Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. р-Галактозидаза и ее природные источники. 7
1.2. Промышленное использование р-галактозидазы . 9
1.3. Организация генов р-галактозидаз. 10
1.4. Клонирование генов р-галактозидаз бактерий и структура соответствующих ферментов
1.5 Структура р-галактозидаз 16
1.6 Регуляция р-галактозидазного синтеза 21
1.7. Физико-химические свойства р-галактозидаз . 24
1.8 Субстратная специфичность р-галактозидазы 30
1.9 Иммобилизация р-галактозидаз 34
Эспериментальная часть 40
2. Материалы и методы 40
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды. 40
2.2. Химические реагенты и ферменты нуклеотидного обмена 40
2.3. Бактериальные среды и условия культивирования 40
2.4. Выделение и анализ плазмидной ДНК 41
2.5. Выделение хромосомной ДНК Т. ethanolicus 41
2.6. Конструирование геномной библиотеки. 42
2.7 Отбор активных клонов на чашках 42
2.8. Очистка р-галактозидазы 42
2.8.1. Приготовление клеточных экстрактов 42
2.8.2. Фракционирование сульфатом аммония 43
2.8.3. Гель-фильтрация 43
2.8.4. Анион-обменная хроматография 44
2.9. Электрофорез и изоэлектрофокусирование 44
2.10. Методы определения активности р-галактозидазы 45
2.10.1. Определение активности на хромогенных субстратах 45
2.10.2. Определение активности на лактозе 45
2.11. Определение концентрации белка 46
2.12. Определение термостабильности и рН-стабильности белка
2.13. Иммобилизация галактозидазы 46
2.14. Определение активности иммобилизованной р-галактозидазы
2.15. Определение термостабильности и рН-стабильности иммобилизованного белка
2.16. Определение нуклеотидной последовательности гена р-галактозидазы и компьютерный анализ полученных данных.
3. Результаты и обсуждение 49
3.1. Создание банка генов и отбор активных клонов 49
3.2 Определение нуклеотидной последовательности гена р-галактозидазы T.ethanolicus . 51
3.3 Выделение и очистка рекомбинантной р-галактозидазы 63
3.4 Субстратная специфичность и физико-химические характеристики р-галактозидазы
3.5 Иммобилизация р-галактозидазы T.ethanolicus 74
Заключение 79
Выводы 82
Список литературы
- Промышленное использование р-галактозидазы
- Физико-химические свойства р-галактозидаз
- Бактериальные среды и условия культивирования
- Определение нуклеотидной последовательности гена р-галактозидазы T.ethanolicus
Введение к работе
Актуальность темы. В последние десятилетия значительно возрос интерес к ферменту лактазе (0-галактозидаза КФ 3.2.1.23). р-Галактозидаза расщепляет молочный сахар - лактозу - на моносахариды - глюкозу и галактозу. Фермент может быть использован в промышленности для гидролиза лактозы в молоке и молочной сыворотке. Ферментативный гидролиз лактозы в сыворотке позволит создать на его основе безотходную технологию переработки молока и решить проблему охраны окружающей среды, возникающую в связи с загрязнениями, вызываемыми сливом отходов молочной проимышленности. Использование фермента в промышленности позволяет решить важную экономическую задачу получения сахаристых веществ из нетрадиционного сырья. Молочные продукты, где лактоза заменена сбраживаемой смесью моносахаридов - глюкозой и галактозой, находят широкое применение в сельском хозяйстве, медицине, микробиологической промышленности, различных отраслях пищевой промышленности.
Особый интерес представляют р-галактозидазы термофильных бактерий. Они способны продолжительно действовать при при высоких температурах (выше 60°С) и обладают рядом преимуществ по сравнению с 0-галактозидазами грибов (температурный оптимум 50°С) используемых в настоящее время в биотехнологическом производстве. В частности, для них характерны более высокие удельные активности. В связи с высокими температурными оптимумами, гидролиз лактозы возможно проводить при высоких температурах. Это препятствует бактериальному заражению при длительном использовании фермента в иммобилизованном состоянии.
Одним из способов получения и изучения темостабильных ферментов, продуцируемых термофильными анаеробными бактериями, является клонирование и экспрессия соответствующих генов в мезофильных микроорганизмах.
Цель и задачи исследования. Целью работы является клонирование гена р-галактозидазы Thermoanaerobacter ethanolicus 39Е (Clostridium thermohydrosulfuricum 39E) в E.coli, исследование его структуры, изучение свойств фермента.
