Клонирование и характеристика мРНК, содержащей повторяющийся элемент В2 и богато представленной в печени мыши Иванов Пвел Леонидович

Содержание к диссертации

Введение

Обзор литературы. Рассеянные повторяющиеся.элементы генома эукариот 8

Общая характеристика рассеянных повторяющихся элементов 9

Длинные рассеянные.повторы: элементы с.варьирующей локализацией 14

Короткие рассеянные повторы ; вездесущие последовательности генома млекопитающих 22

Экспрессия рассеянных повторяющихся.элементов.генома эукариот 36

Экспериментальная часть 49

Материалы и методы 50

1. Бактериальные штаммы и.векторы..для.клонирова-. ния 50

2. Получение поли (А)-содержащей мРНК из клеток асцитной карциномы Эрлиха и.печени.мыши 50

3. Получение ядерной пре-мРНК 53

4. Электрофоретическое фракционирование РНК.в агарозном геле и перенос на ДБМ-фильтры 54

5. Выделение ДНК плазмиды pBR322 55

6. Получение библиотеки клонов кДНК на основе цитоплазматической полиШ^ТРНК печени мыши 57

7. Приготовление.меченых,тест-проб для гибридазации 58

8. Детектирование и отбор рекомбинантных.клонов. Метод гибридизации с колониями 60

9. Выделение рекомбинантной ДНК 63

10. Обработка.ДНК.рестрикционными эндонуклеазами 63

11. Фракционирование ДНК с помощью электрофореза... 64

12. Перенос ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозные фильтры ; блотт-гибридизация. 65

13. Выделение вставочных фрагментов ДНК 66

14. Концевое мечение.32Р.двуцепочечных.фрагментов ДНК 68

15. Разделение цепей ДНК в ПААГ 69

16. Выделение меченых дву- и.одноцепочечных фрагментов ДНК из ПААГ ; 70

17. Определение первичной структуры ДНК 71

Результаты 75

1. Получение библиотеки клонов кДНК на основе цитоплазматической поли(A)*PHK печени мыши и отбор рекомбинантов, содержащих.повторы BI и В2 76

2. Рестрикционный анализ рекомбинантных клонов, содержащих последовательности, го мологичные В-элементам: определение.типа клонированных В-элементов 78

3. Анализ первичной структуры четырех клонированных кДНК, содержащих повторяющийся элемент В2 ; полная копия В2-последовательности представлена в одной из мажорных.полиаденилированных мРНК печени мыши ..;.. 82

4. ВмРНКу - основной тип В2-содержащих мРНК печени мыши. Соседствование повтора В2 и уникальной (слабповторяющейся) последовательности внутри транскрипта ;. 89

5. Универсальная ориентация повторяющихся последовательностей семейства В2 в полисомных и питоплазматических поли(А)+РНК клеток асцитной карциномы и печени мыши 93

Обсуждение результатов 97

Выводы 109

Список литературы 112

• Короткие рассеянные повторы ; вездесущие последовательности генома млекопитающих
• Детектирование и отбор рекомбинантных.клонов. Метод гибридизации с колониями
• Рестрикционный анализ рекомбинантных клонов, содержащих последовательности, го мологичные В-элементам: определение.типа клонированных В-элементов
• Универсальная ориентация повторяющихся последовательностей семейства В2 в полисомных и питоплазматических поли(А)+РНК клеток асцитной карциномы и печени мыши

Введение к работе

Одной из важнейших проблем современной молекулярной биологии является организация и функционирование эукариотичес-кого генома. Центральное место в этой проблеме занимают вопросы, связанные с реализацией генетической информации у высших организмов, которые являются ключевыми для понимания механизмов, определяющих смысл и специфику всех биологических явлений и процессов.

Изучение экспрессии генов эукариот проводится на разных уровнях. Это структурные исследования индивидуальных генов и последовательностей, контролирующих их выражение в онтогенезе, анализ закономерностей функционирования отдельных генов и генных комплексов, изучение организации транскрипционных еда. ниц и биогенеза генных продуктов - как полинуклеотидных, так и белковых.

Исследования транскрипционных единиц млекопитающих выявили в составе ядерных предшественников між (пре-мРНК) специфические взаимокомплементарные последовательности /13,140/. Характерной особенностью данных последовательностей является то, что,по крайней мере,часть из них образует в молекулах пре-мРНК достаточно протяженные двуспиральные участки -"шпильки". Как оказалось, эти внутримолекулярные двуспиральные РНК (дсРНК-В /106/) транскрибируются с "вездесущих" повторов - рассеянных по геному высокоповторяющихся элементов, таких как Alu. -последовательности человека /84/ и семейства В-типа грызунов /107/.

Функции вездесущих повторов неизвестны. Некоторые особенности строения, активная транскрипция и образование своеобразных шпилечных структур в составе транскриптов позволяют

предполагать важную роль этих последовательностей в сплайсинге пре-мНЖ, а также в процессах репликации и реорганизации генома. На возможное участие вездесущих повторов в регуляции экспрессии генов указывает факт их локализации в геноме рядом со структурными генами /161/. Последовательности, гомологичные дсРНК были обнаружены и в составе зрелых мРНК /106,141/, что также может свидетельствовать о связи вездесущих элементов с образованием генных продуктов. Однако природа этой гомологии и структурная взаимосвязь дсРНК и мРНК оставались до настоящего времени неясными. Вопрос об организации повторяющихся элементов в мРНК требовал использования новых подходов. Одним из возможных методических приемов является клонирование комплементарной ДНК (кДНК), полученной на основе мИЖ. Этот метод позволяет исследовать индивидуальные транскрипты, содержащие РНК-копии повторяющихся элементов и выявить особенности их организации, транскрипции и процессинга.

В настоящей работе с помощью данного метода клонирования выделены и исследованы индивидуальные последовательности кДНК, полученные на основе цитоплазматической поли(А)"*РНК печени мыши и соответствующие неидентифицированной мРНК, содержащей повторяющийся элемент В2. Определен размер этой: РНК; показана ее принадлежность к мажорному классу полисомной мРНК печени мыши. Изучение структурной организации клонированной мРНК прямо продемонстрировало соседствование внутри транскрипта уникальной или слабоповторяющейся части и высокоповторяюще-гося элемента В2. Анализ первичной структуры последовательности В2 в составе мРНК показал, что она совпадает с первичной структурой геномной последовательности В2, причем полная копия В2 локализована у 3'-конца клонированной мРНК. Кроме то-

го было установлено, что в этой мРНК, а также во всех видах цитоплазматических и полисомных В2-содержащих РНК клеток печени мыши и асцитнои карциномы Эрлиха РНК-копии В2 представляют лишь одну (относительно направления транскрипции) ориентацию повтора. В этой "канонической" ориентации В2 несет ряд функционально значимых участков, в том числе,сигнал полиаде-нилирования мРНК. Примечательно, что в ядерных пре-мРНК присутствуют копии обеих цепей повторов,.т.е. представлены обе возможные ориентации. Тем самым показано, что в процессе превращения пре-мРНК в зрелые мРНК, а также при созревании всех других типов цитоплазматических В2-содержащих поли(А)"*"РНК происходит специфическая деградация большинства транскриптов, соответствующих неканонической ориентации В2-элемента. Поставлен вопрос о функциональной обусловленности феномена универсальной ориентации В2, представленной в зрелых транскриптах возможным участием этих элементов в терминации и полиаде-нилировании мРНК. В ходе работы предложен метод, позволяющий определять функциональную ориентацию любой клонированной последовательности генома.

Таким образом,получена новая информация об особенностях строения зрелых продуктов транскрипции эукариотических генов, определяемых ходом их специфического процессинга. Результаты, полученные в работе, а также методические приемы, разработанные в процессе ее выполнения могут представлять теоретический и практический интерес для всех дальнейших структурно-функциональных исследований генетического аппарата эукариот.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ РАССЕЯННЫЕ ПОВТОРЯЮЩИЕСЯ ЭЛЕМЕНТЫ ГЕНОМА ЭУКАРИОТ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАССЕЯННЫХ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ЭЛЕМЕНТОВ.

Рассеянные повторяющиеся последовательности ДНК (РП), присутствующие в геномах практически всех эукариотических организмов, объединяют два основных типа повторяющихся элементов, различающихся по длине и относительному содержанию в геноме. Это короткие повторяющиеся последовательности (КРП), длиной в несколько сотен п.н. и длинные повторяющиеся последовательности (ДРП), размер которых обычно составляет более 2 тыс.п.н. Относительное содержание РП обоих типов, а также характер их распределения варьирует в геномах разных организмов.

Как правило, РП не являются точными копиями друг друга; каждый тип включает многочисленные группы и семейства повторяющихся последовательностей, обособленные той или иной степенью внутригрупповой гомологии. Количество семейств РП варьирует в очень широком диапазоне и не коррелирует со сложностью организма. Так, в геноме быка и ряда грибов присутствует менее 10-ти семейств рассеянных повторов, в то время как у многих других эукариот число семейств достигает десятков и даже сотен тысяч /пит. по 15/. Члены одного семейства РП обычно не соседствуют друг с другом и диспергированы в геноме среди повторов других семейств и уникальных элементов /15/.

Фракции КРП и ДРП после реассоциации характеризуются неодинаковой термостабильностью: длинные - более высокой, а короткие - более низкой, что говорит о значительно большей дивергенции последовательностей, составляющих семейства КРП, чем ДРП /73/. В то же время, изучение степени гомологии между короткими и длинными диспергированными повторами показывает,

что в некоторых случаях они могут иметь заметное сходство и не отличаться по спектру частот повторяемости и кинетической сложности /15/. Анализ клонированных повторяющихся участков генома некоторых видов морского ежа /32,38/ подтверждает данную точку зрения и указывает на то, что длинные повторяющиеся последовательности могут состоять из коротких. Одним из примеров таких сложных повторяющихся элементов являются так называемые "перетасованные" (sct-MnbLaa ) последовательности -достаточно протяженные повторы, состоящие из отдельных коротких субэлементов /55,131,167/. Последовательности этого семейства представляют собой определенные, но различные в каждом конкретном случае сочетания из одного и того же набора коротких повторов. Некоторые из этих коротких повторов, выполняющих роль внутренних дискретных участков гомологии перетасованных последовательностей существуют в геноме также и самостоятельно - в виде отдельных диспергированных копий /ІЗЇ/, С другой стороны в ДНК морского ежа S. purpura!us степень взаимной гомологии отличающихся по размерам РП составляет лишь 10-30$ /36,54/, что указывает на то, что в геноме эукариот существуют длинные и короткие РП, не имеющие взаимной гомологии и соседствующие с уникальными последовательностями.

Заметные успехи в изучении РП были достигнуты с введением в исследовательскую практику методов генной инженерии. С помощью клонирования ДНК выделены и детально охарактеризованы многие индивидуальные семейства РП. Выяснилось, что различные копии одного семейства отличаются друг от друга не только за счет нуклеотидных замен, но и за счет инсерций, делений и транслокаций./55,146/.

Рассеянные повторы, относящиеся к одному и тому же се-

мейству могут располагаться в различных хромосомах, однако существуют и такие семейства, члены которых локализуются только в определенных хромосомах или даже в определенных районах хромосом. Примером такого избирательного расположения повторов служит одно из семейств РП человека (с частотой повторяемости приблизительно 600) /ИЗ/. Это семейство встречается только в определенных районах Y-хромосомы, где перемежается с другими повторяющимися последовательностями.

Расположение в геноме по крайней мере части РП строго не фиксировано и может меняться в фило- и онтогенезе. Такие последовательности получили название генетических элементов с нестабильной локализацией /61,85,163/. Подобные мобильные элементы, имеющие сходство с бактериальными транспозонами и IS-элементами обнаружены у одноклеточных эукариот и высокоразвитых многоклеточных организмов /см.З/.

В настоящее время высказывается мнение, что большинство эффективно транскрибирующихся РП относится к мобильным генетическим элементам, которые, по-видимому, являются важной общей структурной деталью всех эукариотических организмов /8/. Существуют предположения об участии этих элементов в процессах, связанных с репликацией и реорганизацией генома, регуляцией экспрессии генов, канцерогенезом.' Они могут играть роль в определении ряда количественных характеристик, например,имеющих отношение к жизнеспособности индивидуумов /77/.

Члены многих семейств РП, как коротких, так и длинных встречаются в геноме в виде копий, имеющих взаимопротивоположную ориентацию /44/. Совокупность таких обращенных или инвертированных повторов (0П) составляет чрезвычайно быстро ренатурирующую фракцию ДНК при С_пі < I0""⁴) /170/. При реас-

соодации ДНК, содержащей Oil, взаимокомплементарные последовательности, находящиеся в одной цепи_; образуют своеобразные структуры, получившие название "шпилек". Электронномикроскопи-ческие исследования шпилечных структур показали, что во многих случаях ствол шпильки (спаренный участок) заканчивается однонитевой петлей /170/. Это говорит о том, что обращенные копии чаще всего разделены какой-то иной последовательностью. ОП, не образующие при отжиге петли,называются палиндромами.

У разных организмов длинные и короткие РП характеризуются различным относительным содержанием обращенных копий. Так,у человека, дрожжей, пшеницы преобладают короткие ОП - в несколько десятков и сотен нуклеотидов, а у дрозофилы, каймана и черепахи - длинные, достигающие размеров в несколько тысяч п.н. /15/. Последовательности, разделяющие в геноме две обращенные копии по длине очень гетерогенны: от 10^ до > І0і,н, Средние их размеры у большинства организмов находятся в интервале (1-6)хЮ³ п.н. /15/.

Биологическое значение феномена обращенных повторяющихся последовательностей в настоящее время остается невыясненным. Имеются работы, где показано, что значительная часть ОП транскрибируется в составе пре-мРНК /см.IS/. Большое количество и разнообразие их в ДНК, а также их транскрибируемость позволяют предположить, что эти последовательности представляют собой важную, но функционально гетерогенную группу структурных элементов генома эукариот. Возможно, образующиеся в молекулах-предшественниках различных видов РНК шпильки,служат сигналами для ферментов, осуществляющих их процессинг и сплайсинг /95/. Существуют предположения об участии шпилек в качестве сигнальных структур для ДНК-полимеразы /23/ и РНК-

полимераз /130/. Инвертированные повторы, находящиеся на концах элементов с нестабильной локализацией в геніже, вероятно необходимы для перемещения этих элементов вдоль ДНК /21,86/.

ДЛИННЫЕ РАССЕЯННЫЕ ПОВТОРЫ: ЭЛЕМЕНТЫ С ВАРЬИРУЮЩЕЙ ЛОКАЛИЗАЦИЕЙ»

К этому типу относятся РП эукариотического генома, кото-г-рые достигают значительной длины ~ их размер в среднем составляет несколько тысяч п.н. Они объединяются в многочисленные семейства, характеризующиеся разной степенью дивергенции последовательностей-копий и представляющие как самостоятельные классы повторяющихся последовательностей, так и повторы, имеющие внутренние области гомологии с некоторыми представителями КРП.

