Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Подходы in vivo (методы, использующие клетки) 9
1.1.1. Фаговый дисплей 9
1.1.2. Дисплей на поверхности клеток 12
1.1.3. «Пептиды на плазмидах» 14
1.1.4. Преимущества и недостатки дисплеев in vivo 15
1.2. Подходы in vitro (бесклеточные методы) 16
1.2.1. Дисплеи, где белок связан с РНК 16
1.2.1.1. Нековалентная связь мРНКс белком 16
1.2.1.2. Ковалентная связь мРНК с белком 20
1.2.2. Дисплеи, где белок связан с ДНК 23
1.2.3. In vitro компартментализация 26
1.2.3.1. Простая эмульсия 26
1.2.3.2. Двойная эмульсия 28
1.2.3.3. Особенности метода in vitro компартментализации 30
1.2.4. Преимущества и недостатки дисплеев in vitro 31
2. Материалы и методы 33
2.1. Штаммы Е.СО//И плазмиды 33
2.1.1. Штаммы E.coli 33
2.1.2. Плазмиды 33
2.2. Микробиологические среды 34
2.3. Трансформация клеток E.coli 35
2.4. Выделение и очистка плазмиднои ДНК 36
2.4.1. Грубое выделение плазмиднои ДНК 36
2.4.2. Очистка плазмиднои ДНК при помощи кипячения в присутствии Мд2+и Трис-НСІ (рН 9,0) 37
2.4.3. Фенольная депротеинизация ДНК 38
2.5. Выделение РНК из светляка Luciola mingrelica 39
2.6. Электрофорез нуклеиновых кислоти белков 40
2.6.1. Электрофорез ДНК и РНК в агарозных гелях 40
2.6.2. Электрофорез ДНК и РНК в полиакриламидных гелях 40
2.6.2.1. В денатурирующих условиях 40
2.6.2.2. В неденатурирующих условиях 41
2.6.3. Электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия 42
2.7. Саузерн-блот анализ 43
2.7.1. Перенос ДНК из геля на мембрану 43
2.7.2. Гибридизация с меченым зондом 43
2.8. Определение концентрации белка -44
2.9. Выделение и очистка термостабильных ДНК-зависимых ДНК-полимераз 45
2.9.1. Получение препарата (НіБ)б-Ри/о-полимеразьі 45
2.9.2. Получение препарата (Ніз)б-Га(7-полимеразьі 47
2.10. Ферментативные реакции 47
2.10.1. Рестрикция 47
2.10.2. Обратная транскрипция (синтез кДНК) 48
2.10.3. Транскрипция 49
2.10.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 49
2.11. Получение экстракта зародышей пшеницы 50
2.11.1. Обработка зародышей пшеницы перед разрушением 50
2.11.2. Разрушение зародышей пшеницы 51
2.11.3. Гель-фильтрация экстракта зародышей пшеницы 51
2.12. Совмещенная транскрипция-трансляция in vitro 52
2.12.1. Транскрипция-трансляция в системе на основе экстракта S30 E.coli 52
2.12.2. Транскрипция-трансляция в системе на основе экстракта зародышей пшеницы 53
2.13. Метод молекулярных колоний 54
2.13.1. Подготовка полиакриламидных гелей 54
2.13.2. Полимеразная цепная реакция в геле 55
2.13.3. Транскрипция в геле 56
2.13.4. Совмещенная транскрипция-трансляция в геле 57
2.13.5. Обнаружение колоний ДНК и РНК 57
2.13.5.1. Перенос нуклеиновых кислот из геля на мембрану 57
2.13.5.2. Гибридизация с меченым зондом 58
2.13.6. Детекция белков, синтезированных в геле 58
2.13.6.1. Детекция по включению радиоактивной метки 58
2.13.6.2. Детекция флуоресценции GFP 59
3. Результаты 60
3.1. Цели и экспериментальные задачи 60
3.2. Разработка ПЦР-версии метода молекулярных колоний 61
3.2.1. Выбор иммобилизованной среды 61
3.2.2. Смесь термостабильных ДНК-полимераз 64
3.2.3. Эффективность переноса днк из геля на мембрану 64
3.2.4. Размножение генов обелина и GFP в виде молекулярных колоний 67
3.3. Клонирование in vitro кДНК люциферазы 69
3.3.1. Синтез и размножение кДНК люциферазы в жидкой среде и в геле 69
3.3.2. Отбор и размножение молекулярных клонов 73
3.4. Транскрипция в молекулярных колониях 74