В ходе работы решались следующие задачи:
- создание и анализ банка генов Т.ethanolicus в клетках Е. coll;
- отбор клонов с р-галактозидазной активностью;
- определение нуклеотидной последовательности клонированного гена р-галактозидазы;
- выделение и очистка р-галактозидазы Т.ethanolicus из клеток Е. coll;
- изучение физико-химических свойств термостабильной р-галактозидазы;
- иммобилизация фермента и характеристика иммобилизованного белка.
Промышленное использование р-галактозидазы
В промышленности р-Галактозидаза используется для гидролиза лактозы, содержащейся в молоке и молочной сыворотке, до моносахаров глюкозы и галактозы. Молочные продукты с гидролизованной лактозой находят широкое применение в сельском хозяйстве, медицине, различных отраслях пищевой промышленности [4,7,36].
р-Галактозидаза может быть использована при концентрации молочных продуктов. Слабая растворимость лактозы обуславливает возникновение "песчаности" в таких продуктах как сгущенное молоко, концентрированное молоко, мороженое. Гидролиз лактозы на глюкозу и галактозу позволяет решить эту проблему. Из гидролизованной сыворотки получают сладкие пищевые сиропы, безалкогольные напитки. Замена лактозы смесью моносахаридов способствует ускорению созреЕания сыра, йогурта, и других молочных продуктов.
Гидролизованная молочная сыворотка может использоваться в качестве добавки к питательным средам для выращивания микроорганизмов. Фермент может быть использован в медицине. Дефицит (Ьгалактозидазы в кишечнике у некоторых людей делает невозможным потребление молока и некоторых молочных продуктов, приводит к различным комплексным нарушениям в организме. Для лечения лактазной недостаточности используют введение фермента в организм в щелочнорастворимых капсулах, прием фермента одновременно с принятием молока, использование молока с частично гидролизованной лактозой. В последние годы все большее значение приобретает получение диетических продуктов для детей и взрослых на основе безлактозного молока.
Обычно в промышленном производстве fi-галактозидаза используется в иммобилизованном виде. Разработка этой проблемы для пищевой промышленности - одно из важнейших направлений современной биотехнологии .
В настоящее время в микроорганизмах обнаружены две системы для утилизации лактозы: лактоз-пермеазная и фосфоенолпируват зависимая фосфотрансферазная (PTS). В первом случае гидролиз лактозы осуществляет р-галактозидаза , которая гидролизует лактозу до изомолекулярной смеси моносахаров, а лактоз-пермеаза осуществляет накопление в летках p-D-галактозидов, в частности лактозы. Во втором случае система работает с участием фосфо-р-галактозидазы. Второй путь описан для небольшого числа Грам-положительных бактерий. Он начинается с фосфорилирования лактозы при вовлечении фосфоенолпируватзависимой фосфотрансферазной системы [64]. Фосфорилированная лактоза превращается в глюкозу и галактоз-6-фосфат с помощью фосфо-р-галактозидазы. В последующий метаболизм галактоз-6-фосфата вовлечены еще три фермента: галактоз-6-фосфат изомераза, тагатоз-6-фосфат киназа и тагатоз-1,6-бифосфат альдолаза. Такой путь был обнаружен у Streptococcus faecalis [42], Streptococcus sallvarius [40], Staphylococcus aureus [46] и некоторых других микроорганизмов. Основным конечным продуктом такого пути является молочная кислота.
Лактоз-пермеазный путь является основным для большинства микроорганизмов. Хотя некоторые микроорганизмы продуцируют как 3-галактозидазу так и фосфо-0-галактозидазу, например Clostridium acetobutllicum [103].
Анализ генов, контролирующих синтез ферментов, вовлеченных в катаболизм лактозы, впервые был осуществлен Ф.Жакобом и Ж.Моно для клеток E.coll [6,16]. На базе этого исследования была впервые сформулирована модель структурно-функциональной организации оперона. Для утилизации лактозы у большинства энтеробактерий необходимы продукты двух тесно сцепленных цистронов. Это ген lacZ, кодирующий р-галактозидазу, и ген lacY, кодирующий пермеазу, которая обеспечивает активный транспорт лактозы в клетку. Третий ген 1асА, кодирующий фермент тиогалактозидтрансацетилазу, регулируется координированно с генами lacZ и lacY, но не имеет отношения к утилизации лактозы. Эти гены картируются в последовательности Z-Y-A.