Большинство ДТП характеризуется весьма сложной структурной организацией. Некоторые из них, как уже упоминалось выше, состоят из коротких повторяющихся субэлементов, которые в разных сочетаниях образуют различные длинные повторяющиеся участки, известные как "перетасованные" последовательности. Это было непосредственно показано на клонированных ДТП дрозофилы, курицы и некоторых видов морских ежей /55,131, 167/. ДТП крысы также состоят в основном из отдельных коротких повторяющихся элементов /171/. Во многих других случаях в составе ДТП обнаруживаются характерные участки внутренней гомологии, могущие иметь различную ориентацию. По существующим оценкам 16-17$ ДНК дрозофилы состоит из ДРП, которые образуют приблизительно 70 семейств последовательностей. Представительность различных семейств варьирует от 3 до 100 копий на гаплоидный геном /163/.

Клонирование последовательностей, активно транскрибирую-

щихся в клетках дрозофилы и ответственных за синтез поли(А)-содержащих РНК привело к открытию длинных - в несколько тысяч пар нуклеотидов - повторов ДНК, имеющих варьирующую локализацию на хромосомах разных линий дрозофилы /61,85/. Различия в локализации наблюдались также, хотя и в меньшей степени, между индивидуумами, принадлежащими к одной и той же линии. На основании этих данных, подтвержденных позднее в ряде других работ, было высказано предположение,: что обнаруженные семейства повторов являются подвижными, мигрирующими элементами генома и для их обозначения был предложен термин "мобильные диспергированные гены" (ВДГ) /4,17/. ВДГ-подобные элементы найдены также в геноме дрожжей и млекопитающих /30, 71,72/, что позволяет считать их универсальными компонентами генома эукариотических организмов.

Мобильные ДТП, впервые описанные в геноме дрозофилы,характеризуются следующими основными свойствами. Это протяженные повторы длиной 5-8 тыс.п.н., представленные в геноме от 10 до 100 копиями и рассеянные по всем хромосомам дрозофилы, причем локализация их в хромосомах.разных линий мух варьирует. Число обнаруженных семейств ЩГ составляет сейчас 15-20 и, следовательно, общее число таких элементов в геноме достига-ет 10 или около Ъ% от всего генетического аппарата /4,8/. Все копии одного и того же семейства ЩГ весьма сходны друг с другом по рестриктным картам.

Особый интерес представляет структурная организация ВДГ. Каждый элемент фланкирован с обеих сторон прямыми повторами длиной 300-600 п.н. /21,61,72,118,159,164/, получившиминазвание длинных концевых повторов (ДЕСП). Изучение первичной структуры ДКП /21,118,148,169/ показало, что в составе одного эле-

мента оба ДКП (левый и правый) являются точными копиями друг друга. При сравнении ДКП из разных элементов одного семейства было показано, что они могут несколько различаться (заменой оснований, вставками, делециями). В начале и конце каждого ДКП имеются не вполне совершенные обращенные повторы. Наконец, сразу перед левым ДКП и после правого ДКП обнаруживаются короткие прямые повторы (~5 п.н.), происходящие, по-видимому, за счет дупликации последовательности-мишени в месте внедрения МДГ в хромосомную ДНК /12/. Подобная организация характерна для концевых фрагментов большинства бактериальных транспо-зонов /29/.

Помимо аналогии с транспозонами ВДДТ имеют очень много общих черт с проретровирусами птиц и млекопитающих. Это касается их структурной организации, характера транскрипции, строения ДКП. Предполагается, что эти элементы имеют одну и ту же природу /4,8,64/.

В нескольких различных ВДГ в области стыка одного из ДКП и внутренней части элемента обнаружена полностью идентичная последовательность длиной в 35 нуклеотидов, комплементарная 3»-концевой части одной из клеточных тРНК, а в области стыка с другим ДКП выявлен обогащенный пуринами аналогичный участок полной идентичности длиной 18 п.н. /12,169/.

Как известно, затравкой для синтеза " - "-цепи реплика-тивной ДНК ретровирусов служит одна из тРНК, комплементарная участку ДНК провируса на границе с одним из ДКП, а для инициации " + "-цепи существенным является полипуриновый блок, расположенный у границы с другим ДКП /121/.

Прослеживаемая аналогия позволяет думать, что, по крайней мере, для некоторых мобильных элементов генома эукариот

их амплификация, а,следовательно, и инсерция осуществляется способом, аналогичным тому, который имеет место у ретровирусов, т.е. через обратную транскрипцию соответствующих РНК. Далее, при инфекции ретровирусами удается выявить в клетках кольцевые репликативные формы вирусной ДНК /160/. Аналогичные кольцевые молекулы, содержащие ВДГ были выделены из клеток культуры дрозофилы /63/. Кольцевые ДНК, гомологичные РП генома были обнаружены также у других эукариот /156/.

Происхождение экстрахромосомных копий мобильных элементов генома остается,однако, неясным. Это могут быть саморегулирующиеся плазмиды, продукты обратной транскрипции соответствующих РНК, представляющие собой промежуточные фазы транспозиции, а также продукты непосредственного выщепления из генома, связанного с гомологичной рекомбинацией между двумя ДКП /цит. по 94/.

Б геноме дрожжей также обнаружены мобильные элементы. Это так называемая последовательность Туї /30/. Ее длина составляет приблизительно 5,9 тыс.п.н. и,подобно ВДГ дрозофилы, на своих концах она несет ДКП, обозначенные как $ -элементы. Длина 8 -последовательностей - около 340 п.н. На гаплоидный геном дрожжей приходится около 35 копий Туї. Ч&сло S -последовательностей немного выше: наряду с 8 , входящими в состав Туї и обрамляющими ее, встречаются так называемые "соло" о , то есть одиночные, не связанные с Туї 8-последовательности /30/.

Использование моноклональных линий дрожжей позволило показать относительно высокую частоту перемещений Туї в геноме. Так, В 2-х случаях из 5-ти после непрерывного месячного роста культур были обнаружены перемещения одной копии

Туї в геноме /ЗО/. Анализ первичной структуры 8 показал, что в ней обнаруживаются (в обеих цепях) сигналы инициации транскрипции, а в одной из цепей - последовательность для полиаде-нилирования /68/. В S -последовательностях, видимо, находятся промоторы и терминаторы считываемых с Туї поли(А)⁺РНК /59/.

Вскоре после открытия ВДГ, в геноме дрозофилы были обнаружены ДТП, которые также имеют варьирующую локализацию в хромосомах, но устроены иначе, чем МДТ. Они характеризуются наличием протяженных обращенных повторов на своих концах, и поэтому получили обозначение IB (foLd-ba.ck ) /132/. НЗ-се-мейство охватывает примерно 30 чрезвычайно гетерогенных по длине последовательностей (0,4-4,0 тыс.л.н;). Общим для них является наличие гомологичных участков на концах - в области обращенных повторов. Протяженность последних также варьирует в широких пределах от 0,2 до 1,3 тыс.п.н.

Участок, заключенный между обращенными повторами, и условно называемый петлей, не является обязательной составной частью ЕВ-элемента. Возможно, что в некоторых случаях он соответствует участку генома, захваченному ИЗ-элементом при его транспозиции.

Предполагается, что последовательность, расположенная между двумя 0П, присущая элементу ЕВ-4 кодирует так называемую транспоазу - гипотетический фермент, специфически узнающий концевые участки транспозонов и принимающий участие в их переносе в новые места генома. Эта последовательность, имеющая длину около 1700 п.н. многократно повторяется в геноме ' дрозофилы либо в окружении 0П, либо без них и имеет в своем составе блок Хогнесса, усилитель (см. далее), сигнал полиаде-нилирования транскрипта, а также открытую рамку считывания

для синтеза белка длиной в 148 амк /132/.

Сами ОП FB-элементов весьма консервативны по первичной структуре, однако в их строении наблвдаются некоторые необычные черты. Так, аналогичные концевые последовательности нескольких ЗШ-элементов на протяжении первых 200 нуклеотидов практически идентичны друг другу. В то же время ОП, входящие в состав одного ЇВ-злемента обладают несравненно меньшей гомологией: в них встречаются как точечные замены, так и выпадения целых блоков. "Левый" и "правый" ОП могут отличаться друг от друга по длине на 200 н. /132/.

В этом отношении ОП SB-элементов принципиально отличаются от ДКП ЩГ, что, по-видимому, указывает и на совершенно различный механизм транспозиции этих подвижных элементов.

В последнее время особый интерес вызывают так называемые Р-элементы генома дрозофилы, способные при определенных условиях перемещаться по геному с очень большой частотой /16/. Эти элементы обнаружены в некоторых диких линиях (Р-линии), где насчитывают от 30 до 50 копий.

Р-элементы вызывают множественные мутации инсерционной природы в потомстве, полученном от скрещивания Р-линий с линиями, не имеющими этого элемента. В самих Р-линиях перемещения Р-элементов, по-видимому, заблокированы репрессор-ными системами.

Р-элементы подобно КЗ-элементам гетерогенны по длине (0,5-3,0 тыс.п.н.), но на концах несут совершенные прямые повторы длиной в 31 п.н. /155/. По-видимому, именно они обеспечивают интеграцию Р-элементов в геном, являясь участками узнавания предполагаемой Р-специфичной транспоазы. Ряд данных свидетельствует о том, что транспоаза кодируется пол-

ным Р-элементом длиной 3 тыс.п.н.: так, Р-элементы меньшего размера могут интегрироваться в геном только в присутствии полного Р-элемента /139,155/. Примечательно, что Р-элементы могут быть использованы как весьма эффективные векторы - с их помощью удается вводить в геном различные клонированные гены /139/.

В геноме человека несколько групп исследователей обнаружили одно доминирующее семейство ДРЇЇ, обозначенное как Кри 1-се-мейство: обработка тотальной ДНК эндонуклеазой Кркі выявила характерный набор повторяющихся последовательностей длиной 1,2, 1,5, 2,8, 3,4, и 4,6 тыс. п.н., которые в некоторых случаях являются субэлементами более длинных повторяющихся единиц /18,98,120,149/-, последние обнаруживаются в различных участках Х-хромосомы и аутосом человека /149/. Одна из них, длинной 6,4 тыс.п.н., повторяющаяся в геноме (3-5)х10 раз была найдена на расстоянии 3 тыс.п.н. от З'-конца^-глобинового гена человека /18,98/. Этот элемент, а также несколько других в определенной степени дивергированных клонированных копий данного повтора оказались гомологичными членам Крп 1-семейства африканской зеленой мартышки. По всей видимости, это семейство ДРП является общим для приматов /120/.

Крп. 1-последовательности обнаруживают значительную степень дивергенции, причем представленность различных вариантов весьма различается в геномах обезьяны и человека. Существуют данные, что число копий этого семейства различается у разных индивидуумов; кроме того, на концах Крп 1-последовательностей найдены прямые повторы /88/. Все это может служить указанием на возможную мобильную природу этих элементов.

Использование явления симметричной транскрипции ВДГ, об-

наруженное в случае дрозофилы /17/ (см. далее) позволило выявить типичные мобильные повторы в геноме мыши. ДЖ геномных клонов гибридизовали с дсРНК А-типа, обнаруживаемыми в составе пре-мРНК и представляющими собой межмолекулярные РНК-дуплексы длиной более 400 п.н. /106/. Среди отобранных "положитель-ных"клонов наиболее детально были изучены последовательности, обозначенные как AI и А2, представленные в геноме соответственно I0³ и 2хЮ⁴ копиями /72/. Интересно, что разные линии и виды мышей сильно различаются по количеству копий А-элементов /112/.

Рестрикционное картирование последовательности AI длиной 5,6 тыс.п.н, показало, что она весьма напоминает гены т.наз. интерпистернальных А-частиц, т.е. один из классов эндогенных ретровирусов мышей. А-последовательность, как оказалось, соответствует известному мажорному семейству т.наз. ЕсоРІ-повто-ров, составляющих от I до 3% генома мыши /27/. Эти повторяющиеся сегменты длиной 1,3 тыс.п.н., выявляемые после обработки тотальной ДНК мыши эндонуклеазой ЕсоКЕ являются частью более длинных повторяющихся последовательностей размером 5,6 тыс. п.н. /124/.

В лаборатории Георгиева /72/ было показано, что область гомологии между разными геномными копиями А2 еще шире и достигает 7 тыс.п'.н. При этом разные копии А2 (и в меньшей степени AI) различаются между собой гораздо сильнее, чем ВДГ дрозофилы. Особенно гетерогеннвй является 5»-область AI, равно как и концевые участки А2. На концах AI и А2 присутствуют ДКЇЇ, длиной соответственно 400 и более I тыс.п.н. /35,72/.

Недавно было показано существование в клетках асцитной карциномы Эрлиха кольцевых молекул ДНК, представляющих собой

полноразмерные копии AI /72/. Это означает, что в недифференцированных клетках происходит не только транскрипция AI, но также, по-видимому, и обратная транскрипция соответствующих РНК, которая может быть связана с механизмом транспозиции А-элементов в новые места генома.

Следует, однако, заметить, что не все случаи транспозиции ГДЦГ и им подобных элементов могут быть связаны с обратной транскрипцией. Элементы типа обращенных повторов, по-видимому, реплицируются с помощью особых механизмов - например, путем непосредственного вырезания и встраивания в новые участки генома /6,155/.

Транспозиции мобильных элементов происходят, очевидно, весьма редко. Однако, в определенных условиях, частота внедрения, например, ЩГ дрозофилы в новые места генома может резко возрастать /I/. Хотя точные значения неизвестны, вероятность неактивированного переброса ЩГ оценивается величиной 10 . По-видимому₇ более часто происходит перемещение (причем истинное перемещение) последовательностей с ОН на концах, однако, во всех случаях важная роль принадлежит различным клеточным факторам /6,24/.

КОРОТКИЕ РАССЕЯННЫЕ ПОВТОРЫ ; ВЕЗДЕСУЩЕ ПОСВДОВАТЕШОСТИ ГЕНОМА МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

Другим основным классом РП генома являются короткие повторы длиной 100-300 п.н. /8,94,152/. Они объединяют несколько индивидуальных семейств повторяющихся последовательностей

с весьма различным числом копий. Некоторые семейства насчитаем вают до 5x10^ членов, тогда как другие образованы всего несколькими .копиями.

Первоначально количество семейств КРЇЇ и частота повторяемости их членов оценивалась лишь весьма приблизительно на основании анализа кинетики ренатурации геномной ДНК, Интерпретация таких данных сильно осложняется тем обстоятельством, что многие семейства КИТ представлены родственными, но индивидуально различающимися членами, скорость гибридизации которых отличается от скорости ренатурации полностью комплементарных последовательностей. С другой стороны, члены разных семейств КШ в некоторых случаях обнаруживают степень гомологии,достаточную в определенных условиях для перекрестной гибридизации /94/. Изучение свойств индивидуальных фрагментов ДНК, полученных с помощью методов генной инженерии, позволило значительно уточнить имеющиеся сведения.

Клейном и сотр. /104/ были исследованы 18 различных клонированных повторов генома морского ежа. Число копий этих последовательностей составляло от 3 до 12500. Для 13 последовательностей не выявилось заметной дивергенции внутри образуемых ими семейств, в то время как для остальных 5 дивергенция среди родственных копий обнаруживалась. Оцениваемая ; частота повторяемости одного из клонированных повторов зависела от жесткости проводимого гибридизационного эксперимента и составляла от 20 до 400 копий на гаплоидным геном. Это указывает на существование по крайней мере 10-20 индивидуальных подсемейств данной последовательности в геноме морского ежа /146/. В противоположность этому, гибридизационный анализ наиболее представительного семейства КРП человека - ALu.-ce-мейства, насчитывающего свяше 300 тыс. членов (см* далее), не выявил наличия в нем явно выраженных подсемейств /135/. Биологическое значение различий в степени консервативности

разных семейств КРП неясно. Не исключено, что они отражают различия в механизмах амплификации и дисперсии разных представителей КРП.

