Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Полиамины в Escherichia coli 8
1.1.1. Эффекты полиаминов in vivo и in vitro 8
1.1.2. Полиамины, представленные в Е.coli 11
1.1.3. Влияние полиаминов на адаптацию Е.соН в условиях стрессов 12
1.1.4. Биосинтез полиаминов 15
1.1.5. Катаболизм полиаминов 20
1.1.6. Транспортные системы полиаминов 27
1.2. Ntr-ответЯ. coli 30
1.2.1. Два пути ассимиляция азота в Е.coli 30
1.2.2. GS активность. Механизм регуляции Ntr-ответа 32
1.2.3. Роль глутамина и а-кетоглутарата 33
1.2.4. Вклад GlnK и AmtB в регуляцию Ntr-ответа 35
1.2.5. Особенности а - зависимой транскрипции 36
1.2.6. Последовательности а54-зависимых промоторов и сайтов связывания NRI 39
1.3. PLP-зависимые аминотрансферазы 41
1.3.1. Группы PLP-зависимых аминотрансфераз 42
1.3.2. Инвариантные аминокислотные остатки аминотрансфераз 44
1.3.3. Эволюционные взаимосвязи между PLP - зависимыми ферментами 45
Глава 2. Материалы и методы 48
2.1 Бактериальные штаммы 48
2.1.1 Получение штамма MG1655ptr+ 48
2.1.2 Получение штаммов MG1655 ygjG и MG1655 ptr+ ygjG 48
2.2 Среды условия культивирования штаммов и приготовление лизатов клеток 49
2.3 Эксперименты с рекомбинантной ДНК 50
2.3.1 Генно-инженерные методики 50
2.3.2 Конструированиерекомбинантных плазмид 51
2.4 Определение старта іранскрипвдга мРНК гена ygjG 54
2.5 Выделение и очистка белков 55
2.5.1 Основные методики оценки препаратов белков 55
2.5.2 Выделение препаратов Ht-ORFl и HI-ORF2 55
2.5.3 Выделение нативного препарата YgjG 56
2.5.4 Определение олигомерной структуры нативного YgjG 57
2.6 Измерение энзиматических активностей ..57
2.6.1 Методы измерения энзиматических активностей 57
2.6.2 Определение основных физических и кинетических параметров препаратов ПАТаз 58
2.7 Программы, использованные для компьютерного анализа 59
Глава 3. Результаты и обсуждение 61
3.1 Идентификация и клонирование гена pat Escherichia coli К12, кодирующего путресцин;а-кетоглутарат аминотрансферазу 61
3.1.1 Идентификация гена, кодирующего ПАТазу, в хромосоме E.coli К12 61
3.1.2 Амплификация 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего структурную последовательность TCHaygfG, в составе мультикопийной плазмиды 63
3.2 Изучение структурной организации 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего регуляторную область и кодирующую последовательность гена ПАТазы 65
3.2.1 Анализ нуклеотидной последовательности ygjG и aer-ygfG межцистронного района 65
3.2.2 Изучение регуляции экспрессии гена ПАТазы 68
3.2.3 Определение старта инициации транскрипции гена ПАТазы 71
3.2.4 Анализ продуктов трансляции orfl и ог/2 74
3.3 Характеристика каталитической активности YgjG (ПАТазы) E.coli 77
3.3.1 Экспрессия и разработка метода выделения белка YgjG 78
3.3.2 Определение олигомерной структуры ПАТазы Л1, coli 80
3.3.3 Характеристика субстратной специфичности и основных физических и кинетических параметров препаратов Ht-YgjG и YgjG 81
3.4 Влияние аллельного состояния гена ygjG на утилизацию путресцина 88
3.5 Поиск гомологов белка YgjG 90
Выводы 95
Список литературы 96
Список используемых сокращений
- Влияние полиаминов на адаптацию Е.соН в условиях стрессов
- Последовательности а54-зависимых промоторов и сайтов связывания NRI
- Среды условия культивирования штаммов и приготовление лизатов клеток
- Изучение структурной организации 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего регуляторную область и кодирующую последовательность гена ПАТазы