Близко расположенный lac I ген кодирует белок, который вызывает репрессию генов оперона. Некоторые p-D-галактозиды инактивируют репрессорный белок и таким образом индуцируют синтез Lac белков. Глюкоза блокирует экспрессию оперона понижая концентрацию сAMP. Эти метаболиты активируют Сар белок, который связывается с LacZp областью и стимулирует транскрипцию оперона. Продуктами гидролиза лактозы у таких микроорганизмов являются глюкоза и галактоза. При этом фермент катализирует гидролиз р-1,4-Б-галактозидных связей.
Физико-химические свойства р-галактозидаз
р-Галактозидазы можно условно разделить на две группы. К внутриклеточным ферментам относятся р-галактозидазы большинства бактерий и некоторых дрожжей. К внеклеточным - грибные р-галактозидазы. Внутриклеточным ферментам свойственна высокая молекулярная масса олигомерной молекулы, отсутствие углеводного компонента, выраженная зависимость каталитической активности от наличия ионов двухвалентных металлов Mg2+, Mn2+, Zn2 + , Со2+. Эти З-галактозидазы чувствительны к изменениям рН и температуры [4,36]. Во многих случаях ферменты ингибируютя EDTA, HgCL2, окисляющими агентами, фенантролином. З-Галактозидазы дрожжей чаще всего имеют олигомерную природу и состоят из различного количества субъединиц. Молекулярная масса от 200 до 600 кДа. Ферменты дрожжей чувствительны к ловышению температуры до 40 градусов и их активность сильно зависит от изменения рН от интервала оптимального значения (6.8 - 7.2). Аминокислотный состав характеризуется высоким содержанием цистеина. П-хлормеркурийбензойная кислота (ПХМБ) полностью инактивирует ферменты. Активность (5-галактозидаз дрожжей сильно зависит от присутствия в среде ионов одно- и двухвалентных металлов.
Грибы синтезируют внеклеточную р-галактозидазу. Эти ферменты являются гликопротеинами, содержащими от 5% до 30% углеводов. Наличием углеводного компонента в составе молекул можно объяснить высокую термо- и кислотостабилъность фермента. З-Галактозидазы грибов состоят из одной полипептидной цепи с молекулярной массой от 96 до 150 кДа; аминокислотный состав внеклеточных ферментов характеризуется высоким содержанием аминокислот с отрицательно заряженными группами. ПХМБ не оказывает влияния на ферментативную активность грибных р-галактозидаз, что объясняется незначительным содержанием серосодержащих аминокислот в молекулах ферментов. Двухвалентные металлы не влияют на р-галактозидазу из грибов. Для грибных ферментов характерна низкая удельная активность активность, тогда как микробиальные и дрожжевые В-галактозидазы более активны.
В-Галактозидазы из различных видов бактерий отличаются по молекулярной массе, количеству субъединиц, афинности к различным субстратам, рН оптимуму, термостабильности (Таблица 2).
Наиболее охарактеризованная в литературе В-галактозидаза из E.coli имеет молекулярный вес 540 кДа и состоит из четырех субъединиц.
Бактериальные В-галактозидазы, как и дрожжевые, проявляют наибольшую активность в области рН 6.5-7.5, в то время как грибные ферменты в кислой области рН - 3.5-5.0. Но бактериальные В-галактозидазы могут работать и при более низких рН. Например для В-галактозидазы из Criptococcus laurentii 0KN4 оптимальным является рН 4.3 [70]. E.ccli В-галактозидаза проявляет максимальную активность при рН 7.2.
Некоторые В-галактозидазы интересны в плане их термостабильности. Они способны сохранять свою активность при высоких температурах ( от 60С и выше) продолжительное время [37,61]. Например фермент из термофильного анаероба NA10 способен полностью сохранять свою активность при 70С в течении трех часов [82], а В-галактозидаза из S.solfatarius теряла на 50% свою активность лишь после 24 часов ,инкубации при 75С [72]. Максимальную активность этот фермент проявлял при 95С. Такие ферменты как правило имеют два преимущества: они обеспечивают более высокую скорость конверсии лактозы, а системы с иммобилизованными термостабильными ферментами меннее чувствительны к микробиальному загрязнению.
Бактериальные среды и условия культивирования
В работе использовали реагенты фирм "Sigma", "Serva", а также реактивы отечественного производства марки ОСЧ. Для приготовления бактериальных сред использовали реактивы производства фирмы "Difco".
Все эндонуклеазы рестрикции, ДНК-лигаза фага Т4, кленовский фрагмент ДНК-полименразы I были преобретены в НПО "Фермент" (г. Вильнюс). Екзонуклеаза III и Mung Bean нуклеаза приобретены у фирмы "Promega" (США).