Следует также заметить, что факт наличия структурных подсемейств не обязательно отражает функциональную гетерогенность последовательностей данного семейства. Можно предположить, что члены более консервативных семейств или являются эволюционно более "молодыми" или по какой либо причине испытывают более жесткое давление отбора, стабилизирующего структуру последовательностей данного вида.

Работы по клонированию коротких повторов млекопитающих были начаты параллельно с исследованием МДТ дрозофилы. Было показано, что по крайней мере у приматов и грызунов КРП в отличие от таковых морского ежа объединяют весьма небольшое число семейств /57,93,107,137/.

В 1979 г. ряд индивидуальных КРП был клонирован в составе бактериальных плазмид. Так, Крамеров и сотр. /107/ провели отбор геномных клонов мыши, гибридизующихся с дсРНК В-типа /106/. Эти внутримолекулярные двуспиральные участки РНК были открыты в 1972 г. в составе пре-мРНК, причем,в отличие от межмолекулярных дсРНК-А,дсРНК-В короче (100-200 п.н.) и способны очень быстро ренатурировать после денатурации пре-мРНК, благодаря способности образовывать структуры типа шпильки /см.13/. Выделенные после обработки РНК-азой дсРНК-В уже могут быть денатурированы, так как при этом уничтожается петля, соединяющая взаимокомплементарные копии. Полученный таким образом меченный материал и был использован в качестве тест-пробы для гибридизации со случайным набором геномных клонов мыши.

Было установлено, что все множество клонов геномной ДНК

мыши, гибридизующихся с дсРНК-В, распадается в основном на 2 индивидуальных семейства, оказавшихся доминирующими в геноме грызунов и получивших названия BI- и В2-семейств /107/. ЕЕ- и В2-элементы составляют соответственно половину и четверть всей дсРНК-В. Каждое из этих семейств представлено в геноме мыши примерно 5х10⁴ копиями. Это наиболее часто встречающиеся КРП. Почти каждый клонированный фрагмент геномной ДНК, имеющей длину 10 тыс.п.н., содержит в своем составе повторяющиеся элементы В-типа. Наличие BI-последовательностей показано с помощью ' гибридизационных методов в ДНК всех исследованных грызунов /9/. Описаны аналоги повтора В2 в геноме хомяка /81/ и в составе второго интрона гена соматотропина крысы /128/. Продемонстрировано соседотвование последовательностей типа BI и В2 со стук-турными генами /161/. Все это дает основание называть В-эле-менты "вездесущими" повторами грызунов.

BI- и В2-элементы встречаются в геноме во взаимокомплементарных ориентациях. Наличием обращенных В-копий видимо объясняется происхоадение большинства внутримолекулярных шпилечных структур в гяЕНК. Последовательности-копии каждого из В-се-мейств не идентичны друг другу: отклонение от усредненной последовательности составляют около 8% /109,110/.

Длина усредненной-последовательности BI составляет 130 п.н. В их число не входит протяженная зона, богатая А'Т-пара-ми, которая всегда примыкает к BI-элементу, но различается по структуре и длине каждой конкретной его копии. Нуклеотидную последовательность этой зоны можно описать формулой А_хС_у,

где х равен 3-7, а у равен 1-2. Поскольку в разных копиях BI эти участки сильно варьируют по длине и нуклеотидной последовательности, их нельзя рассматривать как часть повтора.

B2 по длине превосходит BI и насчитывает 190 п.н. В отличие от BI, А'Т-концевая зона В2-последовательности весьма консервативна по структуре и ее можно считать частью повторяющегося элемента. BI- и В2-последовательности содержат в своем составе целый ряд примечательных участков, например, области гомологии с усредненными экзон-интронными (и наоборот) пограничными зонами, а также с усредненной последовательностью расчлененного промотора РНК-полимеразы Ш, установленной на основе анализа промоторов генов 5S рРНК и тРНК /65,69/. Последнее обстоятельство указывает на то, что повторы В-типа могут транскрибироваться РНК-полимеразой Ш. В BI, кроме того, имеются протяженные области гомологии с двумя малыми клеточными РНК - 4,5S РНК и 7S РНК и с участками начала репликации вирусов группы папова /10,93/, а в В2 - с малой ядерной РНК, обозначаемой как 4,5SPHKI/II0/.

Представляет интерес организация 3'-конца нуклеотидной последовательности В2. Она содержит до 4-х блоков ААТААА, которые, как известно, являются сигналами для полиаденилирования мРНК, а также последовательность TGTTT, часто соседствующую с участками терминации транскрипции РНК-полимеразы Ш /65/.

В геномах китайского хомячка и крысы было обнаружено семейство КРП В2-типа /81,82,128/. Интересно, что первые 61 нуклеотид этой последовательности соответствуют дивергирован-ному участку нуклеотидной последовательности между 47-м и 107-м нутслеотидами BI-элемента мыши.

Примерно в одно время с открытием В-семейств КРП грызунов в лаборатории Шмида /84/ было показано, что в геноме человека доминирует одно наиболее представительное семейство КРП, на долю которого приходится от 30 до 50$ всех КРП чело-

века. Электрофоретическое фракционирование денатзгрированной ДНК плаценты человека, подвергнутой отжигу при низких значениях C_Qt и обработанной затем экзощгклеазой SI выявило наличие дискретной полосы размером приблизительно 300 п.н. Более 60$ полученных таким образом фрагментов ДНК расщеплялось эндонуклеазой ALul на 2 субфрагмента длиной 170 и 120 п.н., что с большой вероятностью указывало на существование индивидуального семейства повторяющихся последовательностей. Оно было названо ALu-семейством /84/.

Alu-семейство составляет от 3 до &% генома человека, что соответствует 300000-500000 копиям данной последовательности /84/. При случайном характере распределения по геному члены ALu-семейства должны быть разделены участками ДНК длиной около 5 тыс. п.н. Поскольку среднее расстояние между КРП в геноме человека равно приблизительно 2200 п.н. /44/, каждый второй-третий повтор,по всей видимости,представляет собой ALu-последовательность. Эти рассуждения подтверждаются экспериментально. Так, изученный фрагмент ДНК человека длиной 56 тыс. п.н., содержащий Є -, А^ -, G)f-, - и /2-глобиновые гены, содержит и 7 A La-последовательностей /34, 66/, а в клеточном онкогене человека (с-si-S), гомологичном онкогену вируса саркомы обезьян, длиной 12 тыс. п.н. обнаружено 3 ALu-последовательности, локализующиеся в двух нитронах /46/. Анализ случайно отобранных клонов ДНК человека и зеленой африканской мартышки также свидетельствует о том, что члены ALu-семейства наиболее многочисленны и широко диспергированы в геноме приматов /94/.

Индивидуальные члены ALu-семейства, как и большинство других семейств КРП не идентичны друг другу. Обобщенная и

усредненная первичная структура вездесущей А 1ц -последовательности была установлена при анализе клонированных фрагментов ДНК человека, содержащих копии из этого семейства /22,53, 137/. Нуклеотидная структура индивидуальных клонированных ALu-последовательностей отличается от усредненной лишь на 10$ /45/. Большинство вариаций сводится к точечным мутациям, имеющим случайное распределение в пределах 300-нуклеотидной последовательности. Два конца ALu-элемента,подобно концам В-элементов,отличаются по степени дивергенции. Менее консервативный конец представлен А'Т-богатой зоной, структура которой у разных членов семейства в большинстве случаев описывается формулой /N (A) h. /m » ^гД^е А/ - любой нуклеотид (иногда более чем один), п - обычно 4 20, a tn 4-10 /94/.

При анализе первичной структуры выяснилось, что ALu-элемент, имеющий в длину 300 п.н. представляет собой несовершенный димер, образованный двумя тандемно расположенными копиями одной последовательности, длина которой составляет 135 п.н. Вторая копия содержит инсерцию длиной 31 п.н. (позиции 218-250), которая отсутствует в первой копии. Оба мономера заканчиваются А*Т-богатой зоной ; внутри каждого из них .обнаруживается 14-нуклеотидный сегмент (позиции 41-53 и 176-188), имеющий структуру, сходную с областью начала репликации папова-вирусов /93/. Исследование усредненной нуклеотидной последовательности димерного ALu-элемента показало, что каждый его мономер обнаруживает довольно высокую степень гомологии с последовательностью BI грызунов и может считаться ее аналогом /82,109/. Особенно консервативной оказалась 40-нуклео-тидная последовательность, присутствующая как в обоих мономерах ALu, (позиции 21-60 и 156-195), так и в В1-элемен-

те ; именно эта последовательность содержит участок гомологии с областью начала репликации паповавирусов. Длина второго мономера в большей степени, чем первого соответствует длине BI-последовательности грызунов, которая содержит участок, эквивалентный по длине (но не по структуре) его 31-нуклеотидной ин-серции. Несмотря на очевидную родственную близость ALu- и BI-последовательностей они не гибридизуются в жестких условиях, что обусловлено спецификой их структурных различий /151/.

ALu -подобные последовательности обнаружены в геномах других приматов. Так,у зеленой мартышки /48,74/ выявляются КРП, очень похожие на /?/^-семейство по структуре и степени повторяемости в геноме. Около 1Ъ% библиотеки генов зеленой мартышки гибридизовалось с клонированной /^-последователь -

с:

ностью человека. Это соответствует 1,8x10 копий гомологичной последовательности на гаплоидный геном. Анализ первичной структуры клонированного ALu -элемента мартышки продемонстрировал ее 84%-ную гомологию с усредненной ALu -последовательно-ностыо человека /74/.

В большинстве случаев элементы В-типа и ^/&-последовательности фланкированы с обеих сторон короткими прямыми повторами размером от 8 до 20 п.н. /94/. Структура этих повторов варьирует в пределах семейства, будучи уникальной для каждой конкретной копии - т.е. они не являются частью собственно ALu , BI или В2. Такие особенности строения являются типичными для подвижных элементов генома. Аналогично прямым повторам, ограничивающим бактериальные транспозоны или инсерционные последовательности и мобильные элементы эу-кариот прямые повторы, фланкирующие вездесущие КРП могут быть результатом дупликации уникальной последовательности ДНК в

области внедрения повтора в хромосому /29,64/. Это позволяет предположить, что АІМ- и В-повторы являются подвижными элементами генома эукариот /8,72,82,110,165/.

Хотя описанные вездесущие последовательности составляют основную массу КРП генома млекопитающих, они не исчерпывают многообразие их семейств. Помимо АЫ в геноме приматов обнаружены и другие, гораздо менее представительные семейства КРП /45,67/. Хейгвуд и соавт. /78/ обнаружили в составе кластера /в -глобиновых генов мыши, имеющего в длину 65 тыс. п.н. три отдельных, не гибридизующихся между собой семейства КРП; каждая из трех повторяющихся последовательностей была представлена в этом фрагменте ДНК как минимум двумя копиями. Сходные данные по распределению этих повторов внутри А -гло-бинового кластера были получены на двух линиях мьпией - ВАІВ/С и С57ВІ/Ю. Описанные семейства получили наименования &., Ь и с ; их связь с семействами В-элементов остается невыясненной. Клонированные а- и Ь -последовательности гибридизова-лись почти со всей фаговой библиотекой генов мыши, что позволяет оценить вероятную повторяемость каждой из этих последо-вательностей в 2x10 . Не исключено, что описанные КРП рассеяны главным образом в области сателлитной ДНК мыши /78/.

Представители 5-ти различных семейств КРП обнаружены в 20-ти местах внутри сегмента ДНК кролика длиной 44 тыс.п.н., содержащего / -глобиновые гены /67,150/. Лишь для одного семейства, получившего обозначение "С" показана гибридизация в мягких условиях с АШ-человека. С-элементы, так же как ALu способны транскрибироваться *> wif-o РНК-полимеразой Ш (см. далее).

Геном млекопитающих содержит также от 100 до 2000 локу-

сов, комплемент^ных малым ядерным РНК Vl₉ U2, L3 3, которые, как предполагают, участвуют в сплайсинге пре-мРНК /117/. Были получены геномные клоны, содержащие псевдогены этих РНК /165/. Оказалось, что вездесущие повторы не единственные среди КРП, имеющие на одном конце А'Т-богатую область и фланкированные прямыми повторами: псевдогены UI-, U2-, I) 3-РНК, а также ген U-6-PHK в геноме человека также обладает подобной структурой Д80/. Перед псевдогенами часто локализуются повторы ALu- (учеловека) и В-типов (у мыши) /47,126/, причем вездесущие повторы и U-гены имеют во всех случаях одинаковую ориентацию.

В настоящее время в различных организмах идентифицированы еще несколько семейств КРП, однако все они охарактеризованы значительно хуже, чем последовательности А Си- и В-типов. Так, определена первичная структура одного повторяющегося элемента из генома ксенопуса /154/ и нескольких - из генома морского ежа /131/. Повтор ксенопуса имеет длину 77 п.н. и образует небольшие блоки, рассеянные по геному; прямых повторов, фланкирующих элемент найдено не было. В геноме морского ежа, по-видимому, отсутствуют столь богато представленные повторы как ALu, BI и В2, однако в этом объекте выше разнообразие повторяющихся элементов. В связи с тем, что клонированные повторы морского ежа получены без прилежащих районов, пока не известно, обладают ли они структурными особенностями мобильных элементов.

Интересно, что у дрозофилы вопреки ранним представлениям /39/ также имеются в геноме КРП. Один из них, получивший название"суффикс" недавно обнаружен на 3'-конце гена Н55 в 7В оласти /158/. Это короткий повтор, имеющий длину 150-

200 п.н. и представленный в геноме несколькими сотнями копий. Характерно то, что он выявляется на 3'-конце примерно 2% всех мРНК дрозофилы, хотя та мРНК_?в которой он был первоначально обнаружен,составляет не более 0,1$ всей мРНК.

В геномах эукариот КРП диспергированы между д^нкционирую-щими генами, в интронах самих генов, а также в последовательностях сателлитной ДНК. Было изучено распределение КРП в межгенных участках разных организмов: например,внутри/? -глоби-новых кластеров мыши /78/, кролика /66,83,150/ и человека /66/, а также с^-глобинового кластера человека /66/. Каждый из изученных генных кластеров состоит из кодирующих участков, одного или нескольких псевдогенов и различных представителей КРП. Пять генов /2-глобинового кластера человека экспрессируются в следующей временной последовательности: Є - в эмбрионах, А^ и Q-v в процессе развития плода, о и ft - во взрослом состоянии. У кролика два гена экспрессируются в эмбрионах и один у взрослых особей, а у мыши наоборот, два - во взрослом состоянии и один - в эмбрионах /89/.

Несмотря на то, что можно проследить некоторые закономерности в организации КРП внутри кластеров функционирующих генов - например С-семейство кролика группируется в области эмбриональных генов, а в пределах /} -глобинового кластера человека АІМ -элементы не обнаруживаются в промежутках между одновременно экспрессирующимися генами /152/, функциональная значимость этих наблюдений остается неясной.