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
Полиамины присутствуют практически во всех видах биологических организмов, от бактерий и вирусов до человека, и участвуют в огромном количестве разнообразных биологических и биохимических реакций, включая синтез ДНК, РНК ж белков [1-3]. Исследование клеток прокариот и эукариот показало, что в различных организмах функционируют не только одинаковые соединения полиаминов (чаще всего это путреспин, спермидин, спермин и, существенно реже, кадаверин), но также универсальны и многие этапы биосинтеза этих поликатионов [4,5]. Хотя не вызывает сомнений тот фант, что полиамины выполняют важные физиологические функции и совершенно необходимы для обеспечения нормального клеточного роста, показано, что избыточное накопление полиаминов в клетке ингибирует синтез белков, вызывает замедление роста, а в некоторых случаях приводит к гибели организма [6]. Ацетилирование полиаминов по так называемому ацетилазному пути деградации, помогает предотвратить эффект токсичности полиаминов как в про-, так и в эукариотах [4,7]. Образующиеся при этом ацетилпроизводные полиаминов далее окисляются полиаминоксидазами, деацетилируются, либо экскретируются из клетки [4,8]. У некоторых микроорганизмов охарактеризован также альтернативный аминотрансферазный путь деградации полиаминов.
Наиболее подробно изучен аминотрансферазный путь деградации путресцина в клетках Escherichia coli. Показано, что трансаминирование nyxpecrsHHaj катализируемое путресцин аминотрансферазой (КФ 2.6.1.29), и последующее декарбоксилирование образующегося аминобутиральдешда приводят к образованию у-аминобутирата (GABA), который в дальнейшем преобразуется в сукцинат, включаясь в цикл Кребса [9]. Совокупность реакций биосинтеза путресцина из аргинина и его деградации до сукнината образуют так называемый аргинин декарбоксилазный путь деградации аргинина (ADC) E.coli. Было показано, что все ферменты ADC пути, за исключением аргинин декарбоксилазы, индуцируются в условиях азотного голодания. Однако, несмотря на то, что ADC путь деградации E.coli достаточно хорошо охарактеризован как биохимически, так и генетически, еще не все гены этого пути картированы. Так до сих пор не были локализованы гены, кодирующие ключевые ферменты деградации путреспина -пиридчжсальфосфат (PLP) - зависимую путресциша-кетоглутарат (а-КГ) аминотрансферазу (ПАТазу) и аминобутиральдегид дегидрогеназу (ABADDHa3y). Вследствие того, что уровень активности ПА Тазы даже в индуцирующих условиях азотного голодания чрезвычайно низкий, изучение этого фермента до сих пор проводилось только в мутантных по утилизации полиаминов и GABA штаммах E.coli. Возможно, по этой причине в независимо выполненных работах Kim [10] и Prieto-Sanios [11] приведены противоречивые биохимические характеристики частично очищенных препаратов ПАТаз.
В этой связи актуальной является задача идентификации гена E.coli, кодирующего ПАТазу, с использованием методов биоинформатики и генетической инженерии, выделение нативного фермента и изучение его свойств современными методами молекулярной биологии
ЦЕЛЬ И ЗАДА ЧИ РАБОТЫ
Целью представленной работы являлась идентификация гена E.coli, кодирующего ПАТазу, а также конструирование плазмид, обеспечивающих достаточно высокий уровень продукции этого фермента и определение основных физических и кинетических параметров очищенного препарата ПАТазы.