3.5. Синтез белка в молекулярных колониях 76
3.5.1. Выбор системы транскрипции-трансляции 76
3.5.2. Транскрипция-трансляция в геле 78
3.5.3. Проблема несовместимости условий ПЦР и транскрипции-трансляции и ее решение 82
3.5.4. Экспрессия гена GFP в молекулярных колониях 87
4. Обсуждение результатов 89
4.1. Истинно молекулярное клонирование генов 89
4.1.1. Преимущества бесклеточного клонирования 89
4.1.2. Ген люциферазы: от светляка до индивидуальных молекулярных клонов 90
4.2. Экспрессия генов в молекулярных колониях 92
4.2.1. Новая разновидность генетического дисплея 92
4.2.2. Универсальный способ смены реакционной среды в геле 95
4.3. Перспективы развития метода клонирования генов вне клетки 96
4.3.1. Методы детекции молекулярных колоний 96
4.3.2. Изотермические системы размножения генов 98
4.3.3. Использование бесклеточной системы экспрессии, собранной из очищенных компонентов 99
Выводы 101
- Подходы in vitro (бесклеточные методы)
- Микробиологические среды
- Разработка ПЦР-версии метода молекулярных колоний
- Экспрессия генов в молекулярных колониях
Подходы in vitro (бесклеточные методы)
Одной из ранних разработок является полисомный дисплей (Mattheakis et al., 1994). Авторы помещали набор последовательностей ДНК в бесклеточную систему сопряженной транскрипции-трансляции на основе S30 экстракта E.coli и проводили синтез в течение 30 минут. Реакцию останавливали, добавляя хлорамфеникол, затем при помощи центрифугирования из смеси выделяли полисомы и подвергали их селекции по способности синтезированного пептида связываться с иммобилизованным антителом. Отобранные полисомы разрушали добавлением EDTA, выделяли мРНК и путем обратной транскрипции получали соответствующую кДНК. Набор кДНК использовали для нового раунда селекции либо встраивали в фагмидный вектор и проводили обычное клонирование с использованием живых клеток, после чего полученные индивидуальные клоны секвенировали. По утверждению авторов, разнообразие изучаемой библиотеки составляло 1012 последовательностей. Следующим шагом в развитии этой идеи стало создание рибосомного дисплея (рис. 2; Hanes & Pluckthun, 1997). Изначально этот подход использовали для селекции одноцепочечных миниантител. В рибосомном дисплее новосинтезированный белок также оказывается связан с кодирующей его мРНК посредством рибосомы. При этом мРНК лишена стоп-кодона, что предотвращает терминацию трансляции. Эту модификацию вносили в генную библиотеку на уровне ДНК при помощи ПЦР. Далее путем транскрипции получали набор мРНК, проводили трансляцию течение 10 минут в системе на основе S30 экстракта E.coli, которую затем останавливали, охлаждая реакционную смесь и добавляя хлорамфеникол, а также до 50 мМ ацетат магния, стабилизируя таким образом тройственные комплексы мРНК— рибосома—пептидил-тРНК. Здесь необходимо заметить, что такая высокая концентрация магния создает благоприятные условия для образования неспецифических агрегатов, что может снижать эффективность всей процедуры отбора. Далее образованные комплексы подвергали селекции по способности синтезированного одноцепочечного миниантитела связываться с иммобилизованным лигандом. Отобранные комплексы разрушали добавлением EDTA, и выделенную мРНК подвергали обратной транскрипции и ПЦР. Далее, по аналогии с полисомным дисплеем, полученный набор кДНК использовали для нового раунда селекции или выделяли индивидуальные последовательности с использованием обычного клонирования в живых клетках.