Последовательности, составляющие индивидуальные семейства КРП обнаруживают лишь небольшую степень дивергенции как в пределах данного генома, так и в геномах относительно близкородственных групп млекопитающих - таких, например, как род

мышь или отряд приматы /152/. Это резко отличает КРП от последовательностей сателлитнои ДНК, лишь самые общие черты строения которых похожи у родственных организмов. С другой стороны, при сравнении семейств приматов и грызунов наряду с определенным сходством обращают на себя внимание некоторые отличия, и, в первую очередь, разница в многообразии семейств КРП в этих геномах. Возможно, это указывает на то, что индивиду-* альные семейства КРП сформировались внутри геномов грызунов и приматов уже после того, как их эволюционные пути разошлись /цит. по 152/.

Исследование гомологии между повторами разных организмов позволяет определить таксономические и филогенетические взаимоотношения между этими организмами /56/. Однако, при анализе индивидуальных последовательностей может иметь место значительное несоответствие между степенью сходства повторов у разных организмов и таксономической близостью последних, на что, например, указывает сравнение клонированного повтора BI с аналогичными повторами других грызунов /9/.

Механизм образования семейств КРП, очевидно, включает амплификацию первичных последовательностей ДЖ и их дисперсию в геноме. Концептуально данная проблема неоднократно обсуждалась /19,129,147/. Неравный кроссинговер /которым может объясняться амплификация сателлитнои ДНК вряд ли подходит для объяснения амплификации и дисперсии КРП. Более приемлемой представляется модель, предлагающая конверсию генов /см,152/.

Вместе с тем,одной лишь конверсией генов нельзя исчерпывающе описать дисперсию различных КРП в геноме. Изучение первичной структуры BI, В2 и A Lit и их окружения /45,71,72, 110,137/ позволило предположить, что эти последовательности

так же как мобильные ДРП являются подвижными элементами генома эукариот /72,82,110,165/, хотя прямой анализ здесь затруднен из-за большого числа копий и отсутствия доступного метода гибридизации с политенными хромосомами. В таком случае подобно ДРП (МЦГ дрозофилы, Tyl-элементы дрожжей, прорет-ровирусные последовательности и т.п.) КРП эукариот,по всей видимости^распространились (а может быть и продолжают распространяться) по геному путем транспозиции. Однако,структурные различия между этими двумя типами рассеянных повторов предполагают существование различий в механизме их перемещения. ДЕШ проретровирусов, МЖ и сходных с ними последовательностей ограничены короткими обращенными повторами размером от 2 до 17 п.н., которые на обоих концах имеют нуклеотидв TG...СА во всех исследованных случаях /64,160/, Поскольку бактериальные транспозоны и инсерционные последовательности имеют аналогичные инвертированные повторы, участвующие в перемещении этих лабильных элементов по геному, считают, что описанные структуры также обеспечивают мобильность ДРП /8/.

КРП не обнаруживают в своем составе фланкирующих обращенных повторов. В то время, как короткие прямые повторы, ограничивающие ДРП дрозофилы и дрожжей и проретровирусные ДНК в клетках птиц и млекопитающих насчитывают всего 4-dS нуклеоти-дов, аналогичные структуры в /ft^-, BI- и В2-семействах КРП, а также в рассеянных псевдогенах низкомолекулярных РНК имеют в длину 8-20 п.н. /94/. Поскольку сами КРП приблизительно равны по длине ДКП, ограничивающим ДРП, не исключено, что в ряде случаев они могут выполнять функции ДКП для неких еще не идентифицированных транспозоноподобных элементов генома млекопитающих /пит. по 94/.

По всей видимости в большинстве случаев транспозиция вездесущих КРП происходит при участии обратной транскрипта-зы. Матрицей могут служить малые цитоплазматические BI- и В2-содержащие поли (А)⁺РЖ (см. далее), а в качестве затравки выступать олиго(U)-участки, имеющиеся в составе ЕЖ цитоплазмы. Недавно показано существование в клетках приматов коротких экстрахромосомных ДНК, содержащих ^и-элементы /III/. Такие ДЖ наряду с низкомолекулярными РЖ могут соответствовать промежуточным продуктам транспозиции.

Хорошим свидетельством в пользу участия обратной транскрипции в образовании инсерций является структура некоторых псевдогенов, которые лишены интронов /97,125/. Такая структура возможна в том случае, если матрицей для синтеза служит зрелая мРЖ, также не содержащая интронов. В псевдогенах малых ядерных РЖ Ul, U2, и U3 часто представлен только 5'-конец. Это, по-видимому, связано с тем, что 3»-конец свободной РЖ образует структуру типа шпильки, используемую ревер-тазрй в качестве затравки для синтеза ДЖ, и поэтому не представлен в ДЖ-транскрипте. На возможность такого объяснения указывают опыты с использованием бесклеточной системы обратной транскрипции /165/.

Т.обр. складывается мнение, что все типы рассеянных повторов могут оказаться подвижными инсерционными элементами. По-видимому, именно возможность реплицироваться и встраиваться в новые места генома обусловливает их высокую повторяемость.

ЭКСПРЕССИЯ РАССЕЯННЫХ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ЭЛЕМЕНТОВ ГЕНОМА ЭУКАРИОТ.

РП относятся к транскрипционно активным элементам генома: в составе молекул гяРНК и цитоплазматических РНК выявляются повторяющиеся последовательности, гомологичные РП ДНК /см. 94 и 152/. В некоторых транскриптах такие последовательности встречаются более чем I раз, часто в виде взаимокомплементарных копий, которые способны образовывать двуспиральные структуры /13,71/. Как внутримолекулярные шпильки, так и межмолекулярные РНК-дуплексы были выделены в виде устойчивой к РНК-азе фракции двуспиральных РНК (дсРНК) /см.13/. Было показано, что взаимокомплементарные РНК-копии, на долю которых приходится до 20$ суммарной пре-мРНК обязаны своим происхождением либо инвертированной ориентации повторов.в геноме либо симметричной транскрипции обеих цепей данной последовательности /17,44/. В молекулах гяРНК, так же как -и в геноме имеет место чередование последовательностей, транскрибированных с повторов и уникальных участков /36,168/. Определенные семейства РП транскрибируются в виде дискретных по размеру РНК, образующих самостоятельные классы молекул. Между частотой повторяемости различных последовательностей и частотой встречаемости их в РНК прямой корреляции не обнаружено: некоторые относительно редкие геномные повторы являются в РНК более представительными, чем те, которые характеризуются более высокой частотой повторяемости в ДНК /94/.

Значительную часть поли (А) "''РНК ряда эукариотических организмов составляют транскрипты с ДРП /61/. Эти РНК имеют кэпированный 5»-конец /138/ и, видимо, синтезируются РНК-полимеразой П.

В клетках культуры дрозофилы до 2% всей поли(А)⁺РНК синтезируется на матрице ВДП-последовательности, представляющей одно из семейств длинных мобильных повторов. Закономерности транскрипции ВДП были подробно изучены /7,17,71/. Оказалось, что главным продуктом транскрипции является полноразмерная копия одной из цепей ВДГ. Наряду с ней в составе полиаденилированнои РНК цитоплазмы присутствуют и более короткие цепи, образующиеся, по-видимому, в результате сплайсинга 5'-и 3'-концов первичного транскрипта. Транскрипция начинается внутри б'-ДКП и продолжается в область З'-ДКП. о -последовательности дрожжей так^же инициируют и терминируют транскрипцию Туї /59/,

Особенностью транскрипции ВДГ является то, что в ядерной и цитошіазматическои полиаденилированнои РНК присутствуют последовательности, комплементарные обеим цепям элемента /17/. Можно думать, что наряду с главным направлением транскрипция идет и в противоположном направлении, т.е. она носит симметричный характер. Следует, однако, подчеркнуть, что концентрация главного транскрипта примерно в 20 раз превышает концентрацию дополнительного /17/, поэтому более точно следует говорить о частично симметричной транскрипции ВДГ. Интересно, что в пределах ДКП различия в интенсивности транскрипции между двумя цепями значительно ниже чем в пределах собственно ВДГ. Возможно, что в цепи минорного транскрипта большинство инициированных молекул РНК быстро обрывается внутри ДКП или вблизи от него.

Частично симметричная транскрипция является характерным свойством ВДГ - обычные однокопийные гены этим свойством не обладают.

ДКП, присущие как ретровирусам, так и ВДГ играют важную роль в их репликации и транскрипции. Различные мобильные элементы и разные провирусы отличаются по силе промоторов,лежащих в ДКД /162/. У экзогенных вирусов она обычно много выше, чем у эндогенных, что , вероятно, связано с присутствием в их ДКП т.наз. усилителей (е.нАссъсе.г) - последовательностей, резко увеличивающих эффективность транскрипции /76,100/.

ДКП мобильных элементов подобно аналогичным участкам проретровирусов содержат в обеих цепях характерные сигнальные участки. Это ТАТА-блок или последовательность Хогнесса /21,68,118/, указывающая на наличие точки инициации транскрипции, находящейся от нее на расстоянии 25-30 п.н. и ААТААА-последовательность, которая, как предполагают, определяет точку полиаденилирования транскрипта, находясь от нее на расстоянии 20 п.н. / 12/. При этом более совершенные, "канонические" сигналы являются в цепи минорного, а не главного транскрипта. Предполагается, что как и в случае ретровирусов, именно минорный транскрипт служит матрицей для синтеза "-" цепи репликативной ДНК мобильных элементов /71/.

Информационное содержание ВДГ пока неясно. В бесклеточной системе удалось протранслировать полиаденилированную РНК, комплементарную ДНК одного из видов ВДГ /62,63/, однако с транскриптами других МДГ такие попытки успеха не принесли. Было показано, что лишь малая доля поли (А) "''РНК, комплементарной ВДГ, обнаруживается в составе полисом, в то время как большая часть транскриптов связана с отличными от полисом РНП-комплексами /7,71/.

Экспрессия АІ генов млекопитающих происходит на ранних стадиях эмбриогенеза, а во взрослых тканях практически не

детектируется /99/. В культивируемых раковых клетках наблюдается активация транскрипции последовательностей А-типа /96/, причем А2 транскрибируется слабее, чем AI, даже в раковых клетках.В опытах по гибридизации тотальной поли(А)⁺РНК с разделенными цепями клонированных последовательностей AI и А2 было показано, что их транскрипция как и в случае МДГ является частично симметричной /72/, Недавно последовательности гомологичные А2- и /h I-повторам были обнаружены в составе полисомной мРНК клеток человека /105/.

В РНК ооцитов морского ежа представлено около 80$ КРП и 35$ ДРП генома /36/, причем на примере 9 клонированных повторов показано, что в ядерной РНК присутствуют копии обеих цепей каждого повтора. Существуют данные, свидетельствующие о том, что большинство уникальных полиаденилированных РНК морского ежа содержат в своем составе транскрипты с КРП, причем частотные спектры встречаемости транскриптов и повторяемости соответствующих последовательностей в геноме не обязательно совпадают ; в составе различных молекул полиаденилиро-ванной РНК участки,транскрибированные с КРП одного и того же семейства,могут быть связаны с различными уникальными транскриптами /37/.

Представленность транскриптов ряда семейств повторов в ядерной РНК клеток кишечника морского ежа оказалась отличной от таковой в ядерной РНК клеток гаструлы /145/. Это указывает на селективную аккумуляцию транскриптов различных РП в разных тканях, и может объясняться дифференцированной транскрипцией и/или различной стабильностью транскриптов, частью которых эти повторы являются» В свою очередь, тканеспе-цифичный характер транскрипции различных семейств КРП можно

трактовать и как причину и как следствие дифференцированной транскрипции генов в клетках разных тканей, поэтому вопрос о конкретной роли КРП в экспрессии эукариотических генов остается открытым.

Тот факт, что КРП соседствуют в геноме с последовательностями, кодирующими белок и их транскрипты обнаруживаются в составе ядерных РНК послужил основанием для предположения, что некоторые повторяющиеся последовательности функционируют в ДНК как регуляторные сигналы транскрипции, а в РНК как регуляторные сигналы процессинга первичных транскриптов /26,43,92, 93,140/. Однако, по-видимому, не следует рассматривать РП только как контролирующие элементы генома ; не исключено, что часть их участвует в генетических процессах, связанных с репликацией и реорганизацией генома /2/.

Вездесущие КРП млекопитающих богато представлены в клеточной РНК, особенно в новообразованной ядерной РНК. Например, последовательности ALu. -семейства составляют от 18 до 2Ъ% гяРНК клеток НеЬа /92/. Размеры ALu -транскриптов варьируют от 100 до 5000 п.н. /58,92,93/. По крайней мере часть транскрибированных /^-последовательностей обнаруживается в составе внутримолекулярных и межмолекулярных РНК'РНК-дуплексов, обязанных своим происхождением обращенной ориентации последовательностей-копий и/или симметричной транскрипции обеих цепей 4&-ДНК /94/.

До 2% всей ядерной новообразованной РНК мыши составляют транскрипты БІ- и КЗ-элементов /107/. При этом около четверти суммарной КС- и В2-РНК образуют дсРНК В, т.е. представляют собой сближенные инвертированные копии ; остальные 3/4 В-транскриптов существуют независимо друг от друга.

ALu. -транскрипты обнаруживаются в составе как полиадени-лированной, так и неполиаденилированной РНК цитоплазмы /58,91, 129,157/, однако представленность их здесь гораздо ниже, чем в молекулах гя РНК /58,91/ ; процент гибридизации ядерной РНК с ДІМ-ЩИ по крайней мере в 10 раз превышает таковой для РНК цитоплазмы. Аналогичные данные получены для ядерной и пито-плазматической РНК мыши /140, 141/.

Как известно, для ряда клонированных индивидуальных генов показано присутствие КРП в составе интронов. Например, в инт-роне гормона роста крысы содержится 2 элемента В2-типа /128/, а в двух интронах клеточного онкогена (c-s/s) человека локализованы 3 ALu-последовательности /46/. Т.обр. вездесущие повторы В-типа входят в состав транскрипционных единиц РНК-полимеразы П. По-видимому они чаще локализуются в тех областях первичных транскриптов, которые подвергаются деградации при процессинге РНК, однако каких-либо определенных закономерностей в локализации КРП внутри транскрипционных единиц РНК-поли-меразы П пока не выявлено.

Наряду с высокомолекулярными транскриптами в цитоплазме клеток млекопитающих выявляются самостоятельные транскрипты вездесущих КРП, образующие дискретные классы низкомолекулярных цитоплазматических РНК. Были получены данные, указывающие на то, что члены ALu- и В-семейств возможно транскрибируются РНК-полимеразой Ш в виде коротких РНК, образующих отдельные классы цитоплазматических молекул. Один из них, обозначенный как 4,5 S РНК /91/ был идентифицирован в клетках китайского хомячка благодаря способности этих РНК образовывать гибридные дуплексы с полиаденилированными молекулами гяРНК и мРНК. Анализ нуклеотидной последовательности 4,5SРНК грызунов /79,82/

показал, что она наделена характерными чертами транскрипта РНК-полимеразыШ: эта молекула длиной 96 нуклеотидов имеет на 5'-конце структуру pppQpp, а на 3»-конце - олиго (U) различной длины. На 5*-конце выявляется 26-нуклеотидная область, на 65% гомологичная усредненной BI-последовательности грызунов. Эта гомология прерывается 10-нуклеотидной последовательностью и затем вновь наблюдается уже с частотой совпадений 88% на протяжении 50-ти 3'-концевых нуклеотидов. Т.обр. гены 4,55РНК можно рассматривать как дивергировавшие копии BI-элемента. Хотя 4,5SPHK обнаруживается как в цитоплазме, так и в составе ядерных РНП-комплексов остается неясным, происходит ли 1*ь \/шо ассоциация 4,5 SРНК с полиаденилированны-ми гяРНК и цитоплазматическими РНК.