В процессе работы были решены следующие задачи:
Идентификация гена, кодирующего ПАТазу, в хромосоме штамма E.coli К12 (reRygjG);
Изучение Ntr-зависимой регуляции экспрессии генаyg/G;
Конструирование экспрессионных плазмид, обеспечивающих эффективную продукцию ПАТазы как в виде слитого белка с hise-tag лидерным пептидом (Ht-YgjG), так и нативного белка (YgjG);
Разработка лабораторного метода выделение белка YgjG из растворимой фракции клеточных лизатов рекомбинантного штамма E.coli;
Исследование и сравнительная характеристика каталитических активностей и некоторых основных физических и кинетических параметров очищенных препаратов YgjG и Ht-YgjG.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
Впервые идентифицирован и клонирован ген (ygjG), кодирующий пугресцин аминотрансферазу в клетках Escherichia сой К12. Изучена его структурная организация и выявлены регуляторные последовательности, обеспечивающие <т54 -зависимую индукцию экспрессии ygjG в условиях азотного голодания.
Разработана методика получения высокоочищенного препарата каталитически активного белка YgjG из биомассы рекомбинантного штамма Е.coli.
Показано, что фермент эффективно катализирует путресцин:а-КГ аминотрансферазную реакцию, а также может использовать кадаверин и, с меньшей эффективностью, спермидин в качестве доноров аминогрупп. Фермент термостабилен, активен в щелочном диапазоне значений рН и проявляет максимум активности при рН 9.0 и температуре 70 С. Интересной особенностью фермента является его способность катализировать глутамат:пируват (GPT, КФ 2.6.1.2) аминотрансферазную реакцию. Ни одна из известных к настоящему времени полиамин амінотрансфераз не проявляет GPT активности. Субстратная специфичность и рН зависимость активности YgjG совпадают с параметрами ПАТ азы, выделенной Kim [10] из мутантного по утилизации путресцина штамма Е.соП В6.
Сравнение свойств очищенных препаратов YgjG и Ht-YgjG, несущего дополнительную hisg-tag лидерную последовательность на N-конце белка, показало, что данная модификация N-ісонцевой последовательности влияет на субстратную специфичность и ферментативную активность препарата. Также, элиминация первых 30 аминокислот YgjG приводит к практически полной потере активности фермента.
Полученные в работе данные могут быть использованы для исследования полиамин амшютрансфераз других микроорганизмов и для дальнейшего изучения путей метаболизма полиамидов в Е.соН.
Влияние полиаминов на адаптацию Е.соН в условиях стрессов
Исследования полиаминов как регуляторов клеточного метаболизма показали, что многие переходные процессы в микроорганизмах, наблюдаемые в стрессовых ситуациях, сопровождаются значительными изменениями пула связанных и свободных полиаминов, а также направленностью их транспортных потоков между клеткой и средой.
Так в условиях осмотического шока в клетках E.coli наблюдается [30J резкое снижение концентрации путресциыа (со скоростью порядка 1 нмоль/мин мг сухого веса), коррелирующее с увеличением его концентрации в среде. (При этом не было зафиксировано изменение внутриклеточной концентрации спермидина). Авторы считают, что экскреция положительно заряженных молекул путресциыа, осуществляемая предполагаемым путресцин +/К+ антипортером, способствует поддержанию в клетке баланса зарядов в условиях осмотического шока.
С другой стороны, при полном исчерпании аммония из питательной среды было зафиксировано направленное изменение концентрации полиаминов -интенсивный транспорт полиаминов в клетку [35], сопровождавшийся падением внутриклеточной концентрации калия и увеличением его концентрации в среде. Полагают, что в условиях азотного голодания возможно конкурентное взаимодействие между путерсцином и калием за места связывания с клеточными структурами, осуществляемое путресцин" /К антипортером, описанным выше. Авторы [35] также предполагают, что способность полиаминов стимулировать транскрипцию, связываться с ДНК и оказывать влияние на степень ее суперскрученности позволяет полиаминам выполнять регуляторную функцию в процессах адаптации клеток к стрессу аммонийного голодания и голодания по глюкозе [36].