По утверждению авторов, для селекции было использовано 1013 молекул мРНК. Следует отметить ряд моментов, существенных для эффективной работы данной системы. Прежде всего, это тот факт, что для формирования функционально активной конформации в связанном с рибосомой состоянии новосинтезированное одноцепочечное миниантитело должно быть удлинено с С-конца на 116 аминокислотных остатков (Schaffitzel et а/., 1999). Кроме того, спецификой этих белков является наличие дисульфидных связей, для правильного образования которых и, следовательно, для увеличения выхода миниантител в бесклеточную систему необходимо ввести дисульфидизомеразу (Ryabova ef а/., 1997). Рибосомы, «арестованные» на З -конце мРНК, лишенной стоп-кодона, являются мишенью для действия транспортно-матричнои РНК (тмРНК). Эта РНК ответственна за явление транс-трансляции, при котором распадается комплекс мРНК—рибосома—пептидил-тРНК и на С-конец белка добавляется сигнальная последовательность, обуславливающая его специфическую деградацию клеточными протеазами (Keiler et al., 1996). Таким образом, активность тмРНК губительна для рибосомного дисплея. Для ее ингибирования авторы добавляли в бесклеточную систему трансляции олигонуклеотид, комплементарный части тмРНК, кодирующей сигнальную последовательность для протеаз (Hanes & Pluckthun, 1997). Рибосомный дисплей получил широкое распространение: этот подход был реализован с эукариотической системой трансляции на основе лизата ретикулоцитов кролика (Не & Taussig, 1997), а также был использован для селекции ферментов по их каталитической активности, например, р-лактамазы (Amstutz et а/., 2002) и даже ДНК-лигазы (Takahashi et а/., 2005). Японские исследователи сообщили о повышении выхода и специфичности рибосомного дисплея за счет стабилизации комплекса мРНК—рибосома—пептидил-тРНК. С этой целью новосинтезированный полипептид содержал последовательность белка Tat вируса иммунодефицита человека, а в мРНК был включен аптамер против этого белка (Fujita et а/., 2002). В другом варианте были использованы последовательность белка оболочки фага MS2 и специфический РНК-мотив его связывания, «С-вариант» (Sawata & Taira, 2003). Необходимо заметить, что широкие перспективы для рибосомного дисплея открылись с появлением системы трансляции, собранной из очищенных компонентов (Shimizu et а/., 2001). Преимуществами этой системы являются отсутствие примесных активностей и возможность контролировать состав реакционной смеси. В частности, отсутствие нуклеаз, тмРНК и возможность предотвратить терминацию, не добавляя соответствующие факторы, способны обеспечить высокую эффективность и специфичность рибосомного дисплея. 1.2.1.2. Ковалентная связь мРНК с белком Существует ряд подходов, основанных на образовании ковалентной связи между новосинтезированным пептидом и кодирующей его мРНК. Из них наиболее широко известен «мРНК-дисплей», разработанный в лаборатории Шостака (рис. 2; Roberts & Szostak, 1997).
Полученную при помощи транскрипции генной библиотеки мРНК лигировали с дезоксиолигонуклеотидом, модифицированным пуромицином. Для повышения эффективности авторы проводили лигирование в присутствии олигонуклеотида-помощника, комплементарного З -концевой части мРНК и 5 - концевой части ДНК-пуромицинового линкера и удерживающего их вместе. Данная стадия является одной из лимитирующих, и ее выход определяется несколькими факторами. В частности, лигированию может помешать выраженная вторичная структура мРНК, препятствующая отжигу олигонуклеотида-помощника, а также гетерогенность ее З -концевой части, что представляет собой обычное явление для транскриптов, полученных in vitro с использованием ДНК-зависимых РНК-полимераз фагов ТЗ, Т7 или SP6 (Milligan et al., 1987). Как правило, на этой стадии теряется до 60 % последовательностей исследуемой библиотеки (Liu et al., 2000). Далее авторы проводили трансляцию в бесклеточной системе на основе лизата ретикулоцитов кролика. На участке ДНК рибосома останавливалась, пуромицин связывался с ее А-сайтом, и происходила пептидилтрансферазная реакция (Monro & Vazquez, 1967). В результате этой реакции образуется ковалентная связь между новосинтезированным полипептидом и кодирующей его мРНК через ДНК-пуромициновый линкер (рис. 2). Для увеличения эффективности этой реакции авторы рекомендуют после синтеза белка добавлять в реакционную смесь Мд2+ вплоть до 100 мМ и К+ до 500 мМ, а также замораживать образцы, инкубируя их при -20С до 2 суток (Liu et al., 2000). Очевидно, что эти условия являются благоприятными для образования неспецифических агрегатов и приводят к снижению эффективности всей процедуры мРНК-дисплея. По утверждению авторов, максимальный выход реакции формирования ковалентного комплекса мРНК-белок составляет 40 % (Liu et al., 2000). Следует иметь ввиду, что возможно также формирование ковалентного комплекса in trans, то есть между полипептидом и чужой мРНК, пуромициновая модификация которой по каким-либо причинам оказалась в А-сайте данной рибосомы. Результатом отбора такого варианта будет мРНК, не имеющая отношения к белку, проявившему интересующие "исследователя свойства. Ковалентные комплексы мРНК-белок выделяли из реакционной смеси за счет взаимодействия ДНК-линкера с комплементарным ему олигонуклеотидом, иммобилизованным на носителе (Roberts & Szostak, 1997). Далее образцы подвергали обратной транскрипции (рис. 2).