Культивирование клонов E.Coll TG1, содержащих плазмиды со вставками хромосомной ДНК Т.ethanollcus осуществляли аеробно при 37С на LB среде или на LB среде, содержащей 1.5% агара. Для обеспечения селективного роста клеток в среду добавляли ампициллин 0.1 мг/мл.
Штамм T.Therohydrosulfuricus 39Е выращивали в строго анаеробных условиях при 65-70С в среде, содержащей К2НР03хЗН20 (0.5 г/л), К2НР03х6Н20 (0.05 г/л), Fe2S04x7H20 (0.025 г/л), мочевину (2 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л), триптон (2 г/л), резазурин (С.002 г/л), натрия тиогликолят (1 г/л), MOPS (5 г/л) и крахмал (5 г/и) как источник углерода.
Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили по методу, описанному в руководстве Маниатиса и др. [65]. Эксперименты, связанные с анализом рекомбинантных плазмид (трансформация клеток Е.coll плазмидной ДНК, рестрикцию, лигирование, электрофорез ДНК в агарозном геле и другие стандартные процедуры) проводили по общепринятым методикам [65].
ДНК из клеток Т.ethanolicus 39Е выделяли из замороженной при -70С биомассы (5-6г). Клеточную биомассу ресуспендировали в 20 мл буфера, содержащего 50мМ трис-HCl, 50мМ ЕДТА, 1% ДДС-Na, 20 мг/мл проназы, 2 мг/мл лизоцима, инкубировали 30 минут при 60С, добавляли 5 мл 5 М NaCl и охлаждали в ледяной бане 30 минут. Суспензию центрифугировали 30 мин. при 5000g. Супернатант дважды обрабатывали фенолом, насыщенным 0,1 М трис-HCl, а затем хлороформом. ДНК осаждали добавлением этанола, выматывали на стеклянную палочку, промывали 70% этанолом и растворяли ТЕ буфере.
ДНК T.ethanolicus частично обрабатывали эндонуклеазои рестрикции Sau3A для получения фрагментов размером 5-Ю т.п.н. по анализу электрофореза в агарозном геле. Фрагменты элюировали из агарозного гэля и лигировали с линеаризированной эндонуклеазои BamHI и дефосфорилированной плазмидой pUC19. Клетки E.coli TG1 трансформировали лигазной смесью. Отбирали клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды.
Для выявления клонов, несущих вставку хромосомной ДНК T.ethanolicus содержащей gal-ген, чашки с выросшими колониями заливали тонклм слоем 0.7% верхнего агара (на чашку неоходимо 5 мл), содержащего 50 мМ PC буфера, рН 6.0, 40 мкг X-gal. Затем чашки инкубировали 1-4 часа при 70С. Клоны, содержащие термостабильную р-галактозидазу приобретали голубую окраску.
Клетки E.coli TG1, трансформированные рекомбинантной плазмидой, культивировали в LB среде с добавлением 100 мкг/мл Ар при 37С в течении ночи. Далее все операции проводились при +4С. Клетки после культивирования центрифугировали, промывали и ресуспендировали в 1/10 первоначального объема 50 мМ PC буферного раствора, рН 6.0 с добавлением фенилметилсульфонилфторида (2мМ). Суспензию помещали в ледяную баню и порциями по 100 мл разрушали с помощью ультразвука на УЗ-облучателе З УЗДИ-ІМ 5 раз по 1-2 мин. Лизаты прогревали 40 минут при 70С и центрифугировали (12000g 30 мин).
К клеточному экстракту E.coli при перемешивании в ледяной бане добавляли насыщенный раствор сульфата аммония до 30% насыщения. Смесь выдерживали в ледяной бане в течении часа и затем преципитат удаляли центрифугированием (30 мин, 6000g,). К супернатанту вновь добавляли насыщенный раствор сульфата аммония до 60% насыщения и оставляли на холоду на 12-24 ч. После центрифугирования осадок растворяли в минимальном объеме 50 мМ PC буфера.
Определение нуклеотидной последовательности гена р-галактозидазы T.ethanolicus
Была проведена серия опытов по иммобилизации (5-галактозидазы. В качестве носителя был выбран альдегидный силохром (Ollne), имеющий размер пор 500 А и площадь удельной поверхности 80 м2/г. Из литературных данных известно, что этот носитель достаточно стабилен при хранении в водных растворах, выдерживает высокие температуры, обладает большой емкостью насыщения по белку [3]. Различные виды модифицированного силохрома использовались для иммобилизации грибных 0-галактозидаз [8,9].