Опубликован ряд работ, указывающих на то, что наряду с основными системами защиты клеток E.coli от окислительного стресса (регулоны oxyR и soxRS), важная роль в предотвращении повреждения ДНК активными видами кислорода принадлежит также полиаминам, которые благодаря своей поликатионной структуре могут нейтрализовать анионные группы ДНК, вызывая ее конденсацию [37-39]. Наиболее значимыми для защиты клеток E.coli от окислительного стресса поликатионами являются спермин и путресцин.
В современных работах подробно изучается также роль полиаминов в условиях экстремальных значений рН среды. Хорошо известно, что адаптация микроорганизмов в этих условиях осуществляется благодаря активации множества механизмов [40]: от быстрого открывания ионных каналов до более медленной и прецизионно регулируемой экспрессии [41] целого ряда генов, индуцирующихся при щелочных и кислотных рН [42, 43], что позволяет клеткам E.coli, как и другим Neutralophiles, поддерживать внутриклеточный гомеостаз рН в интервале от 7f4 до 7,9 при изменении рН среды культивирования в широком диапазоне значений рН от 5.0 до 9.0 [44].
При изучении механизмов закислення (acidification) и защелачивания (alkalinization) цитоплазмы в ответ на изменение внешнего рН была выявлена корреляция изменения рН среды культивирования с потоком ионов К+ и противоположно направленным потоком путресцина [45, 46]. Авторы полагают, что если исходить из существования антипортера путресцин /К"1", описанного выше, экскреция путресцина играет важную роль в процессе восстановления внутриклеточного депо калия для обеспечения работы К7НҐ антипортера в условиях защелачивания цитоплазмы. При закислении среды нет необходимости в путресцинзависимой системе потребления калия, так как в этих условиях имеет место противоположная направяенность К+/Н+ транспорта. По-видимому, по этой причине, при моделировании кислотной реакции среды не наблюдалось повышения синтеза и экскреции путресцина [46].
Однако согласно последним данным полиамины также влияют на выживаемость клеток E.coli при кислых рН. Было показано, что в условиях низких значений рН индуцируется синтез эндогенного кадаверина, а также синтез лизин/кадаверин антипортера, осуществляющего эффективную экскрецию кадаверина [47]. В последних работах посвященных этой тематике было показано [48], что в кислых условиях эндогенный кадаверин ингибирует работу катионселективного порина ОтрС - пороформирующего белка внешней мембраны грамотрицательных бактерий, обеспечивающего поток питательных веществ в клетку, и тем самым повышает вьикиваемость клеток в условиях кислых рН на минимальной среде. При этом кадаверин не взаимодействовал с анионселективньгм порином PhoE. Наблюдаемое при выращивании на богатой среде 70% снижение проницаемости мембраны в присутствие эндогенного кадаверина не влияло существенно на рост клеток [49]. Авторы полагают, что, по-видимому, для оптимальной адаптации клетки к условиям кислых рН важна сбалансированность influx и effhix потоков, и кадаверин-зависимая регуляция создает условия, в которых не полностью «закрытые» порины обеспечивают необходимый поток питательных веществ в клетку, существенно снижая при этом уровень закислення цитоплазмы.
Последовательности а54-зависимых промоторов и сайтов связывания NRI
Все промоторы, узнаваемые комплексом RNAP o54, имеют консервативные нуклеотидные остатки в области -24 и -12 относительно сайта инициации транскрипции. Анализ 186 последовательностей о"54-зависимых промоторов из различных организмов позволил определить консенсусную последовательность о54 промотора - NstGGcacNsttGC [132]. Дополнительный компьютерный анализ известных а54-зависимых промоторных последовательностей E.coli [113] выявил более протяженную консенсусную последовательность, отражающую частоту встречаемости каждого нуклеотида - A7iA7iNrWT10oGiooGiooCiooA94C7i(A/G)94NrW NT52T94G94C94(A/T)ioo(A/T)ggT7i. Большинство известных на данный момент а54-зависимых генов и оперонов E.coli кодируют транспорные белки: атїВ (аммоний), argT-hisJMPQ (аргинин, лизин, орнитин и гистидин), glnHPQ (глютамин), gabP (GABA), potFGHI (путреснин), а также белки, участвующие в метаболизме азота - gtnK, gfnALG, пас, и в катаболизме аргинина - astCADBE. В таблице 1.2 приведены промоторные последовательности восьми о -зависимых генов E.coli и показаны положения инвариантных остатков «С -12» и «G -24».