Микробиологические среды
Культивирование E.coli осуществляли в богатой питательной среде LB состава: 1% триптон (Difco), 0,5% дрожжевой экстракт (Difco) и 1% NaCI. рН среды доводили раствором 5 М NaOH до 7,2. Жидкие и твердые среды (содержащие 1,5% агара) стерилизовали автоклавированием в течение 1 часа при 110С и давлении пара в 1 атмосферу. Жидкие среды разливали по 5 мл в пробирки на 30 мл и по 250 мл в колбы на 300-500 мл, твердые - примерно по 20 мл в чашки Петри. Для селекции клеток, содержащих плазмиды, кодирующие р-лактамазу, в среды добавляли ампициллин до 100 мкг/мл. В работе применяли модифицированный метод трансформации с применением хлористого кальция (Sambrook etal., 1989). Для приготовления компетентных клеток использовали свежевыращенную ночную культуру E.coli на чашке Петри. Несколько колоний переносили в жидкую среду LB (из расчета 1 мл среды на одну порцию компетентных клеток) и выращивали при 37С при интенсивном встряхивании до оптической плотности 0,4-0,6 оптических единиц (590 нм). Затем клетки осаждали центрифугированием в течение 3 минут при 3000 об/мин (микроцентрифуга Eppendorf 5415С, Германия). Надосадочную жидкость тщательно отбирали, осадок промывали в 1 мл (1 объем исходной культуры) охлажденного стерильного 100 мМ CaCI2. После повторного центрифугирования в тех же условиях и удаления надосадочной жидкости осадок суспендировали в 100 мкл (0,1 объема исходной культуры) охлажденного стерильного 100 мМ СаСІг и по 100 мкл переносили в новые микроцентрифужные пробирки. Пробирки инкубировали во льду в течение 30 минут. В пробирку со 100 мкл компетентных клеток добавляли плазмидную ДНК (10-15 нг) и инкубировали в течение 30 минут во льду. Затем клетки подвергали тепловому шоку в водяной бане при 42С в течение 2 минут и быстро охлаждали. В пробирку добавляли теплую жидкую среду LB (1 мл) и инкубировали при 37С в течение 1,5 часов. Содержимое пробирки высевали на чашки Петри с агаризованной средой и антибиотиком и инкубировали в течение ночи при 37С. Для получения 5-15 мкг плазмидной ДНК использовали модифицированный метод щелочного лизиса (Birnboim & Doly, 1979), позволяющий избавиться от основной массы хромосомной ДНК.
Клетки из 5 мл ночной культуры Е.со//осаждали трехкратным центрифугированием в 1,7 мл микроцентрифужной пробирке (по 3 минуты при 14000 об/мин [микроцентрифуга Eppendorf 5415С, Германия]). После удаления надосадочной жидкости клетки суспендировали в 200 мкл раствора I (50 мМ глюкоза, 25 мМ Трис-НСІ (рН 8,0), 10 мМ EDTA) с лизоцимом (5 мкг/мл) и инкубировали в течение 20 минут при 37С. Затем к суспензии добавляли 400 мкл раствора II (0,2 М NaOH, 1% SDS), быстро перемешивали и образец инкубировали 5 минут при комнатной температуре. К лизату добавляли 300 мкл охлажденного раствора III (3 М Na-ацетат, рН 4,8) и после тщательного перемешивания смесь центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин (микроцентрифуга Eppendorf 5415С, Германия). К отобранной надосадочной жидкости добавляли 540 мкл (0,6 объема) изопропанола и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Плазмидную ДНК осаждали центрифугированием в тех же условиях. Осадок высушивали и растворяли в 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис-НСІ (рН 9,0), 1 мМ EDTA). Очистку плазмидной ДНК проводили с помощью метода, разработанного в процессе выполнения данной работы (Ugarov et а/., 1999), с небольшими модификациями. Осадок, получившийся после осаждения изопропанолом во время грубого выделения плазмиды (п. 2.4.1), растворяли в 160 мкл буфера ТЕ, содержащего 10 мМ Трис-НСІ (рН 9,0) и 1 мМ EDTA. Отбирали 8 мкл (здесь и далее аликвоты соответствуют 1/20 части исходного образца) для электрофореза (отобранные после каждой стадии обработки аликвоты использовали для оценки возможных потерь и качества препарата методом электрофореза в 1% агарозном геле [п. 2.5.1.]). Добавляли 20 мкл 1 М Трис-НСІ (рН 9,0) и 20 мкл 1 М МдСЬ (до их конечной концентрации 100 мМ). Инкубировали в течение 30 секунд в кипящей водяной бане, охлаждали во льду, центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 минут (микроцентрифуга Eppendorf 5415С, Германия). На этой стадии основная масса белков, РНК и остатков хромосомной ДНК