Мы иммобилизировали препарат (5-галактозидазы с удельной активностью 150-300 ед\мг белка, полученный после стадии гель-фильтрации. Наилучшие результаты были получены при соотношении - 7.5 мг белка на 1 г сухого носителя. При этом адсорбировалось на носителе 90-95% белка. Доля сохраненной после иммобилизации активности (5-галактозидазы составляла 75% от активности свободного фермента. Это свидетельствует о том, что связывание идет, в основном, по поверхностным участкам белковых молекул и не затрагивает активного центра р-галактозидазы.
Максимальное насыщение носителя было отмечено после трех часов инкубации фермента с альдегидным силохромом. Активность иммобилизованного фермента составила 1000 ед/г сухого носителя (субстрат pNPaal), что значительно превышает показатели активности иммобилизованных р-галактозидаз A.niger, A.oryzae, Sacharomyces lactis, используемых в настоящее время в промышленном производстве [7,36]. Иммобилизованный фермент в течении месяца оставался стабильным при температуре 4С. Для стабилизации связи между носителем и р-галактозидазой использован боргидрид натрия.
Были исследованы ряд физико - химических свойств иммобилизованной р-галактозидазы. Зависимость активности от рН и температуры показаны на рисунке 10 А,Б. Иммобилизация фермента привела к к сдвигу рН профиля в щелочную сторону: р-галактозидаза проявляля максимальную активность при рН 6.2-6.6 (рН оптимум свободного фермента 5.3 - 6.0) (Рис.ЮА). Сдвиг, по всей видимости, обусловлен изменениями условий функционирования фермента на поверхности носителя. При рН 4.5 сохранялось 80% активности.
Мы не обнаружили критических изменений в температурном оптимуме для иммобилизованной р-галактозидазы. Фермент проявлял максимальную активность при температуре 75-80С (Рис 10Б). Однако, кривая температурной зависимости для иммобилизованного препарата имеет более сглаженную форму. Иммобилизованный Фермент при 85С сохранял 85% активности, тогда как свободный фермент лишь 30%.
Активность фермента при 65С также была выше активности свободного фермента. При этой температуре иммобилизованная р-галактозидаза сохраняла 80% активности, а свободный фермент лишь 50%. Подобные факты свидетельствуют о стабилизации фермента в результате иммобилизации. рН стабильность иммобилизованного фермента изучали, инкубируя препарат в PC буфере при рН 4.6-7.1 и температурах 70 и 75С в течении часа (Рис.10В). Кривые рН-стабильности при 70С для иммобилизованного и свободного фермента практически совпадают. Иммобилизованный фермент оставался стабильным в диапазоне рН 5.0-6.5. 80% эт начальной активности сохранялось при рН 4.6 и 50% при рН 7.0 и температуре 70С.
Термостабильность фермента в результате иммобилизации значительно возрастала (Рис. ЮГ). При 70С иммобилизованный препарат оставался стабильным в течении 14 суток, в то время как свободный фермент терял половину своей активности через 10 часов. После инкубации при 80С в течении 60 минут свободный фермент терял 75% своей активности, иммобилилизованный всего 5%.
Способность иммобилизованной р-галактозиды гидролизовать лактозу оценивали по количеству глюкозы, образовавшейся в процессе пропускания 4% раствора лактозы через колонку (10x30 мм), содержавшую фермент, иммобилизованный на альдегидном силохроме. При температуре 70С и скорости потока 15 мл/час происходит 95% конверсия лактозы в глюкозу и галактозу. Такой "мини-реактор" работал в течении 14 дней без падения скорости конверсии. Его производительность составляла 600 мг лактозы в час.
Таким образом, В-галактозидаза Т. ethanolicus может быть использована в иммобилизованном состоянии для гидролиза лактозы. Активность иммобилизованной В-галактозидазы значительно выше активностей грибных и дрожжевых ферментов, используемых в настоящее время для гидролиза лактозы в промышленности. Препарат стабилен при 70С. Иммобилизованную В-галактозидазу Т.ethanolicus целесообразно использовать для гидролиза лактозы в подсырной сыворотке (рН 6.0) и молоке (рН 6.6). Однако, эксперименты были проведены нами на модельной среде (4% раствор лактозы), и для создания реактора для биотехнологического производства требуются дополнительные исследования с целью отработки условий гидролиза лактозы непосредственно в сыворотке, пермеате или в молоке.