Интересно, что структурное сходство между 4,5SPHK мыши и китайского хомячка выражено гораздо сильнее (всего 3 замены на 90 нуклеотидов), чем между усредненными последовательностями ВІ-ДНК этих видов. В обоих случаях 4,5SPHK являются транскриптом одной и той же цепи определенной В1-последова-тельности, которая служит функционирующим геном данной РНК и относится по всей видимости к подсемейству консервативных В1-элементов.

В клетках человека 4,55 РНК не обнаружены, однако для клеток Hela и многих нормальных тканей характерен другой дискретный класс низкомолекулярных цитоплазматических РНК, способных гибридизоваться с ^&-ДНК. Это т.наз. 7SPHK. Длина молекулы этой РНК составляет 295 нуклеотидов ; как и в случае 4,5SРНК наблюдается значительная гомология ее нуклеотидной последовательности с ALu. человека и BI-последовательностью грызунов. Имеются данные, указывающие на консервативность

последовательности 75РНК в период относительно недавней эволюции /60/.Эти же данные служат еще одним экспериментальным подтверждением того, что /^-подобные элементы характерны не только для млекопитающих, но и для других классов позвоночных. Вместе с тем, анализ гибридных дуплексов между 75 РНК и клонированной ALu-W& показал их несовершенную структуру, свидетельствующую о том, что 7S РНК возможно кодируется каким-то определенным подсемейством ALu -последовательностей /166/.

В клетках крысы был обнаружен еще один класс низкомолекулярных РНК, получивший название 4,53РНК I /136/. Молекулы этой РНК имеют в длину 99 нуклеотидов и обнаруживают значительную гомологию с В2-элементом грызунов. При этом отдельные участки нуклеотидной последовательности В2 в составе 4.5S РНК I как бы "перетасованы" в сравнении с геномной последовательностью.

Биологические функции перечисленных РНК неизвестны. В отличие от не вполне идентичных ALu- и В-элементов, каждый класс низкомолекулярных РНК представлен_?видимо,идентич-ными копиями. Это может свидетельствовать о том, что низкомолекулярные цитоплазматические РНК эукариот кодируются какими-то конкретными членами ALu- и В-семейств повторов.

Многие, но не все клонированные /^-последовательности могут служить матрицами для РНК-полимеразы Ш в бесклеточной-системе транскрипции /52/. При этом наблюдается образование дискретных классов молекул низкомолекулярных РЖ /53,58,129/. Детальное картирование показало, что точка начала транскрипции близка или совпадает с первым нуклеотидом ^^«-последовательности /53/. ALu транскрибируется полностью, причем

терминация цепи наблюдается за пределами А'Т-богатой зоны в области уникальной ДНК. Каждая последовательность-копия АІСС-семейства видимо продуцирует один или, по крайней мере, небольшое число транскриптов определенной длины. При этом транскрипты различных копий Alu. различаются по длине, что связано с терминацией транскрипции Alu. в различных.уникальных последовательностях на различном расстоянии от А*Т-зоны повтора /52,67/.

Хотя А/^-элемент состоит из двух похожих мономерных единиц, транскрипция в бесклеточной системе всегда начинается только с первого мономера. По предположению Элдера и соавт. /58/ это связано с наличием в первом мономере внутренней контрольной последовательности для РНК-полимеразы III. Известно, что контрольные участки транскрипции обычно локализуются внутри транскрипционных единиц РНК-полимеразы Ш /53/. Усредненная ^^-последовательность имеет в своем составе сегмент 5*-QAGTTGPu^A(tACC-3' (примерно в районе 75-го нуклеотида), структура которого весьма близка к последовательности 5'-GGGTTCGANNCC-3', которой приписывают роль усредненной про-моторной последовательности РНК-полимеразы Ш. Указанный сегмент отсутствует во втором мономере Alu:гомологичная последовательность здесь прерывается нуклеотидными инсерциями. Терминация транскрипции АІМ. происходит в олиго(Т)-кластере с числом мономеров > 4, подобно тому, как это наблюдается на других матрицах РНК-полимеразы Ш /53/.

Аналогично членам Alu -семейства последовательности В2 (но не BI) могут служить матрицей для транскрипции uh, t/tvho РНК-полимеразой Ш /81/. При этом также образуются декретные по длине низкомолекулярные РНК. Кроме того, подобные РНК

были выделены из живых клеток /81/. Транскрипция начинается с первого нуклеотида.В2-последовательности и заканчивается в олиго(Т)-участке А'Т-зоны повтора. В некоторых В2-копиях этот участок терминации отсутствует, вследствие чего считывание продолжается за пределы А'Т-зоны повтора и заканчивается уже в области прилежащей уникальной последовательности ДНК. В этом плане В2-элементы весьма напоминают первый мономер димерных /j/w-последовательностей, в то время как В1-элемен-ты ведут себя аналогично второй их части,которая, по-видимому, не содержит инициаторных участков РНК-полимеразы Ш /81,58/.

Возможно, некоторые типы транскриптов КРП, продуцируемые РВК-полимеразой Ш, имеют отношение к механизму их перемещения по геному - например, выполняют роль матриц для образования репликативных форм повторов в схеме с обратной транскрипцией /87,165/.

Наряду с дискретными по размеру неполиаденилированными транскриптами при гибридизации меченой BI- или В2-ДНК с фракционированной по размеру РНК-цитоплазмы выявляется низкомолекулярная BI- и В2-содержащая поли(А)⁺РНК /108/. Эта фракция гетерогенна по длине - ее размеры варьируют от 200 до 400 нуклеотидов. Вариабельность размера можно в значительной мере приписать вариабельности поли(А)-области, размеры которой колеблются от нескольких десятков до 200 нуклеотидов. Гибриды меченой малой В2- и ВІ-РБК с соответствующими ДНК стабильны в присутствии панкреатической РНК-азы, что предполагает отсутствие в этих РНК сколько нибудь протяженных последовательностей, отличных от поли(А) и В-элементов. Содержание низкомолекулярной полиаденилированной В2-РНК значительно выше, чем содержание аналогичной ВІ-РНК. Вместе с тем, их количест-

ва в опухолевых клетках (рак Эрлиха, клетки МОРС I04E) во много раз выше, чем в клетках нормальной печени. Эти РНК не входят в состав полисом, а обнаруживаются исключительно во фракции свободных РНК.

Пока нет точного ответа на вопрос образуются ли малые полиаденилированные РНК в результате процессинга тяжелых ядерных РНК или синтезируются независимо от них. Однако, недавно полученные данные по чувствительноститранскрипции В-элементов к УФ-облучению /72/ позволяют оценить размеры соответствующих им транскрипционных единиц (т.е. размер мишени облучения). В условиях, когда синтез BI- и В2-РНК,имеющих размеры пре-мРНК и мРНК полностью подавляется,синтез малых РНК остается неизменным. Это говорит в пользу того, что малые В-содержа-щие РНК образуются независимо от высокомолекулярных транс-криптов, возможно, при участии РНК-полимеразы Ш. С таким предположением согласуются и вышепреведенные данные, свидетельствующие о том, что клонированные А 1ц человека /53/ и В2 хомяка /81/ служат хорошими матрицами для РНК-полимеразы Ш в

СИСТеме ІАь УіІґО »

Наряду с изучением первичных транскриптов, содержащих КРП, тщательно исследовался вопрос об организации этих последовательностей в мРНК эукариот. Рысков с соавт. /141/ одними из первых обнаружили присутствие в мРНК мыши участков, гомологичных двуспиральной фракции пре-мРНК, на основании чего было сделано предположение об участии двуспиральных шпилечных структур в процессинге пре-мРНК - возможно, в качестве сигнальных участков расщепления специфических нуклеаз.

В работах, проведенных на мРНК ксенопуса .было показано, что последовательности, транскрибированные с уникальных

и повторяющихся участков генома перемежаются между собой в пределах целых молекул /40/.Позднее, исследуя мРНК, кодирующую кератин пера птиц, Локкет д соавт. /119/ обнаружили на 5»-конце этих молекул участки, транскрибированные с повторов ДНК, а на 3'-конце ' последовательности, транскрибированные с уникальной ДНК.

В экспериментах с клонированным фрагментом ДНК диктио-стеллума, содержащим одновременно уникальную и повторяющуюся последовательности генома, около 1% полисомных РНК гибридизо-валоськак с повторяющейся, так и с уникальной частями, причем оказалось, что участки, транскрибированные с одного и того же семейства повторов входят в состав нескольких различных мРНК /101/. Аналогично, последовательности, транскрибированные с уникальных и повторяющихся участков генома соседствуют в цитоплазматической поли (А) "'"РНК мыши /114/ и эмбрионов морского ежа /37/.

В плане предполагаемого участия вездесущих повторов в эк-спрессии эукариотических генов особый интерес представляет исследование структуры и организации В-элементов млекопитающих в составе мРНК, поскольку при этом выявляются новые закономерности, связанные с их функционированием. Наличие этих элементов в составе полиаденилированных РНК было продемонстрировано в гибридизационных экспериментах с суммарной дсРНК /141,142/, дсРНК-В /106/ и клонированными BI-, В2- и ALtc-ML /58,108,141/. Однако, во всех этих случаях гибридизация могла объясняться частичной гомологией между повторяющимися элементами В-типа и поли(А)⁺РНК. Поскольку присутствие В-лоследо-вательностей в мРНК является или отражением структуры генома, т.е. непосредственного соседствования последовательностей

структурных генов и повторяющихся участков генома и/или есть результат процессинга и сплайсинга пре-мРНК, в каждом конкретном случае организация этих повторов внутри транскрипта может иметь свои особенности.

Б отличие от пре-мРНК, молекулы мРНК,по-видимому, содержат только одну из комплементарных цепей дсРНК, причем содержание этих последовательностей в мРНК оказывается на порядок ниже, чем в пре-мРНК /58,91/. Открытым остается вопрос о том, какие именно цепи взаимокомплементарных транскриптов вездесущих повторов и в какой степени представлены в мРНК эукариот ; также неясны конкретная локализация и взаимное расположение кодирующих и повторяющихся элементов внутри молекулы мРНК. Все эти вопросы могут быть решены только при условии получения исследуемых транскриптов в гомогенном состоянии. Последняя задача в настоящее время выполнима благодаря использованию новых методических приемов, включающих клонирование соответствующих РНК и определение их первичной структуры.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Бактериальные штаммы и векторы для клонирования.

В экспериментах по клонированию в качестве вектора использовали плазмиду рВР322, несущую детерминанты бактериальной устойчивости к ампициллину и тетрациклину /25/. Препаративное наращивание ДНК плазмиды рВК322 проводили в клетках F. coU штамм HBIOI. Для получения рекомбинантных клонов использовали клетки F- coU. штамм "X 1776 /41/. Трансформацию бактерий и выращивание рекомбинантов проводили в генно-инженерном блоке РЗ ИМБ АН СССР.

2. Получение поли(А)-содетжащей мРНК из клеток ас-
цитной карциномы Эрлиха и печени мыши.

2.1. Получение цитоплазматической поли(А)-содержащей мРНК из клеток асцитной карциномы Эрлиха;

Асцитную жидкость брали у мышей на 6-8-й день после трансплантации. Суспензию клеток (120 мл) осаждали центрифугированием (2000 g , 3 мин.) и промывали 4D мл холодного раствора хлористого натрия. После осаждения клетки промывали в растворе ТКМ (0,01 М трис-НС1 рН 7,7; 0,01 М KCI ; 0,01 М MgCIg) и суспендировали в гомогенизаторе Даунса типа А в 2,5 объемах раствора 0,05 М трис-HCI рН 7,6 - 0,1 М KCI -0,005 М MgCIg - 0,006 М меркаптоэтанол - 1,5$ тритон Л00 -13$ сахароза. Суспензию центрифугировали при 0 С, 20 мин. при 1500 об/мин в центрифуге 7-21. Супернатант сливали в холодный стакан, добавляли ЭДТА до полной нейтрализации ионов магния,ДСН до концентрации 0,5$ и депротеинизировали равным объемом фенола (рН 9,0). Затем последовательно вод-

ную фазу обрабатывали смесью фенол-хлороформ и хлороформом. РНК осаждали спиртом и наносили на колонку с поли(1) )-сефа-розой.

2.2. Получение цитоплазматической поли(А)-содержащей
мРНК из печени мыши.

50-80 г печени суспендировали в трех объемах раствора 0,25 М KCI ; 0,025 М трис-HCI, рН 7,6 ; 0,055 М Щ01₂ на холоду. После интенсивного гомогенизирования в электрическом гомогенизаторе гомогенат центрифугировали при 0С в течение 20 мин. при 1500 g. Супернатант сливали, фильтруя через 2 слоя марли от примесей гликогена, добавляли ЭДТА до концентрации, равной концентрации ионов магния, Д^ до концентрации 0,5$ и депротеинизировали по указанной выше схеме. После де-протеинизации РНК осаждали спиртом и осадок фракционировали на колонке с поли( LD-сефарозой.

2.3. Получение полисомной мРНК из печени мыши.

60 г печени, очищенной от желчных пузырей, измельчали и гомогенизировали на холоду в 3-х объемах раствора А, содержащего 0,25 М сахарозу, 0*,25 М трис-НСІ (рН 7,8),0,15 М KCI, 0,005 М MgCI₂. В раствор А предварительно добавляли ДЭПК до концентрации 0,1$ для удаления экзогенных РНКаз, который затем разрушали нагреванием на водяной бане при Ю0С в течение 20 мин. Перед выделением к раствору А добавляли 100 мкг/мл гепарина в качестве ингибитора эндогенных рибонуклеаз. Гомогенат фильтровали через 2 слоя марли и центрифугировали при 13000 об/мин 15 мин. при 4С в центрифуге К-24. Для выделения полисом постмитохондриальный супернатант

наслаивали на ступенчатый градиент сахарозы, приготовленный на ТКМ буфере (0,15 М KCI, 0,025 М трис-HCI рН 7,8, 0,005 М MgCIg) и центрифугировали при 25000 об/мин и 2С в течение 17 часов в роторе .SW-27 (3eckfnan_? США.). Для приготовления ступенчатого градиента I М и 2 М сахарозу, приготовленную на ТКМ буфере, предварительно обрабатывали ДЭПК, добавляли гепарин до концентрации 100 мкг/мл и наслаивали в виде ступенек по 7 мл в стаканы SW-27, На сахарозу наслаивали 20 мл постмитохондриального супернатанта. После центрифугирования супернатант сливали, и осадок полисом растворяли в буфере ТКЕ (0,025 М трис-НСІ, рН 7,5, 0,15 М КСІ, 5 мМ ЭДТА). Буфер ТКЕ предварительно обрабатывали ДЭПК и перед растворением полисом добавляли гепарин до концентрации 1000 мкг/мл. Далее к раствору добавляли ЭДТА до концентрации 20 мМ для разрушения полисом и наслаивали на линейный градиент 7 и 45$ сахарозы, 47$ и % сахарозу готовили на ТКЕ буфере, обрабатывали ДЭКП и добавляли гепарин до концентрации 100 мкг/мл. Раствор полисом наслаивали на линейный градиент сахарозы и центрифугировали при 25000 об/мин в течение 3,5 часов при 2С в роторе SW-27. После центрифугирования градиент раскапывали на фракции. После построения седиментограмм, фракции, относящиеся к верхней части градиента, до моносом, объединяли и депротеинизировали. Депротеинизацию проводили смесью равных объемов фенола (рН 7,0) и хлороформа, затем только хлороформом. После депротеинизации РНК осаддали 2,5 объемами перегнанного этанола и далее фракционировали на колонке с поли(и)-сефарозой.