образует агрегаты и осаждается. Супернатант переносили в другую пробирку и отбирали 10 мкл для электрофореза. После этого оставшуюся РНК гидролизовали, инкубируя супернатант в течение 30 минут в кипящей водяной бане. Охлаждали во льду, собирали жидкость центрифугированием в течение 10 секунд (микроцентрифуга Eppendorf 5415С, Германия) и отбирали 10 мкл для электрофореза. Осаждали ДНК спиртом, для чего добавляли 19 мкл З М NaCI (до 300 мМ) и 573 мкл этанола и выдерживали в течение 2,5 часов при -20С. Образец центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин (микроцентрифуга Eppendorf 5415С, Германия), супернатант удаляли и добавляли 300 мкл раствора PSE (свежеприготовленная смесь 55 объемов 300 мМ NaCI и 200 мМ Na-цитрата и 45 объемов этанола; Chetverina et а/., 2002). Пробирки интенсивно встряхивали на качалке Mixer 5432 (Eppendorf, Германия) в течение 1 часа. На этой стадии продукты гидролиза РНК уходят в раствор, а плазмидная ДНК сохраняется в виде осадка. Затем образец центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин (мйкроцентрифуга Eppendorf 5415С, Германия), промывали 300 мкл 70% этанола, снова центрифугировали и супернатант удаляли. Осадки высушивали при комнатной температуре в течение 15 минут и растворяли в 40 мкл буфера ТЕ. 2.4.3. Фенольная депротеинизация ДНК Экстракцию фенолом использовали для удаления белков из растворов ДНК. Образцы ДНК смешивали с равным объемом фенола, насыщенного буфером ТЕ, и перемешивали на миксере в течение 1 минуты. Водную и органическую фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 14000 об/мин (микроцентрифуга Eppendorf 5415С, Германия). Водную фазу отбирали, не захватывая интерфазы. К водной фазе добавляли равный объем хлороформа, перемешивали на миксере и центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин (микроцентрифуга Eppendorf 5415С, Германия).
Для осаждения ДНК к отобранной водной фазе добавляли NaCI до 300 мМ и трехкратный объем этанола. Для формирования преципитата образцы инкубировали в течение ночи при -20С. Осадок собирали центрифугированием в течение 15 минут при 14000 об/мин (микроцентрифуга Eppendorf 5415С, Германия), надосадочную жидкость отбрасывали. Для удаления соли осадок промывали 70% этанолом на миксере, после чего -центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин (микроцентрифуга Eppendorf 5415С, Германия) и отбирали надосадочную жидкость. Осадки высушивали в течение 15 минут при комнатной температуре и растворяли в буфере ТЕ или воде. 2.5. Выделение РНК из светляка Luciola mingrelica Суммарную РНК из высушенных «фонариков» светляка Luciola mingrelica, любезно предоставленных профессором Н.Н. Угаровой (Московский Государственный Университет), выделяли с помощью метода (Chomczynski & Sacchi, 1987). Гомогенизировали 50 мг «фонариков» в ступке в 0,5 мл «денатурирующего раствора» (4 М гуанидинтиоцианат, 25 мМ Na-цитрат (рН 7,0), 0,5% саркозил [N-лаурилсаркозин] и 0,1 М (3-меркаптоэтанол) и переносили образец в полипропиленовую пробирку ёмкостью 2 мл. Далее последовательно добавляли 0,05 мл 2 М Na-ацетата (рН 4,8), 0,5 мл фенола (насыщенного водой) и 0,1 мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (49:1), после каждого добавления перемешивали образец, многократно переворачивая пробирку. Получившуюся суспензию интенсивно встряхивали в течение 10 секунд и помещали на лед на 15 минут. Далее образец центрифугировали в течение 20 минут при 14000 об/мин (микроцентрифуга Eppendorf 5415С, Германия) и 4С. Водную фазу переносили в новую микроцентрифужную пробирку ёмкостью 1,7 мл, смешивали с 0,5 мл изопропанола и инкубировали в течение 1 часа при -20С. Далее образец центрифугировали в тех же условиях, полученный осадок высушивали и растворяли в 0,15 мл «денатурирующего раствора». Затем добавляли 0,15 мл изопропанола и проводили инкубацию в течение 1 часа при -20С. Далее образец центрифугировали в тех же условиях, полученный осадок промывали 75% этанолом, высушивали и растворяли в 0,1 мл 0.5% SDS и 0.1 мМ EDTA. Так как полученный препарат РНК полностью не растворялся, то его трижды обработали фенолом, дважды хлороформом и осадили этанолом (п. 2.4.3). Полученный осадок промыли 96% этанолом и растворили в 0,01 мл 0.1 мМ EDTA.