В работе Rcitzcr [1 13] был проведен компьютерный анализ генома E.coli и выявлено порядка 25 открытых рамок считывания (ORF), имеющих в нетранслирусмых областях участки высоко гомологичные консенсусної! последовательности с5 4-про мотора. Некоторые из этих генов были также идентифицированы как Nlr-зависимые по результатам DNA-array анализа [89]. Изучение регуляции экспрессии найденных а -зависимых ORF, по-видимому, позволит выявить новые а54-зависимые гены и изучить вклад кодируемых ими полипептидов в процесс адаптации клетки к условиях азотного голодания.
Эффективность инициации транскрипции, как уже отмечалось выше, зависит не только от сродства о -суоъединицьт к промоторнои последовательности, но и от сродства NRI-P к сайту связывания NRI. Сайты связывания с белками- активаторами Ntr-ответа, как правило, располагаются на расстоянии порядка 100-150 нуклеошдов левее промоторной последовательности [111]. Считают, что подобный недостаток сг54 -зависимой транскрипции - необходимость существования протяженных межцистронных районов для обеспечения взаимодействия активатора и холофермента РНК долимеразы по механизму «петли» (Рис. 1.6, [127]), требует большого объема генома, что, по-видимому, ограничивает представленность о54-зависимых генов у прокариот [114].
Консенсусная последовательность NRI-сайта представляет собой инвертированный повтор из 7 птуклеотидов, разделенных, как правило, тремя нуклеотидами [111]. Большинство Ntr-генов имеют два NRI сайта, разделенных несколькими нуклеотидами, при этом в некоторых случаях (например, glnH) эти сайты могут перекрываться. В таблице 1.2 представлены NEI сайты наиболее эффективно экспрессируемых сг54-генов. Несмотря на то, что указанные последовательности обладают различной эффективностью, молекулы NRI P связываются со всеми NRI сайтами даже при низких внутриклеточных концентрациях NRI в условиях роста на средах с достаточным содержанием азота [111]. Было показано, что помимо активирующей функции "NRI может также выполнять роль репрессора: репрессирует два минорных промотора glnALG оперона (glriApl и glnLp) в условиях роста на богатой азотом среде.
Пиридоксальфосфат-зависимые ферменты катализируют огромное число различных реакций, существенно большее, чем любые другие кофактор-зависимые ферменты, и входят, по крайней мере, в шесть классов системы классификации ферментов (КФ) [133]. В соответствии со степенью гомологии аминокислотных последовательностей выделяют три семейства - а, р и у, PLP-зависимых ферментов [134]. Данное разделение коррелирует также с функциональными особенностями этих белков. Ферменты а-группы, за редким исключением, катализируют трансформацию аминокислот, при которой ковалентним изменениям подвергается а-атом углерода, связанный с аминогруппой, образующей альдимин (основание Шиффа) с коферментом. Другие два семейства содержат ферменты катализирующие изменения в р и у атомах углерода, соответственно.