2.4. Выделение поли (А)-содержащей РНК хроматографией на поли(U)-сефарозе.

Осадок РЫК растворяли в буфере I (0,1 М ШСІ , 0,01 М ЭДТА, 0,01 М трис-HCI рН 7,5, 0,2$ ДСН). Немеченую цитоплаз-матическую РНК разводили до концентрации 0,5 мг/мл, меченую ³²Р ядерную РНК растворяли в 2 мл буфера I. Раствор РНК пропускали через колонку два раза, после чего колонку интенсивно отмывали буфером I от несорбировавшегося материала. Фракции собирали по 2-5 мл и измеряли оптическую плотность или отбирали аликвоты для просчета радиоактивности.

Поли(А)-содержащую РНК элюировали водой, содержащей 0,2$ ДСН при 40С. Фракции собирали по 2-3 мл, измеряли оптическую плотность или просчитывали радиоактивность. Фракции, содержащие материал, объединяли, добавляли раствор ацетата натрия до концентрации 0,2 Ми осаждали спиртом. В некоторых случаях для получения более очищенных препаратов мРНК проводили повторное фракционирование материала на поли(и)-сефарозе.

3. Получение ядерной пре-мРНК.

Для выделения пре-мРНК использовали метод горячего фенольного фракционирования /5/. Клетки отмывали от радиоактивности и суспендировали в 0,14 М растворе хлористого натрия на холоду (7-Ю объемов 0,14 М хлористого натрия на I объем осажденных клеток). К суспензии прибавляли равный объем водонасыщен-ного фенола рН 6,0, смесь интенсивно встряхивали 15 мин. при 4С и центрифугировали при 4000-5000 g (ядра при этом собираются в интерфазном слое, а в водный слой переходит цито-плазматическая РНК). Затем, интерфазный слой, так называемые

"фенолыше ядра" собирали и проводили аналогичную процедуру при 40С. На этой стадии в водную фазу экстрагируются предшественники рРНК. Эту же процедуру повторно проводили при 55С. При этом из фенольних ядер экстрагируются остатки ядрышковой РНК и небольшая часть (не более 10$) пре-мРНК. Далее экстракцию проводили 0,14 М хлористыгл натрием, содержащим 0,5$ ДСН. I объем интерфазы смешивали с 3-5 объемами раствора хлористого натрия-ДСН и равным объемом фенола, рН 6,0. Смесь интенсивно встряхивали при 65С в течение 15 мин. и затем быстро охлаждали (быстрое охлаждение необходимо для того, чтобы препятствовать выходу ДНК в раствор). После центрифугирования водную фазу, содержащую пре-мРНК собирали, а интерфазу еще раз экстрагировали аналогичным образом, но при 85С. Водные фазы, полученные после экстракции при 65 и 85 объединяли и депротеинизировали последовательно с равным объемом фенола, со смесью равных объемов фенола и хлороформа и равным объемом хлороформа. РНК осаждали 2,5 объемами перегнанного этанола.

Полученный таким образом препарат содержал кроме пре-мРНК также предшественники рибосомальной РНК. Поли (А)-содержащую фракцию пре-мРНК выделяли с помощью хроматографии суммарного препарата на поли( 17)-сефарозе.

4. Электтюйотзетическое Фшкщюнщювание РНК в ага-розном геле и перенос на ДЪМ-фильтры.

Фракционирование и перенос на ДБМ-^ильтры ядерных,

цитоплазматических и полисомных поли(А)⁺ и поли(А)" РНК из клеток асцитнои карциномы Эрлиха и печени мыши было проведено Д;А;Крамеровым. РНК нагревали при 65 3 мин. в растворе 6 М

мочевины в 100$ формамиде и наносили на 1,5$-ный агарозный гель, приготовленный на растворе 7 М мочевины в 25 мМ цитрате натрия. Условия электрофореза, а также методика переноса РНК из геля на ДБМ-фильтры описаны в работе Крамерова Л08/.

5. Выделение ДНК плазмиды рВВ322.

ДНК плазмиды pBR322 выделяли по методу Боливара с соавт. /25/. Клетки S. coU штамм НВІ0І, содержащие плазмидную ДНК, наращивали в 20 мл /.-среды, содержащей 40 мкг/мл ампициллина в течение 5 часов при 37С в литровой колбе. Затем добавляли 200 мл подогретой до 37С обогащенной среды М-9, содержащей 2$ казаминовых кислот (blfco , США) - 0,2$ глюкозы - 0,1$ МЗ.С1 - 0,3$ КН2Р0₄ - 0,01$ MgSQq xTHgO - 0,6$ Afc₂//P04- 0,5$ A&CL - 0,0015$ CaCI₂x2H₂0 - 40 мкг/мл ампициллина.

Инкубацию при 37С продолжали в течение 2-3-х часов, периодически измеряя оптическую плотность суспензии растущих клеток при 560 нм. При достижении оптической плотности клеток 0,8-1,0 в среду добавляли спиртовой раствор хлорамфенико-ла до конечной концентрации 100 мкг/мл и продолжали инкубировать при тех же условиях в течение 8-Ю часов.

По окончании роста клетки осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин. при 4С и вскрывали по методу Клевелла и Хелински /33/. Все процедуры вскрытия клеток проводили при 0С. Осадок клеток суспендировали в 2,1 мл раствора: 25$ сахароза - 50 мМ трис-HCI (рН 8,0), затем добавляли 0,5 мл раствора, содержащего 5 мг/мл лизоцима в 0,25 М трис-НСІ (рН 8,0). Смесь инкубировали в течение 5-Ю мин. и

далее добавляли 0,8 мл раствора 0,25 М ЭДТА, рН 8,0, раствор

слегка перемешивали и оставляли на 10 мин. После этого добавляли 3,2 мл раствора: 1% b\-lg 58 - 0,4$ дезоксихолат натрия -0,06 М ЭДТА - 0,15 М трис-HDI рН 8,0,- К концу инкубации в течение 15-20 мин. при 0С получали вязкий клеточный лизат, который осветляли центрифугированием в роторе SW -40 (Веск-тап^Ш) при 25000 об/мин. в течение 40 мин. Супернатант сливали, добавляли кристаллический бромистый этидий (3 мг на 10 мл раствора) и кристаллический хлористый цезий (I г на I мл раствора). После растворения указанных компонентов раствор центрифугировали на центрифуге К-32 (СССР) при 50000 об/мин. в течение 24-х часов при 17С. Центрифужные пробирки с веществом просматривали в мягком УФ-свете и полоску, соответствующую плазмидной ДНК, отбирали с помощью шприца. Для ее очистки от хлористого цезия, бромистого этидия и РНК применяли следующую процедуру. Раствор плазмидной ДНК, отобранный из градиента хлористого цезия (1-2 мл) наносили на колонку, размером 1,5x20 см, содержащую два слоя. Нижний слой, высотой 15 см, содержал биогель AI5M (&co-a.c/ _% США), верхний слой, высотой 4 см, состоял из катионита ДАУЭКС - AQ-50W-X8 (Blo-Ra.d , США) в Ml -форме. Очистку проводили в буфере: 0,5 М Na.CL - 0,1 М трис-HCI рН 8,0 - I мМ ЭДТА, Фракции, содержащие плазмидную ДНК объединяли и полученный материал диализовали против буфера: 0,2 мМ ЭДТА - 5 мМ трис-НСІ рН 8,0 в течение 2-3-х суток при 4С. После диализа раствор ДНК концентрировали, путем упаривания на роторном испарителе.

- 6; Получение библиотеки клонов кДНК на основе цито-плазматической поли(А)*РНК печени мыши.

6.1. Получение рекомбинантных плазмид.

Рекомбинантные плазмиды на основе рВЕ322 и двуцепочечной кДНК, синтезированной на нитоплазматической поли(А)⁺ШК печени мыши были получены А.П.Рысковым путем синтеза с помощью терминальной трансферази олиго(сЮ)₁₀_₂о ^на З'-концах кДНК и олиго( d Q-)то-20 ^на 3^,""^K0H^^ax векторной ДНК (предварительно обработанной эндонуклеазой Pstl) и последующего отжига "липких" концов /143/.

6;2. Получение кальциевых клеток и трансформация.

Для трансформации рекомбинантной ДНК и клонирования использовали штамм CtoLi XI776 / 41/. Клонирование проводили в микробиологическом блоке типа РЗ. Культуру выращивали в Ь-среде (1% дрожжевого экстракта, 0,5% пептона, 0,5% хлористого натрия, рН среды 7,1) с добавлением 100 мкг/мл диами-нопиивлиновой кислоты (ДАЛ) и 4 мкг/мл тимидина, при аэра-

ции до плотности 2-3x10 клеток на I мл. Клетки осаждали при комнатной температуре, суспендировали в 0,01 М растворе хлористого натрия и снова центрифугировали при 4000 g. Далее клетки суспендировали в растворе, содержащем 75 мМ CaCI?, 0,8$ А/аСі ю мМ трис-НСІ, рН 8,0. Через 20 мин. пребывания при комнатной теппературе, клетки снова центрифугировали и осадок клеток суспендировали в 2-3 мл того же самого CaCI₂ -A/&CL - трис-НСІ буфера.

Эффективность трансформации определяли следующим образом. За 2 мин до прибавления ДНК 0,2 мл суспензии кальциевых клеток помещали на лед и добавляли 0,0001 мкг ДНК плазмиды

рВК322 в ОД мл буфера: 0,8$ МаДІ - 20 мМ трис-НСІ, рН 8,4. После этого клетки выдерживали 20 мин. при 0С и 2-3 мин. при 42С. Затем суспензию разбавляли в 10 раз 1-средой, содержащей 100 мкг/мл Д/Ш и 4 мг/мл тимидина и инкубировали при 37С в течение 1,5 часа при слабом покачивании. На чашки Петри, диаметром 10 см, содержащие 1,8% агар, приготовленный на 1-среде, 25 мкг/мл налидиксовой кислоты, 15 мкг/мл циклосе-рина и 20 мкг/мл тетрациклина выливали по 0,5 мл суспензии клеток после инкубации и, равномерно распределяя ее по поверхности чашки, давали впитаться в агар. Клетки инкубировали 24-48 часов при 37С, затем подсчитывали количество выросших колоний. Эффективность трансформации составляла 10 колоний на I мкг ДНК вектора. Пробу, объемом 100 мкл, содержащую 50 нг рекомбинантной ДНК в стерильном растворе 0,8% AfeCL-0,02 М трис-НСІ рН 7,4 смешивали с двумя объемами суспензии кальциевых клеток. Смесь инкубировали 30 мин при 0С и 3 мин. при 43С, разводили в 4 раза 1-средой, содержащей 5 мкг/мл тимидина и 100 мкг/мл ДАЛ и инкубировали на качалке I час при 37С. Суспензию клеток равномерно распределяли по поверхности агара, содержащего 20 мкг/мл тетрациклина в чашках Петри, давали ей впитаться и инкубировали при 37С 20-30 часов. Детектирование рекомбинантных клонов осуществляли методом гибридизации с колониями (см,п,8).

7. Приготовление меченых тест-проб для гибридизации.

7.1. Получение меченной ¹²⁵1 дсЕНК-В, -ВІ и -В2.

Получение суммарной /^⁵1/дсРНК-В, а также /^І25і/дстс-ВІ и /¹²⁵1/дсЕНК-В2, меченных по методу Пренского с соавт./133/

было проведено Д.А;Крамеровым. Удельная активность препаратов /¹²⁵1/-дсРНК составляла (5-Ю)х10' имп/мин/мкг.

7.2. Синтез ДНК, комплементарной мРНК, путем обратной
транскрипции.

ДНК, комплементарную полисомной или щтоплазматической полиШ^НК мыши (кДЖ) синтезировали в реакционной смеси, содержащей 50 мМ трис-НСІ (рН 8,1), 5 мМ tf&CL , 10 мМ ди-тиотреитола, 50 мМ КСІ, 100 мкг/мл актиномицина D по 0,5 мМ сІАТФ, ЛТФ, ТТФ, 50-100 мккюри с*-/³²Р/-сЩТФ (350 кюри/мМ), 50 мкг/мл поли(А)⁺мРНК, 5 мг/мл олигоС^Г)^ т„, 4 мМ пиро-фосфата натрия и 200-300 единиц/мл РНК-зависимой ДНК-полиме-разы (ревертазы). Смесь инкубировали при 37 в течение 30-45 мин. Затем добавляли ЭДТА до концентрации 10 мМ и Жг. ОН до 0,1 Ми выдерживали при 65С в течение I часа. Пробу нейтрализовали І М уксусной кислотой до рН 7,0-7,7 и пропускали через колонку с сефадексом G-50 в буфере, содержащем 0,1 М M*CL ,0,01 М трис-НСІ рН 7,5, 0,001 М ЭДТА и 0,2$ ДСН. Материал, элюирующийся на фронте колонки, собирали, добавляли тРБК до концентрации 100 мкг/мл и осаждали 2,5 объемами этанола.

7.3. Введение метки в ДНК

Метку в ДНК вводили по методу смещения одноцепочечных разрывов /134/. Реакционная смесь содержала 50 мМ трис-НСІ (рН 7,8), 5 мМ MdCL , ю мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, по 5-Ю мкМ d№, ТТФ, ^/АТФ, по 20-50 мккюри с<-/³²Р/-с/ГТФ (350 кюри/мМ), 0,5-1,0 мкг ДНК и 0,5-1,0 ед; ДНК-полимеразы I. После инкубации при І5С в

течение I часа объем смеси увеличивали до 0,3 мл, добавляли ЭДТА до 10 мМ, обрабатывали равным объемом фенола (рН 7,5) и пропускали через колонку с Сефадексом G-50 в буфере, указанном выше. Собирали материал, элюирующийся на фронте колонки, добавляли тРБК до концентрации 100 мкг/мл и осаждали этанолом.

Осадок собирали из-под спирта, растворяли в воде и денатурировали либо нагреванием до І00С в течение 10 мин., либо добавлением Ма.ОЦ до концентрации 0,3 М с последующим нагреванием до Ю0С в течение 3 мин. Далее образец нейтрализовали I М HCI до рН 7,0-7,5 и использовали для гибридизации. Удельная активность препаратов ДНК составляла (1-5)хЮ имп/ мин/мкг.

8, Детектирование и отбор рекомбинантных клонов. Метод гибридизации с колониями.

Метод гибридизации с колониями, разработанный Грунстей-ном и Хогнессом /75/, применялся с незначительными вариациями.

8VI. Подготовка фильтров и выращивание колоний.