Разработка ПЦР-версии метода молекулярных колоний
Полимеразная цепная реакция включает в себя многократный нагрев образца до высокой температуры, поэтому в качестве иммобилизованной среды для проведения реакции нами был выбран термоустойчивый полиакриламидный гель. После серии предварительных экспериментов была разработана следующая схема выращивания и детекции колоний ДНК (рис. 4; Chetverina etal., 2002), детально описанная в разделе «Материалы и методы». Молекулярные колонии формируются за счет того, что полиакриламидный гель препятствует диффузии продуктов реакции. Однако при этом он также затрудняет подвижность компонентов реакционной смеси, в особенности высокомолекулярных (например, ДНК-полимеразы или такой огромной молекулы, как рибосомы, имея в виду дальнейшую экспрессию клонов in situ). Для того, чтобы в конечном счете стала возможной детекция продуктов экспрессии отдельных колоний, необходимо было добиться максимальной эффективности всех проводимых в геле реакций. Первым шагом в данном направлении стало сравнение гелей с разными концентрациями акриламида и сшивающего агента (рис. 5). Нас интересовал наименее концентрированный гель, колонии в котором оставались бы компактными. Мы остановились на 5% геле с соотношением акриламид:метиленбисакриламид 100:1. Несмотря на низкую концентрацию, этот гель обладал приемлемой механической прочностью и был способен выдержать без повреждений манипуляции, проводимые в процессе эксперимента. В то же время, колонии в нем были яркими, что отражало более высокое содержание продукта ПЦР по сравнению с самым плотным гелем. Для более точного и эффективного размножения целых генов при помощи ПЦР используют смесь термостабильных ДНК-полимераз из Thermus aquaticus и экстремального термофильного организма, например, Pyrococcus woese/(Sambrook et a/., 1989). Нами была исследована зависимость эффективности размножения гена GFP в геле от концентрации Ptvo-полимеразы, добавленной к Гад-полимеразе. На рисунке 6 показан эффект выбранной оптимальной концентрации Pwo-полимеразы (0,02 нг/мкл) на результат ПЦР в геле. Как можно видеть, использование смеси термостабильных ДНК-полимераз действительно привело к заметному увеличению яркости колоний. 3.2.3. Эффективность переноса ДНК из геля на мембрану Схема проведения ПЦР в геле включает в себя стадию переноса новосинтезированной ДНК из геля на мембрану с целью дальнейшей гибридизации и выявления колоний (рис. 4).
Для количественной оценки эффективности ПЦР в геле необходимо знать, какая при этом доля ДНК оказывается на мембране. Эффективность переноса ДНК из геля на мембрану позволил выяснить следующий эксперимент (рис. 7). Плазмиду рТ70ВЕ-1 с геном GFP (п. 2.1.2) обработали рестриктазой Pvull и получили фрагмент, соответствующий продукту ПЦР (п. 3.2.4). Указанные на рисунке 7 количества молекул этого фрагмента нанесли на сухой гель, затем добились полного восстановления объема геля, пропитав его буфером. Далее провели перенос ДНК из геля на мембрану (п. 2.13.5.1). Эту мембрану вместе с другой, на которую указанные количества той же ДНК нанесли непосредственно, гибридизовали с зондом и получали радиоавтограф (п. 2.13.5). Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что в результате переноса на мембране оказывается не более 10% от всей ДНК, находящейся в геле в молекулярной колонии. 3.2.4. Размножение генов обелина и GFP в виде молекулярных колоний В геле с выбранной концентрацией акриламида и с использованием смеси Taq- и Pwo-полимераз размножали гены обелина и GFP (рис. 8). При этом в случае гена обелина в качестве матрицы была использована плазмида рОИОЗ (п. 2.1.2), линеаризованная рестриктазой Sspl, а в качестве 5 - праймера олигонуклеотид 5 -AACAGCTATGACCATGATTACGAAT-3\ соответствующий последовательности вектора pTZ18U перед Т7 промотором, и З -праймер 5XGATTTAGGTGACACTATAGMGAGAAGCTTAGGGAACTC-3 , комплементарный З -области кДНК обелина. Размножаемый продукт включал в себя Т7 промотор и кДНК фотопротеина обелина из гидроидного полипа Obelia longissima вместе с природной 5 -нетранслируемой областью, которая усиливает синтез белка в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы (Shaloiko etal., 2004). Длина продукта составляла 756 п.о. В качестве зонда использовали радиоактивно меченную РНК, полученную транскрипцией этой же линеаризованной плазмиды. При размножении гена GFP в качестве матрицы использовали плазмиду рТ70ВЕ-1 (п. 2.1.2). Плазмида была обработана рестриктазой Pvull, при этом из нее был вырезан фрагмент, содержащий полилинкер со вставкой гена GFP. В качестве 5 -праймера использовали олигонуклеотид TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATA-3 , соответствующий последовательности вектора pTZ19 перед Т7 промотором, а З -праймера - олигонуклеотид 5 AAGTTGGGTAACGCCAGGGTnTC-3 , комплементарный области вектора pTZ19 после полилинкера. Размножаемый продукт включал в себя под контролем Т7 промотора ген GFP, окруженный б -нетранслируемой областью мРНК обелина и З -нетранслируемой областью сателлитного вируса некроза табака, также усиливающей синтез белка в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы (Shaloiko etai, 2004).