Аминотрансферазы (АТазы) принадлежат к а-семейству PLP-зависимых ферментов и катализируют обратимый перенос а-аминогруппы аминокислоты к а-углеродному атому а-кетокислоты, в результате чего образуется а-кегоаналог исходной аминокислоты, а а-кетокислота превращается в соответствующую а-аминокислоту. Среди PLP-зависимых ферментов аминотрансферазы отличаются огромным разнообразием используемых субстратов, а также наибольшим числом идентифицированных аминокислотных последовательностей, обладающих при этом, как и все другие PLP-зависимые ферменты, низкой степенью гомологии (как правило, порядка 30%). Однако анализ данных о расположении гидрофобных участков полипептидных последовательностей, вторичной структуре белков я применение алгоритма профильного анализа [135], специально разработанного для сравнения последовательностей с низкой степенью гомологии, позволил Mehta и др. [136] построить множественное выравнивание 51-ой последовательности 14 различных аминотрансфераз, количественно оценить степень гомологии и, в соответствии с полученными результатами, разделить ферменты на четыре группы. Предложенная Mehta классификация аминотрансфераз представлена в таблице 1.2. Для ферментов каджой подгруппы характерно использование амино-субстрагов со схожей структурой, однако это соответствие строго применимо только к аминотрансферазам II группы, использующим в качестве субстратов соединения с дистальными аминогруппами.
Среды условия культивирования штаммов и приготовление лизатов клеток
Определение стартового куклеотида мРНК-транскрипта reHajg/G проводили по методу достройки радиоактивно-меченного праймера ("primer extension") [158]. Выделение препаратов тотальной РНК из клеток штаммов TGl(pUC18-ygjG) и TGl(pUC18)j выращенных на богатой LB среде, минимальной среде М9 и на "безазотной" М9 среде с L-ігролином в качестве единственного источника азота, проводили при помощи набора для выделения РНК "RNAsy MiniKit" (Qiagen, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Реакции синтеза кДНК ("primer extension" реакции) проводили, используя 5 мкг полученных препаратов РНК, 0,5 нг радиоактивно меченного при помощи Т4 полинуклеотид киназы (Pharmacia) и у- [33Р]АТР (6000 Ки/ммоль) олигонуклеотида ygjG-prext, 1 mM смеси dNTP и два вида ферментов - рекомбинантную обратную транскриптазу Omniscript (Qiagen) и iTth ДНК полимеразу (РЕ Applied Biosystems), в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей. Синтезированные фрагменты кДНК анализировали в 6% ПААГ, в соседние дорожки геля наносили реакционные смеси секвенировання препарата ДНК pUC18-ygjG с использованием радиоактивно-меченого праймера ygjG-prext. Денатурирующий электрофорез препаратов белков в 10% ПААГ проводили согласно методике Лэммли [162]. Концентрацию суммарных клеточных белков определяли по методу Бредфорда с использованием соответствующего реактива фирмы Bio-Rad, (США) [163]. Количественное определение содержания целевых белков в препаратах проводили путем сканирования прокрашенных в растворе Coomassi-blue R-250 электрофорезных гелей на денситометре CSD-200 (Beckman, США). Выделение препарата Ht-ORFl и Ht-ORF2 проводили из биомассы клеток, полученных при индукции IPTG 50 мл культуры штамма BL21(DE3), трансформированного плазмидой рЕТ-Ht-ORFl и pET-Ht-ORF2, соответственно. Клетки осаждали центрифугированием на центрифуге К23 (Германия) в течение 10 мин. (4000 об/мин, 4 С).