Штроцеллюлозные фильтры ( МLLLlроге НА 0,45) 15 мин. кипятили в воде, стерилизовали в УФ-свете в течение I часа; затем переворачивали и стерилизовали I час обратную сторону фильтра. Стерильный срільтр помещали на слой L-arapa в чашку Петри (1% дрожжевого экстракта, 0,5$ пептона, 0,5$ A/a.CL_? 1,8$ агара, рН среды доведен до 7,1 щелочью A's.OU). Бактериальные колонии переносили на поверхность фильтра стерильной иглой, делая реплики специальным шаблоном из "бархатной" бумаги. Колонии на поверхности фильтров выращивали 16-20 часов

при 37С и хранили при 4С в перевернутом виде.

8'.2. Лизис колоний, денатурация и фиксация ДНК на нитро-целлюлозных фильтрах.

Лизис колоний проводили в течение 7-Ю мин. в 0,5 М М&ОН Чтобы предотвратить смывание бактериальных колоний во время лизиса, нейтрализации или фиксации, соответствующие растворы подавались под поверхность фяльтра и затем диффундировали в бактериальные колонии. Для этого фильтр с колониями помещали на фильтровальную бумагу, смоченную соответствующим раствором. Пеле инкубации с фильтра удаляли остатки раствора при небольшом отрицательном давлении. После обработки Мз.0//₁фильтр с колониями 3 мин. нейтрализовали в I М растворе трис-HCI (рН 7,4), последовательно 3 раза и 15 мин. фиксировали в растворе 1,5 М /і/аСІ - 0,5 М трис-НСІ рН 7,4; далее 3-5 мин. сушили на воронке или I час на воздухе. После фиксации колоний последующие операции проводили, погружая фильтры целиком в соответствующие растворы. Фильтры с фиксированными колониями инкубировали в растворе проназы в 2x5SC , в концентрации 2 мг/мл, при комнатной .температуре, сушили и промывали хлороформом на воронке Бюхнера. Затем фильтры сушили на воздухе до полного удаления хлороформа и ополаскивали в растворе 0,3 М хлористого натрия. Фильтры высушивали сначала на воздухе, затем 2 часа в вакууме при 80С. Перед гибридизацией фильтры инкубировали в растворе Денхардта (0,03$ поливинилпирролидона, 0,03$ ркол, 0,01$ бычий сывороточный альбумин), приготовленном на 4x5SC в 0,1$ додецилсульфате натрия, в течение 2-Зх часов при 65с.

8.3. Гибридизация колоний с меченной ^Р кДНК;

Детектирование рекомбинантных колоний производили с по-

мощью гибридизации с /³²Р/кДНК, синтезированной на цитоплаз-матической поли(А)⁺мРНК клеток асцитной карциномы Эрлиха. Гиб-ридизащонный раствор содержал 4xSSC 0Д$ М&> 500 мкг/мл поли(и) и раствор кДНК (2 млн; имп/мин). Гибридизацию проводили под вазелиновым маслом при 65С в течение 16-20 часов. Отмывку фильтров проводили в растворе 7 М мочевины, 2xSSC и 0,1$ ДСН при 42С в течение I часа; Эту опреацию повторяли 2-3 раза. Далее фильтры помещали в раствор 2х 5SC в 0,3$ ДСН и инкубировали в течение 2-Зх часов, меняя раствор после каждого часа инкубации. После отмывки фильтры высушивали на воздухе досуха и проводили радиоавтографйю;

8;4. Радиоавтография.

Для радиоавтографии использовали рентгеновскую пленку PM-I (СССР). Полоски нитроцеллюлозных фильтров после гибридизации заворачивали в папиросную бумагу и помещали между двумя листами рентгеновской пленки. Экспозицию проводили при -70С с усиливающими экранами в течение 3-14 суток.

8.5. Отбор рекомбинантных колоний.

Колонии, обнаружившие положительную гибридизацию с / Р/кДНК, пересевали с помощью стерильной петли на новые чашки Петри с агаром, содержащим 20 мкг/мл тетрациклина и, рас-севая шприцами, получали единичные колонии. Эти единичные колонии повторно гибридизовали с /^Р/кДНК. Окончательно отобранные колонии переносили стерильной петлей во флаконы, содержащие 0,4% агар, приготовленный на 1-среде и 20 мкг/мл тетрациклина. Музейные флаконы с клонами хранили в холодильнике при 4С.

9. Выделение рекомбинантной ДНК.

Рекомбинантную ДНК выделяли из штамма S-CoLi у_ 1776 по методу, описанному Куртисом /41/. Клетки Є .со Li ^1776, содержащие рекомбинантную ДНК, выращивали в L-среде с добавлением 100 мкг/мл ДАЛ и 4 мкг/мл тимидина при аэрации в течение ночи, при 37С. Культуру разводили в 10 раз той же самой питательной средой и подращивали при слабом покачивании до плотности 2-ЗхІО⁸ клеток/мл. Затем, к суспензии добавляли хлорамфеникол до концентрации 12,5 мкг/мл и еще подращивали 5 часов при аэрации. Клетки осаадали центрифугированием (4000 g, 5 мин.) и суспендировали в TEN ^-буфере (20 мМ трис-НСІ, 20 мМ ЭДТА, 0,8$ M&CL , рН 8,0). Для разрушения клеточной стенки бактерий добавляли лизоцим до концентрации 200 мкг/мл и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. Сферобласты вскрывали без детергента с помощью теплового шока в гипотонических условиях. Для этого смесь сферобластов оставляли при 0С 5 мин, с добавлением равного объема холодной воды, затем при 65-68С 5 мин,, и снова при 0С выдерживали двое суток. Хромосомную ДНК удаляли центрифугированием в роторе SW-4I при 30000 об/мин в течение 25 мин; при 3-4С. Плазмидную ДНК очищали центрифугированием в градиенте хлористого цезия, согласно методу, описанному Боливаром и сотр. /25/ (см.п.З).

10. Обработка ДНК рестщквдонными эндонуклеазами.

Рестрикция ДНК рестрикционными эндонуклеазами PstT, Е00ЕГ, МьрТ₇ 5г. UЗА у Ninfl, ALuI, Тц$1 проводилась в растворе, содержащем 10 мМ трис-НСІ (рН 7,5) - 10 mAfg.CL_z- І мМ

дтиотреитола (или 7 мМ 2-меркаптоэтанола) - 50 мМ Лс#, при 37С в течение 1-3 часов. Обработку ДНК рестриктазами ШпсІ и У hoi проводили в аналогичном буфере, но без добавления Необходимые количества ферментов и время инкубации для полной или частичной рестрикции ДНК определяли эмпирически. После инкубации пробы прогревали при 65С в течение 2 мин, добавляли 0,5$-ный раствор бромфенолового синего, приготовленного на 50$ глицерине и наносили на агарозный гель,

IIv Фракционирование ДНК с помощью электрофореза.

II.І. Фраісционирование ДНК в агарозном геле.

Фракцинирование препаратов ДНК в агарозном геле проводили как это описано Маниатисом и соавт. /122/. 1-3$ агарозные гели готовили на электродном буфере, содержащем 40 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 5і ацетата натрия, I мМ ЭДТА. Смесь агарозы в буфере нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. до полного растворения агарозы. Раствор агарозы, охлажденный до 50С, заливали в аппарат для вертикального или горизонтального плоского электрофореза. Аналитический электрофорез проводили в течение 16-20 часов при напряжении 20 вольт в вертикальном блоке агарозного геля. Препаративный электрофорез проводили в горизонтальном агарозном геле, толщиной I см. в течение 16 часов при напряжении 60 вольт. Гели окрашивали в растворе бромистого этидия (концентрация 0,5 мкг/мл) и просматривали в УФ свете.

II;2. Фракционирование ДНК в ПААГ.

Короткие рассеянные повторы ; вездесущие последовательности генома млекопитающих

Другим основным классом РП генома являются короткие повторы длиной 100-300 п.н. /8,94,152/. Они объединяют несколько индивидуальных семейств повторяющихся последовательностей с весьма различным числом копий. Некоторые семейства насчитаем вают до 5x10 членов, тогда как другие образованы всего несколькими .копиями. Первоначально количество семейств КРЇЇ и частота повторяемости их членов оценивалась лишь весьма приблизительно на основании анализа кинетики ренатурации геномной ДНК, Интерпретация таких данных сильно осложняется тем обстоятельством, что многие семейства КИТ представлены родственными, но индивидуально различающимися членами, скорость гибридизации которых отличается от скорости ренатурации полностью комплементарных последовательностей. С другой стороны, члены разных семейств КШ в некоторых случаях обнаруживают степень гомологии,достаточную в определенных условиях для перекрестной гибридизации /94/. Изучение свойств индивидуальных фрагментов ДНК, полученных с помощью методов генной инженерии, позволило значительно уточнить имеющиеся сведения.

Клейном и сотр. /104/ были исследованы 18 различных клонированных повторов генома морского ежа. Число копий этих последовательностей составляло от 3 до 12500. Для 13 последовательностей не выявилось заметной дивергенции внутри образуемых ими семейств, в то время как для остальных 5 дивергенция среди родственных копий обнаруживалась. Оцениваемая ; частота повторяемости одного из клонированных повторов зависела от жесткости проводимого гибридизационного эксперимента и составляла от 20 до 400 копий на гаплоидным геном. Это указывает на существование по крайней мере 10-20 индивидуальных подсемейств данной последовательности в геноме морского ежа /146/. В противоположность этому, гибридизационный анализ наиболее представительного семейства КРП человека - ALu.-ce-мейства, насчитывающего свяше 300 тыс. членов (см далее), не выявил наличия в нем явно выраженных подсемейств /135/. Биологическое значение различий в степени консервативности разных семейств КРП неясно. Не исключено, что они отражают различия в механизмах амплификации и дисперсии разных представителей КРП.

Следует также заметить, что факт наличия структурных подсемейств не обязательно отражает функциональную гетерогенность последовательностей данного семейства. Можно предположить, что члены более консервативных семейств или являются эволюционно более "молодыми" или по какой либо причине испытывают более жесткое давление отбора, стабилизирующего структуру последовательностей данного вида.

Работы по клонированию коротких повторов млекопитающих были начаты параллельно с исследованием МДТ дрозофилы. Было показано, что по крайней мере у приматов и грызунов КРП в отличие от таковых морского ежа объединяют весьма небольшое число семейств /57,93,107,137/.

В 1979 г. ряд индивидуальных КРП был клонирован в составе бактериальных плазмид. Так, Крамеров и сотр. /107/ провели отбор геномных клонов мыши, гибридизующихся с дсРНК В-типа /106/. Эти внутримолекулярные двуспиральные участки РНК были открыты в 1972 г. в составе пре-мРНК, причем,в отличие от межмолекулярных дсРНК-А,дсРНК-В короче (100-200 п.н.) и способны очень быстро ренатурировать после денатурации пре-мРНК, благодаря способности образовывать структуры типа шпильки /см.13/. Выделенные после обработки РНК-азой дсРНК-В уже могут быть денатурированы, так как при этом уничтожается петля, соединяющая взаимокомплементарные копии. Полученный таким образом меченный материал и был использован в качестве тест-пробы для гибридизации со случайным набором геномных клонов мыши.

Было установлено, что все множество клонов геномной ДНК мыши, гибридизующихся с дсРНК-В, распадается в основном на 2 индивидуальных семейства, оказавшихся доминирующими в геноме грызунов и получивших названия BI- и В2-семейств /107/. ЕЕ- и В2-элементы составляют соответственно половину и четверть всей дсРНК-В. Каждое из этих семейств представлено в геноме мыши примерно 5х104 копиями. Это наиболее часто встречающиеся КРП. Почти каждый клонированный фрагмент геномной ДНК, имеющей длину 10 тыс.п.н., содержит в своем составе повторяющиеся элементы В-типа. Наличие BI-последовательностей показано с помощью гибридизационных методов в ДНК всех исследованных грызунов /9/. Описаны аналоги повтора В2 в геноме хомяка /81/ и в составе второго интрона гена соматотропина крысы /128/. Продемонстрировано соседотвование последовательностей типа BI и В2 со стук-турными генами /161/. Все это дает основание называть В-эле-менты "вездесущими" повторами грызунов.

BI- и В2-элементы встречаются в геноме во взаимокомплементарных ориентациях. Наличием обращенных В-копий видимо объясняется происхоадение большинства внутримолекулярных шпилечных структур в гяЕНК. Последовательности-копии каждого из В-се-мейств не идентичны друг другу: отклонение от усредненной последовательности составляют около 8% /109,110/.

Детектирование и отбор рекомбинантных.клонов. Метод гибридизации с колониями

Транскрипция начинается с первого нуклеотида.В2-последовательности и заканчивается в олиго(Т)-участке А Т-зоны повтора. В некоторых В2-копиях этот участок терминации отсутствует, вследствие чего считывание продолжается за пределы А Т-зоны повтора и заканчивается уже в области прилежащей уникальной последовательности ДНК. В этом плане В2-элементы весьма напоминают первый мономер димерных /j/w-последовательностей, в то время как В1-элемен-ты ведут себя аналогично второй их части,которая, по-видимому, не содержит инициаторных участков РНК-полимеразы Ш /81,58/.

Возможно, некоторые типы транскриптов КРП, продуцируемые РВК-полимеразой Ш, имеют отношение к механизму их перемещения по геному - например, выполняют роль матриц для образования репликативных форм повторов в схеме с обратной транскрипцией /87,165/.

Наряду с дискретными по размеру неполиаденилированными транскриптами при гибридизации меченой BI- или В2-ДНК с фракционированной по размеру РНК-цитоплазмы выявляется низкомолекулярная BI- и В2-содержащая поли(А)+РНК /108/. Эта фракция гетерогенна по длине - ее размеры варьируют от 200 до 400 нуклеотидов. Вариабельность размера можно в значительной мере приписать вариабельности поли(А)-области, размеры которой колеблются от нескольких десятков до 200 нуклеотидов. Гибриды меченой малой В2- и ВІ-РБК с соответствующими ДНК стабильны в присутствии панкреатической РНК-азы, что предполагает отсутствие в этих РНК сколько нибудь протяженных последовательностей, отличных от поли(А) и В-элементов. Содержание низкомолекулярной полиаденилированной В2-РНК значительно выше, чем содержание аналогичной ВІ-РНК. Вместе с тем, их количества в опухолевых клетках (рак Эрлиха, клетки МОРС I04E) во много раз выше, чем в клетках нормальной печени. Эти РНК не входят в состав полисом, а обнаруживаются исключительно во фракции свободных РНК.

Пока нет точного ответа на вопрос образуются ли малые полиаденилированные РНК в результате процессинга тяжелых ядерных РНК или синтезируются независимо от них. Однако, недавно полученные данные по чувствительноститранскрипции В-элементов к УФ-облучению /72/ позволяют оценить размеры соответствующих им транскрипционных единиц (т.е. размер мишени облучения). В условиях, когда синтез BI- и В2-РНК,имеющих размеры пре-мРНК и мРНК полностью подавляется,синтез малых РНК остается неизменным. Это говорит в пользу того, что малые В-содержа-щие РНК образуются независимо от высокомолекулярных транс-криптов, возможно, при участии РНК-полимеразы Ш. С таким предположением согласуются и вышепреведенные данные, свидетельствующие о том, что клонированные А 1ц человека /53/ и В2 хомяка /81/ служат хорошими матрицами для РНК-полимеразы Ш в системе ІАь УіІґО »

Наряду с изучением первичных транскриптов, содержащих КРП, тщательно исследовался вопрос об организации этих последовательностей в мРНК эукариот. Рысков с соавт. /141/ одними из первых обнаружили присутствие в мРНК мыши участков, гомологичных двуспиральной фракции пре-мРНК, на основании чего было сделано предположение об участии двуспиральных шпилечных структур в процессинге пре-мРНК - возможно, в качестве сигнальных участков расщепления специфических нуклеаз.