Длина продукта составляла 1570 п.о. В качестве зонда использовали радиоактивно меченную РНК, полученную транскрипцией этой же плазмиды рТ70ВЕ-1, линеаризованной рестриктазои BamHI. В гели вносили указанные на рисунке 8 количества молекул матрицы. Как можно видеть, число колоний пропорционально и близко к числу добавленных в гель молекул матрицы. По сопоставлению с известными количествами плазмидных матриц, непосредственно нанесенных на мембрану, мы определили содержание продукта ПЦР в колонии. С учетом эффективности переноса ДНК из геля на мембрану (около 10%, п. 3.2.3) можно сделать вывод о том, что колонии с геном обелина содержат порядка 109 копий продукта ПЦР (то есть около 1 нг), а с геном GFP - 10s (около 0,2 нг). 3.3. Клонирование in vitro кДНК люциферазы 3.3.1. Синтез и размножение кДНК люциферазы в жидкой среде и в геле С целью демонстрации возможностей разработанного метода мы клонировали кДНК гена люциферазы Luciola mingrelica. В этом случае в качестве исходного материала для клонирования использовали не очищенный препарат плазмидной ДНК, как для генов обелина и GFP, а «фонарики» (светящиеся брюшки) светляка. Из высушенных фонариков Luciola mingrelica (Devine et a/., 1993), любезно предоставленных профессором Н.Н. Угаровой (Московский Государственный Университет), получили препарат суммарной РНК (п. 2.5). В препарате практически отсутствует полоса, соответствующая 26 S рРНК (рис. 9А), что является типичным для препаратов РНК насекомых (Turner, 1977). Далее мы провели обратную транскрипцию с олиго Т)і2-і8 в качестве праймера. Полученную библиотеку кДНК-копий поли(А)-содержащих РНК использовали для размножения при помощи ПЦР с праймерами, специфичными к гену люциферазы. Реакционная смесь содержала 0,02 мкМ первого 5 -праймера (соответствует началу кодирующей последовательности кДНК люциферазы, 5 - TAGGGATTAACTTTACAAGGAGGTATCATATGGAAATGGAAAAGGAGGA-3 ), 0,2 мкМ второго 5 -праймера (перекрывается с последовательностью первого 5 - праймера и содержит последовательность Т7 промотора, 5 - GCTTAATACGACTCACTATAGGGATTAACTTTACAAGGA-3,) и 0,2 мкМ 3 - праймера (комплементарен окончанию кодирующей последовательности кДНК люциферазы, 5 -GCTCTAGATTACATCTTGGCTTGTGGTTTC-3,). Длина продукта составляла 1702 п.о. В качестве зонда использовали радиоактивно меченную антисмысловую мРНК люциферазы, полученную транскрипцией плазмиды pGK2, линеаризованной рестриктазой Xbal (п. 2.1.2).
Экспрессия генов в молекулярных колониях
В данной работе нами было продемонстрировано, что гены можно экспрессировать в молекулярных колониях и по свойствам продуктов экспрессии можно провести скрининг клонов. Отдельно провели первый этап экспрессии генов - транскрипцию in situ. При этом даже для такой большой молекулы, как мРНК люциферазы длиной около 1700 нуклеотидов, выход транскрипции составил не менее 10 РНК-копий на молекулу ДНК. Это означает, что структура геля не подавила синтез за счет ограничения подвижности компонентов реакции. Из этого следует также, что с использованием данного метода можно проводить прямую селекцию молекул РНК с заданными свойствами, таких как рибозимы или аптамеры. Преимуществом предлагаемого нами подхода является то обстоятельство, что молекулярная колония, содержащая интересующую нас РНК, уже содержит соответствующий клон ДНК. Это позволяет избежать необходимость осуществления обратной транскрипции отобранной РНК и клонирования полученной кДНК in vivo. Кроме того, значительное усиление гибридизационного сигнала в результате проведения транскрипции in situ можно использовать для повышения чувствительности обнаружения в геле молекулярных колоний. Успехом увенчался синтез белка в молекулярной колонии и его детекция по функциональной активности. Эксперименты по синтезу белка в геле показали, что бесклеточная система транскрипции-трансляции практически столь же эффективна в геле, как и в жидкой среде. В обоих случаях выход составил около 10 молекул белка на молекулу матричной ДНК. Более того, нет заметной разницы в скоростях транскрипции и трансляции. Эти результаты говорят о том, что даже такая огромная макромолекула, как рибосома, не испытывает серьезных затруднений при синтезе в матриксе геля. Здесь следует отметить, что для повышения эффективности синтеза белка в бесклеточных системах добавляют полимеры, например, полиэтиленгликоль (Kim et а/., 1996; Patnaik & Swartz, 1998). По-видимому, структура полимера определенным образом стабилизирует компоненты трансляционной смеси. Аналогичную роль может играть матрикс геля; в этом смысле экспрессию генов и скрининг по функции кодируемых белков даже предпочтительнее проводить в иммобилизованной среде. На примере зеленого флуоресцирующего белка (GFP) продемонстрировано, что синтезированный в молекулярных колониях белок является функционально активным. Более того, структура геля никак не повлияла на скорость формирования функционально активного белка. Разработанный метод позволяет осуществлять быстрый скрининг большого числа клонов одновременно. Благодаря отсутствию клеточных стенок, мембран, капель водно-масляной эмульсии и т.д. имеется прямой доступ к новосинтезированным белкам, что облегчает и ускоряет тестирование их функции.