Полученный осадок промывали 500 мл 0.9% раствора NaCl, замораживали и хранили при температуре -70 С, Замороженные клетки (60 мг) ресуспендировали в 7,5 мл буфера В (20 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 1 мМ PMSF) и разрушали ультразвуковой обработкой при 4 С. Нерастворимую фракцию осаждали центрифугированием (15 мин., 14000 об/мин, 4 С). В растворимую фракцию добавляли имидазол и NaCl до конечных концентраций 50 мМ и 500 мМ, соответственно. Полученный препарат наносили на колонку Hisrap (Pharmacia) объемом 1 мл, уравновешенную тем же буфером и промывали колонку 5 объемами буфера В (20 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 1 мМ PMSF, 50 мМ имидазола, 500 мМ NaCl). Элюцию проводили 10 мл буфера С (20 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 400 мМ имидазола, 500 мМ NaCl). Фракцию, содержащую препарат целевого белка (1/7 мл) наносили на колонку Sephadex G-25 (Pharmacia) объемом 5 мл, уравновешенную буфером D (20 мМ К2НРО4/КН2РО4, рН 7.4, 15% глицерина, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF, 10 мкМ PLP), и элншровали тем же буфером. Полученные таким образом препараты Ht-ORFl и Ht-ORF2 замораживали и хранили при температуре -70 С, Выделение препарата YgjG проводилось из биомассы, полученной из 1,1 л индуцированной культуры штамма BL21(DE3)(pET22-ORF2), Выращенные іщетки осаждали центрифугированием, промывали раствором 0,9% NaCl, замораживали и хранили при -70 С. Замороженные клетки (1,8 г) ресуспендировали в 32 мл буфера Е (20 тМ К2НР04/КН2Р04, рН 7.4, 1 мМ EDTA, 1 мМ PMSF, 15 мкМ PLP, 10% глицерин) и разрушали ультразвуковой обработкой при 4 С. Растворимую фракцию клеточных лизатов отбирали и фракционировали последовательным осаждением белков при различных концентрациях сульфата аммония. Осадок, полученный при 35%-65% насыщающей концентрации сульфата аммония, ресуспендировали в 16 мл буфера F (20 mM К2НРО4/КН2РО4, рН 7.4, 5 мкМ PLP, 5% глицерин). Полученный препарат инкубировали при 60 С в течении 7 мин, охлаждали до 4 С и осветляли центрифугированием (20 мин., 14000 об/мин, 4 С). Супернатант наносили на колонку DNA-Grade Bio-Gel Hydroxylapatite (Bio-Rad, США) объемом 1 мл, уравновешенную буфером F. Колонку промывали 4 объемами того же буфера. Элюцию проводили линейным градиентом фосфатного буфера (30 мл 0.02-0.3 М К2НР04/КН2Р04, рН 7.4) в присутствии 5 мкМ PLP и 5% глицерина со скоростью 8 мл/ч.) Фракции, содержащие препарат YgjG, определяли путем измерения ПАТ активности.,Активные фракции, элюирующиеся в интервале градиента от 90 до 125 мМ К2НРО4/КН2РО4 буфера, объединяли и диализовали против 5 объемов буфера F в течение 12 ч. при температуре 4С.
Изучение структурной организации 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего регуляторную область и кодирующую последовательность гена ПАТазы
Как результат компьютерного анализа нуклеотидной последовательности ygjG и aer-ygjG межцистронного района в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) приведены две предполагаемые промоторные последовательности специфичные для ст70 и а54 субъединиц ДНК-зависимой РНК-полимеразы E.coli, соответственно, а также сайт связывания регуляторного белка FIS (Рис. 3.2). В соответствии с этим данными были аннотированы две рамки считывания для потенциального продукта трансляции мРНК (Рис. 3.1, 3.2). Первая из них, описанная выше как ygjG кодирует полипептид размером 496 а.к.о., биосинтез которого возможен только в случае инициации транскрипции соответствующей мРІ-ІК с а -зависимого промотора. Нуклетотидная последовательность ygjG будет обозначаться ниже как orf. Инициация трансісрипции другой рамки - одноименного гена (gi1171884) размером 1290 п.н. (обозначенной нами как orfl), кодирующей тгалтгаептид размером 429 а.к.о. (P42588), возможна с любого из промоторов. Следует отмстить, что если с -зависимый промотор локализован в регулятори ой области гена, то промотор о54 в 5 кодирующей последовательности большей orf yg/ G. Обе рамки имеют классический стартовый кодон AUG. Проведенный нами дополнительный анализ нуклеотидной последовательности района, расположенного слева от предполагаемой последовательности о -промотора [113], выявил потенциальный сайт связывания регуляторного белка IHF и два сайта связывания белка-регулятора Ntr-отвста NRI, участие которых, как известно, необходимо для обеспечения инициации транскрипции а54-зависимой РНК полимеразой Е.