В работах, проведенных на мРНК ксенопуса .было показано, что последовательности, транскрибированные с уникальных и повторяющихся участков генома перемежаются между собой в пределах целых молекул /40/.Позднее, исследуя мРНК, кодирующую кератин пера птиц, Локкет д соавт. /119/ обнаружили на 5»-конце этих молекул участки, транскрибированные с повторов ДНК, а на 3 -конце последовательности, транскрибированные с уникальной ДНК.

В экспериментах с клонированным фрагментом ДНК диктио-стеллума, содержащим одновременно уникальную и повторяющуюся последовательности генома, около 1% полисомных РНК гибридизо-валоськак с повторяющейся, так и с уникальной частями, причем оказалось, что участки, транскрибированные с одного и того же семейства повторов входят в состав нескольких различных мРНК /101/. Аналогично, последовательности, транскрибированные с уникальных и повторяющихся участков генома соседствуют в цитоплазматической поли (А) " "РНК мыши /114/ и эмбрионов морского ежа /37/.

В плане предполагаемого участия вездесущих повторов в эк-спрессии эукариотических генов особый интерес представляет исследование структуры и организации В-элементов млекопитающих в составе мРНК, поскольку при этом выявляются новые закономерности, связанные с их функционированием. Наличие этих элементов в составе полиаденилированных РНК было продемонстрировано в гибридизационных экспериментах с суммарной дсРНК /141,142/, дсРНК-В /106/ и клонированными BI-, В2- и ALtc-ML /58,108,141/. Однако, во всех этих случаях гибридизация могла объясняться частичной гомологией между повторяющимися элементами В-типа и поли(А)+РНК. Поскольку присутствие В-лоследо-вательностей в мРНК является или отражением структуры генома, т.е. непосредственного соседствования последовательностей структурных генов и повторяющихся участков генома и/или есть результат процессинга и сплайсинга пре-мРНК, в каждом конкретном случае организация этих повторов внутри транскрипта может иметь свои особенности.

В отличие от пре-мРНК, молекулы мРНК,по-видимому, содержат только одну из комплементарных цепей дсРНК, причем содержание этих последовательностей в мРНК оказывается на порядок ниже, чем в пре-мРНК /58,91/. Открытым остается вопрос о том, какие именно цепи взаимокомплементарных транскриптов вездесущих повторов и в какой степени представлены в мРНК эукариот ; также неясны конкретная локализация и взаимное расположение кодирующих и повторяющихся элементов внутри молекулы мРНК. Все эти вопросы могут быть решены только при условии получения исследуемых транскриптов в гомогенном состоянии. Последняя задача в настоящее время выполнима благодаря использованию новых методических приемов, включающих клонирование соответствующих РНК и определение их первичной структуры.

Рестрикционный анализ рекомбинантных клонов, содержащих последовательности, го мологичные В-элементам: определение.типа клонированных В-элементов

Лизис колоний проводили в течение 7-Ю мин. в 0,5 М М&ОН Чтобы предотвратить смывание бактериальных колоний во время лизиса, нейтрализации или фиксации, соответствующие растворы подавались под поверхность фяльтра и затем диффундировали в бактериальные колонии. Для этого фильтр с колониями помещали на фильтровальную бумагу, смоченную соответствующим раствором. Пеле инкубации с фильтра удаляли остатки раствора при небольшом отрицательном давлении. После обработки Мз.0//1фильтр с колониями 3 мин. нейтрализовали в I М растворе трис-HCI (рН 7,4), последовательно 3 раза и 15 мин. фиксировали в растворе 1,5 М /І/АСІ - 0,5 М трис-НСІ рН 7,4; далее 3-5 мин. сушили на воронке или I час на воздухе. После фиксации колоний последующие операции ПРОВОДИЛИ, погружая фильтры целиком в соответствующие растворы. Фильтры с фиксированными колониями инкубировали в растворе проназы в 2x5SC , в концентрации 2 мг/мл, при комнатной .температуре, сушили и промывали хлороформом на воронке Бюхнера. Затем фильтры сушили на воздухе до полного удаления хлороформа и ополаскивали в растворе 0,3 М хлористого натрия. Фильтры высушивали сначала на воздухе, затем 2 часа в вакууме при 80С. Перед гибридизацией фильтры инкубировали в растворе Денхардта (0,03$ поливинилпирролидона, 0,03$ ркол, 0,01$ бычий сывороточный альбумин), приготовленном на 4x5SC в 0,1$ додецилсульфате натрия, в течение 2-Зх часов при 65с.

Детектирование рекомбинантных колоний производили с помощью гибридизации с /32Р/кДНК, синтезированной на цитоплаз-матической поли(А)+мРНК клеток асцитной карциномы Эрлиха. Гиб-ридизащонный раствор содержал 4xSSC 0Д$ М& 500 мкг/мл поли(и) и раствор кДНК (2 млн; имп/мин). Гибридизацию проводили под вазелиновым маслом при 65С в течение 16-20 часов. Отмывку фильтров проводили в растворе 7 М мочевины, 2xSSC и 0,1$ ДСН при 42С в течение I часа; Эту опреацию повторяли 2-3 раза. Далее фильтры помещали в раствор 2х 5SC в 0,3$ ДСН и инкубировали в течение 2-Зх часов, меняя раствор после каждого часа инкубации. После отмывки фильтры высушивали на воздухе досуха и проводили радиоавтографйю;

Для радиоавтографии использовали рентгеновскую пленку PM-I (СССР). Полоски нитроцеллюлозных фильтров после гибридизации заворачивали в папиросную бумагу и помещали между двумя листами рентгеновской пленки. Экспозицию проводили при -70С с усиливающими экранами в течение 3-14 суток.

Колонии, обнаружившие положительную гибридизацию с / Р/кДНК, пересевали с помощью стерильной петли на новые чашки Петри с агаром, содержащим 20 мкг/мл тетрациклина и, рас-севая шприцами, получали единичные колонии. Эти единичные колонии повторно гибридизовали с / Р/кДНК. Окончательно отобранные колонии переносили стерильной петлей во флаконы, содержащие 0,4% агар, приготовленный на 1-среде и 20 мкг/мл тетрациклина. Музейные флаконы с клонами хранили в холодильнике при 4С.

Рекомбинантную ДНК выделяли из штамма S-CoLi у_ 1776 по методу, описанному Куртисом /41/. Клетки Є .со Li 1776, содержащие рекомбинантную ДНК, выращивали в L-среде с добавлением 100 мкг/мл ДАЛ и 4 мкг/мл тимидина при аэрации в течение ночи, при 37С. Культуру разводили в 10 раз той же самой питательной средой и подращивали при слабом покачивании до плотности 2-ЗхІО8 клеток/мл. Затем, к суспензии добавляли хлорамфеникол до концентрации 12,5 мкг/мл и еще подращивали 5 часов при аэрации. Клетки осаадали центрифугированием (4000 g, 5 мин.) и суспендировали в TEN -буфере (20 мМ трис-НСІ, 20 мМ ЭДТА, 0,8$ M&CL , рН 8,0). Для разрушения клеточной стенки бактерий добавляли лизоцим до концентрации 200 мкг/мл и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. Сферобласты вскрывали без детергента с помощью теплового шока в гипотонических условиях. Для этого смесь сферобластов оставляли при 0С 5 мин, с добавлением равного объема холодной воды, затем при 65-68С 5 мин,, и снова при 0С выдерживали двое суток. Хромосомную ДНК удаляли центрифугированием в роторе SW-4I при 30000 об/мин в течение 25 мин; при 3-4С. Плазмидную ДНК очищали центрифугированием в градиенте хлористого цезия, согласно методу, описанному Боливаром и сотр. /25/ (см.п.З).

Рестрикция ДНК рестрикционными эндонуклеазами PstT, Е00ЕГ, МьрТ7 5г. UЗА у Ninfl, ALuI, Тц$1 проводилась в растворе, содержащем 10 мМ трис-НСІ (рН 7,5) - 10 mAfg.CLz- І мМ дтиотреитола (или 7 мМ 2-меркаптоэтанола) - 50 мМ Лс#, при 37С в течение 1-3 часов. Обработку ДНК рестриктазами ШпсІ и У hoi проводили в аналогичном буфере, но без добавления Afa.CC Необходимые количества ферментов и время инкубации для полной или частичной рестрикции ДНК определяли эмпирически. После инкубации пробы прогревали при 65С в течение 2 мин, добавляли 0,5$-ный раствор бромфенолового синего, приготовленного на 50$ глицерине и наносили на агарозный гель,

Фракцинирование препаратов ДНК в агарозном геле проводили как это описано Маниатисом и соавт. /122/. 1-3$ агарозные гели готовили на электродном буфере, содержащем 40 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 5і ацетата натрия, I мМ ЭДТА. Смесь агарозы в буфере нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. до полного растворения агарозы. Раствор агарозы, охлажденный до 50С, заливали в аппарат для вертикального или горизонтального плоского электрофореза. Аналитический электрофорез проводили в течение 16-20 часов при напряжении 20 вольт в вертикальном блоке агарозного геля. Препаративный электрофорез проводили в горизонтальном агарозном геле, толщиной I см. в течение 16 часов при напряжении 60 вольт. Гели окрашивали в растворе бромистого этидия (концентрация 0,5 мкг/мл) и просматривали в УФ свете.

Универсальная ориентация повторяющихся последовательностей семейства В2 в полисомных и питоплазматических поли(А)+РНК клеток асцитной карциномы и печени мыши

В процессе рестриктного картирования кДНК-вставок для идентификации Psi/-фрагментов, расположенных на концах клонированных кДЖ, мы использовали обнаруженный нами эффект неэквивалентного мечения ДНК-полимеразой I / /-концов молекул ДНК, обусловленный особенностями первичной структуры прилежащих концевых участков. В процессе секвенирования выяснилось, что при введении в ДНК 3 -концевой метки с помощью ДНК-полимеразы I (фрагмент Кленова) по методу замещения /122/ всегда преимущественно метится Psi/-конец, непосредственно прилежащий к олиго( dC dGO-последовательности коннектора. Разница в эффективности мечения составляла, по нашим оценкам, 10-100 раз. Точное объяснение этого явления нам неизвестно. Возможно, описанный эффект связан с тем, что олиго( dC dQ-)-последовательность способствует формированию некой благоприятной для действия ДНК-полимеразы I конформации концевой части молекулы ДНК, либо обеспечивает необходимую термостабильность концевого участка.

Итак, для определения концевых Psi /-фрагментов, ДНК соответствующего клона обрабатывали эндонуклеазой Pstf, этот суммарный перевар после соответствующей очистки подвергали 3»-концевому мечению ДНК-полимеразой I и фракционировали электрофоретически в полиакриламидном геле. На рисунке 7

представлен радиоавтограф подобного эксперимента с ДНК клона № 54, содержащего самда длинную кДЖ-вставку. Две наиболее яркие полосы соответствуют а- и с- / /-фрагментам кДНК, которые содержат коннекторные олиго( do dGr)-последовательности, определяющие начало и конец вставки в составе гибридной плазмиды.(см, схему /122,стр.215/ реконструкции и дупликации векторного участка расщепления г si I, приводящих в процессе приготовления реком-бинантной ДНК к образованию концевых Psi /-участков вставки, примыкающих к линкерным ( dC dGr)-последовательностям) .

На рисунке 8 приведены рестрик-ционные карты кДНК-вставок 4-х исследованных клонов, соответствующих, как выяснилось, одной и той же В2-содержащей ИЖ печени мыши. Мы обозначили эту мРНК как В2+мЕНКх. Среди 15-ти исследованных клонов, содержащих В2-последовательность, 8 клонов содержали фрагменты В2+мРНКх, т.е. они составляли 0,5$ всех рекомбинантов. Это означает, что В2+мРЕКх является основным типом мРНК, содержащим В2-элемент и она богато представлена в печени мыши.

Во всех клонах В2-содержащий субфрагмент локализован на конце вставки. Мы заключили, что В2-элемент расположен на 3»-конце В2+мРНКх перед поли(А)-последовательностью. Косвенным образом это следует из факта эффективной гибридизации В2-содержащего фрагмента в составе длинных вставок с меченной Р кДНК, полученной на суммарной полиаденилированной РНК печени мыши (данные не приведены): средняя длина этой кДНК в наших опытах оценивается примерно в 400 нуклеотидов, поэтому естественно ожидать, что в условиях синтеза с олиго(d Т)-затравкой в меченой кДНК, полученной на поли(А)+РНК будут представлены главным образом 3»-концевые области тех молекул, размер которых превышает 400 нуклеотидов. Длина вставки клона № 54, например, составляет около 1000 п.н., а последующее детектирование вг+мРИК . в суммарных препаратах цитоплазматической и полисомной поли (А) " ТНК мыши показало, что ее полный размер достигает почти 2000 нуклеотидов (см. ниже). Кроме того, как уже отмечалось, в клоне № 91 обнаружена прилежащая к В2 концевая олиго( сШ-последовательность, могущая быть частью З -концевой поли(А)-последовательности мИй .

Определенное нами расположение В-элемента в составе мРНК . в свою очередь послужило косвенным указанием на то, какая именно цепь клонированной двуцепочечной кДНК соответствует этой мРНК. На рисунке 9 представлена схема организации и нуклеотидная последовательность 3 -концевой области B2+MPffiL. в виде соответствующей цепи кДНК ; для сравнения приведены также отличия от усредненной геномной последовательности В2 /НО/.

Похожие диссертации на Клонирование и характеристика мРНК, содержащей повторяющийся элемент В2 и богато представленной в печени мыши

Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А в печени инбредных линий мышейМихайлова Ольга Николаевна

Клонирование провирусов ретровирусов С-типа мышей и создание на их основе векторов экспрессии генов в клетках про- и эукариот Незнамов Н.С.

Токсические лектины омелы (Viscum album L.): клонирование и характеристикаСударкина Ольга Юрьевна

Клонирование и характеристика генов, отвечающих за формирование соцветия представителя сложноцветных - хризантемы Щенникова Анна Владимировна

Клонирование и функциональная характеристика гена ygjG из Escherichia coli K12 Самсонова Наталья Николаевна

Клонирование, анализ структуры и характеристика регуляторных областей двух паралогичных генов эстрогенсульфотрансферазы крысыАстапова Инна Игоревна

Клонирование гена бета-галактозидазы Thermoanaerobacter ethanolicus и характеристика продукта этого генаФокина Наталия Алексеевна

Индуцибельность ферментов биотрансформации ксенобиотиков в печени мышей, различающихся по чувствительности к гепатоканцерогенному действию орто-аминоазотолуолаЗахарова Людмила Юрьевна

Морфофункциональная характеристика печени мышей до и после перелома костей голениОчеретина Руфина Юрьевна

Особенности изменений фосфолипидов головного мозга и печени мышей при действии 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина и парентеральной фосфолипидной нагрузкиПодгорный, Геннадий Николаевич