Кроме того, исследователь имеет возможность вводить в гель после экспрессии различные реагенты и, таким образом, тестировать специфическую активность клонов в условиях, отличных от условий транскрипции-трансляции. Полученные результаты позволяют рассматривать разработанный метод как новую разновидность генетического дисплея, обладающую рядом существенных преимуществ перед используемыми в настоящее время подходами. В частности, физическая связь фенотипа и генотипа осуществляется за счет того, что ген и соответствующий ему белковый продукт находятся в одной и той же молекулярной колонии. Это позволяет избежать необходимости в модификациях белка, обеспечивающих ковалентную связь с собственной матрицей либо образование с ней нековалентного комплекса (как, например, тройственного комплекса мРНК, рибосомы и пептидил-тРНК в случае рибосомного дисплея [Hanes & Pluckthun, 1997]). Таким образом, нативная структура белкового продукта клонов не будет нарушена. Известно, что бесклеточные системы синтеза белка транслируют только каждую десятую молекулу мРНК, внесенную в реакционную смесь (Pavlov & Ehrenberg, 1996). Это означает, что в результате экспрессии библиотеки, где последовательности могут быть представлены всего в одном экземпляре, часть клонов неизбежно останется вне поля зрения исследователя. В то же время, предлагаемый нами подход обеспечивает размножение каждой исходной молекулы библиотеки в виде молекулярной колонии, которая содержит многие миллионы копий родителя. Следовательно, даже при столь малоэффективном вовлечении матриц в трансляцию проэкспрессирован будет каждый клон. Более того, в результате экспрессии в молекулярной колонии оказывается до 109 молекул белкового продукта данного клона.
Таким образом, белок имеет возможность формировать олиго- или даже мультимерные комплексы, если этого требует проявление его функциональной активности. Хотелось бы еще раз подчеркнуть то преимущество разработанного нами метода клонирования, что исследователь имеет возможность сразу извлечь ген в виде ДНК из молекулярной колонии, содержащей искомый белок. В отличие от большинства традиционных методов селекции in vitro, результатом которых являются последовательности в виде мРНК (например, в случае рибосомного [Hanes & Pluckthun, 1997] или мРНК-дисплея [Roberts & Szostak, 1997]), в нашем случае нет необходимости в последующей стадии обратной транскрипции, которая малоэффективна и в процессе которой РНК-зависимой ДНК-полимеразой могут быть внесены мутации в отобранный клон. Интересно отметить, что в определенном смысле молекулярные колонии можно рассматривать как некие клетки, лишенные Ъболочки. Они представляют собой отдельные компартменты, где происходят биохимические процессы. Их геном представлен многими копиями одного гена, который они реплицируют и экспрессируют. Подобно живым организмам, они добывают из окружающей среды энергию и материал для производства своих компонентов. 4.2.2. Универсальный способ смены реакционной среды в геле Отдельно хотелось бы подчеркнуть значение метода, с помощью которого при выполнении данной работы удалось решить проблему несовместимости условий ПЦР и транскрипции-трансляции. Обработка гелей спиртово-солевым раствором после ПЦР привела к тому, что из них были удалены низкомолекулярные вещества, которые, в частности, ингибировали синтез белка. При этом ДНК осталась в виде таких же компактных колоний, как и без всякой обработки. Таким образом, нам удалось полностью поменять реакционную среду без потери генетического материала. Данный способ можно использовать для того, чтобы в одном и том же геле последовательно проводить несколько реакций, оптимальные условия которых сильно различаются. Например, после размножения ДНК в виде молекулярных колоний становится возможным проводить in situ различные ферментативные реакции - лигирование, модификации ДНК и т.д. К минусам этого метода можно отнести некоторую вероятность вымывания единичных молекул из состава колоний и распространение по всему гелю. Однако, это означает лишь, что после такой процедуры нельзя проводить в этом геле экспоненциального размножения нуклеиновых кислот (иначе колоний в геле окажется гораздо больше, чем истинных молекулярных клонов).