соН в условиях азотного голодания [111]. Предполагаемые промоторные послед овательноси, а также сайты связывания регуляторных белков и соответствующие им консенсусные последовательности указаны на Рис. 3.2. Также при анализе нуклеотиднои последовательности, расположенной справа от а54-промотора, была выявлена еще одна возможная рамка считывания, обозначенная нами как ог/2 (Рис. 3.2). Эта рамка кодирует полидептид размером 459 а.к.о., экспрессия которого возможна при инициации транскрипции с каждого из промоторов
Трансляция ог/2 инициируется с редко используемого стартового кодона UUG, что, по-видимому, отражает возможность регуляции скорости биосинтеза белка на трансляционном уровне [175]. Рамки считывания orfl и ог/2 имеют легко узнаваемые потенциальные SD (Shine-Dalgarno) последовательности (Рис. 3.2), расположенные на функционально значимом расстоянии (5-13 оснований) от инициирующего кодона [176], однако, теоретически каждая из трех описанных рамок считывания может транслироваться in vivo. Поскольку в литературе отсутствовали прямые экспериментальные доказательства функционирования обоих промоторов, а данные DNA-array [89] и наши результаты амплификации ygjG в составе мультикопийной плазмиды (см. раздел 3.1.2) можно было рассматривать только как косвенное доказательство в пользу существования а34-зависимого промотора, из представленного выше анализа следовали два вывода, С одной стороны, если транскрипция ПАТазы может инициироваться как с промотора а70 так и с промотора а5 (возможно с разной относительной эффективностью в зависимости от условий роста), то биосинтез соответствующего белка может, в принципе, осуществляться в процессе трансляции всех трех рамках считывания. При этом инициация или реинициация трансляции на стартовых ко донах соответствующих ORF1 и ORF2, возможно, могла бы иметь функциональное значение для регуляции активности фермента в разных условиях роста бактериальной клетки путем образования его изоформ (в данном случае укороченных с N-когща полипептидов). С другой стороны, если реально существует только один промотор а54, то транслироваться могут лишь 0RF1 и ORF2. При этом из-за отсутствия альтернативы в регуляции экспрессии мРНК, активный белок, скорее всего, синтезируется при трансляции только одной из этих ORF. Исходя из сложности структурной организации 1,8-т.п.н. фрагмента, мы сочли необходимым для корректного доказательства соответствия одной из описанных выше рамок считывания гену/ад : 1. провести фушсциональньгй анализ структуры регуляторной области гена, входящей в состав ВатШ-АссШ фрагмента ДНК; 2. идентифицировать рамку считывания каталитичесіш активного полипептида ПАТазы; 3. исследовать ферментативные свойства и кинетичесісие параметры препарата очищенного белка ПАТазы. Для экспериментальной проверки функциональности промоторов а70 и а54 были сконструированы три «гибридные» экспрессионные кассеты, в которых различные участки фрагмента ВатШ-АссШ (Рис. 3.1 и 3,2), включающего регуляторную область гена ПАТазы, были слиты со структурной частью гена-репортера lacZ с собственной SD последовательностью (Рис. 3.3). При этом в разных конструкциях эффективность экспрессии гена р-галактозидазы определялась: а) в случае кассеты I, содержащей полноразмерный ВатШ-АссШ фрагмент регуляторной области ПАТазы, - силой обоих промоторов; б) в случае кассеты П (фрагмент BgR-АссШ) - только активностью промотора а54; в) в случае кассеты III (фрагмент ВатШ-BgU) - только активностью промотора а70. Экспрессионные кассеты были клонированы в составе плазмиды pBRP [161], полученной из pBR322j путем замены EcoRl-Sphl фрагмента ДНК, содержащего промотор тА вместе с 5 -дистальной частью гена устойчивости к тетрациклину ША, на соответствующий EcoRX-Sphl фрагмент полилинкера плазмиды pUC18. В качестве контрольной плазмиды использовали pBR-O/acZ, полученную при клонировании в векторе pBRP только структурной части гена lacZ.
