рАН 36-4СРА создавался оригинальный праймер, с которого «прочитывался» участок ее последовательности, а затем ДНК секвенировалась при помощи второго и последующих праймеров, синтезированных на основе ставшей известной в первых раундах секвенирования последовательности нуклеотидов. Данная стратегия секвенирования протяженных участков ДНК называется «праймерной прогулкой», или подходом с использованием внутренних или прогрессивных праймеров (Чемерис, Ахунов, Вахитов, 1999). Для автосеквенирования в двух направлениях синтезировались как прямые, так и обратные праймеры (таб. 9). Таблица 9 Нуклеотидная последовательность праймеров для секвенирования фрагментов плазмиды рАН 36-4СРА Название Последовательность олигонуклеотидов Результаты сравнительного анализа последовательности нуклеотидов фрагмента плазмиды pAH 36-4СРА с последовательностями базы данных GenBank представлены в таблице 10. Таблица 10 Результаты сравнения последовательностей нуклеотидов фрагмента плазмиды pAH 36-4СРА с данными GenBank Плазмида Бактериальный источник Идентичность с pAH 364CPA,(%) Название № в GenBank pECOl АВ 117929.1 Enterobacter cloacae 99 рАН3680 DQ402049.1 Aeromonas hydrophila 99 рЕС278 AY589571.1 Escherichia coli 98 рК AY079200.1 Salmonella enteritidis 90 pBERT AF025795.1 Salmonella berta 90 Результаты сравнительного анализа выявленной последовательности нуклеотидов фрагмента плазмиды pAH 36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА с ресурсами базы данных GenBank обнаружили существенное сходство фрагмента pAH 36-4СРА с участками плазмид нескольких штаммов бактерий, а именно: pECOl Enterobacter cloacae - 99%, рАН3680 Aeromonas hydrophila - 99%, pEC278 Escherichia coli 278B - 98%, pK Salmonella enteritidis - 90%, pBERT Salmonella berta - 90%). При этом изучаемый фрагмент рАН36-4СРА, длина которого составила 1809 п.н., обладал наибольшим уровнем гомологии с последовательностью плазмиды pECOl, несущей кластер генов мобилизации (mob) (рис. 22). 1 mob -c- start MG ( :TC ACC TGC Рис. 23. Схема расположения генов mob на плазмиде рАН 36-4СРА. Условные обозначения: mobC, mobA, mobB, mobD - гены. 3.5. Филогенетическое положение кластера генов мобилизации плазмиды рАН 36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА Филогенетическое положение кластера генов mob штамма Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА было определено на основании анализа последовательностей в формате ресурсов GenBank. Результаты сравнительного анализа указали на общее происхождение mob генов плазмид рАН36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, pECOl Enterobacter cloacae и Aeromonas hydrophila pAH3680 (рис. 24). CAeromonas salmonicida subsp. salmonicida strain A449 pi. II Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida pAsal2 plasmid Enterobacter cloacae putative MobC gene, partial cds E.coli plasmid pColD-157 DNA . Esherrchia coli strain 278B plasmid pEC278, complete sequence «Erwinia carotovora plasmid рЕСЗ DNA, compl, seq. C Eshericbia coli plasmid pColK- K235, complete sequence E, I Salmonella enteritics serovar Enteritidis plasmid pK, compl. seq. Salmonella berta plasmid pBERI, complete plasmid seq. Plasmid pSWIOO RNAII gene, partial seq. Plasmid pUCDSOOO, complete seq. C -.Plasmid pSW200 from Erwinia stewartii MobC gene Plasmid ColA, complete genome Plasmid СоІА-САЗІ origin of replication region -Г Halomonas elongate, plasmid Hafnia silver plasmid pAlvB, complete sequence Hafnia alvei plasmid pAlvA, complete seq. riCitrobicttt hydrophila plasmid рАН ІЇ-Ш, partial seq. [ r—«Enterobacter cloacae plasmid pECOl DNA, complete seq. -»Aeromonas hydrophila pAH3680, complete seq. Рис. 24. Филогенетическое положение генов мобилизации (mob) плазмиды рАН 36-4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА. 3.6.
