Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Роль структурных и функциональных особенностей печени в интеграции метаболических путей 8
1.2. Структурные и функциональные изменения печени при действии повреждающих факторов 17
1.3. Способы коррекции структурных и функциональных нарушений в печени при действии повреждающих факторов 23
Глава 2. Материал и методы исследования . 26
2.1. Материал и структура исследования 26
2.2. Методы исследования 30
Глава 3. Результаты собственных исследований 34
3.1. Структурно - функциональные изменения печени в восстановительном периоде после перелома костей голени 34
3.1.1. Структурные изменения печени у мышей после перелома костей голени
3.1.2. Структурные изменения печени у мышей после перелома костей голени на фоне острой печеночной недостаточности 46
3.1.3. Функциональные изменения печени мышей после перелома костей голени 56
3.2. Экспериментальное обоснование способа коррекции
структурных и функциональных нарушений печени 60
3.2.1. Оценка эффективности применения аминокислотной смеси для восстановления структурных и функциональных характеристик печени после перелома костей голени 61
3.2.2. Оценка эффективности применения аминокислотной смеси в восстановительном периоде после перелома костей голени на фоне острой печеночной недостаточности 77
Глава 4. Заключение 89
Выводы 100
Список использованных сокращений и условных обозначений 101
Список использованных терминов . 102
Список литературы
- Структурные и функциональные изменения печени при действии повреждающих факторов
- Методы исследования
- Структурные изменения печени у мышей после перелома костей голени на фоне острой печеночной недостаточности
- Оценка эффективности применения аминокислотной смеси для восстановления структурных и функциональных характеристик печени после перелома костей голени
Введение к работе
Актуальность исследования. Организм животных и человека подвергается постоянному действию ряда повреждающих факторов различного генеза: биологических, химических и физических. Среди последних несомненное значение и актуальность имеет анализ влияния механической травмы организма на функциональную морфологию ряда органов и систем в организме. Особое значение в норме и патологии (эксперимент, клиническая медицина) имеет печень - жизненно важный полифункциональный орган.
В литературе немного сведений системного характера о функциональной морфологии печени при механической травме конечностей животных и человека. Известны работы (Верин В.К. с соавт., 2010; Лебедь М.Л. с соавт., 2006), посвященные анализу репаративных процессов в печени при моделировании повреждения костного скелета.
Механизмы ответных реакций, развивающихся в тканях травмированного сегмента конечности, изучены в достаточной степени с использованием различных методов исследования (Борисова И.В. с соавт., 2010; Силантьева Т.А. с соавт., 2011). Лишь в единичных работах исследованы структурные и/или функциональные изменения печени после травмы скелета (Лунева С. А.с соавт., 2005; Lopez-Hellin J. et al., 2005).
Степень разработанности темы. Нарушение функции печени при травме связывают с развитием гипоксии, нарушением кровообращения и, как следствие, с усилением эндотоксикоза (Верин В.К. с соавт., 2008; Лукьянова Е.С. с соавт., 2011). Выраженность этих изменений зависит от степени тяжести и характера травмы. При этом до настоящего времени отсутствует единая точка зрения о репаративной регенерации поврежденных тканей в восстановительном периоде (Duckworth A.D. et al., 2011).
Продолжается поиск эффективных средств для предупреждения и коррекции функциональных нарушений в организме после травмы (Garlick P.J., 2005). В ряде публикаций отмечаются положительные результаты применения различных биологических и фармакологических способов активации
метаболических процессов печени при заболеваниях опорно-двигательного аппарата (Blomstrand E., 2006 et al.; Stawiarska-Pieta B. et al., 2012).
Таким образом, несмотря на многолетнее изучение репаративной регенерации костей скелета, особый интерес вызывает исследование морфофункциональных изменений печени в восстановительном периоде после травмы и поиск эффективных средств, влияющих на течение репаративного процесса. Наличие этих проблем обосновывает актуальность настоящей работы в плане развития фундаментальных аспектов биологии и медицины.
Цель работы – выявить структурные, морфометрические и функциональные изменения печени после механического повреждения костей голени и обосновать метаболическую коррекцию репаративного процесса с помощью аминокислотной смеси
Задачи исследования:
-
Определить динамику структурных и морфометрических изменений сосудов и эпителиоцитов дольки печени у мышей в восстановительном периоде после перелома костей голени.
-
Исследовать динамику функциональных изменений печени у мышей в восстановительном периоде после перелома костей голени.
-
Выявить особенности структурных и функциональных нарушений печени в восстановительном периоде после перелома костей голени при моделировании острой печеночной недостаточности.
-
Провести сравнительный анализ структурных и функциональных изменений печени c накоплением минеральных и органических компонентов костной ткани в восстановительном периоде после перелома костей голени.
-
Оценить возможное протекторное действие аминокислотной смеси (в равном весовом соотношении лейцин, изолейцин, аргинин, метионин) на течение репаративного процесса.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование структурных и функциональных изменений печени мышей в восстановительном периоде после моделирования механической травмы
конечности. Показано, что в печени после перелома костей голени происходит активация репаративной регенерации гепатоцитов на фоне изменения морфометрических показателей структур печеночной дольки, нарушение органного кровотока и обусловленные этим изменения с проявлениями деструкции и дальнейшей активацией репаративного процесса.
Обнаружено, что изменяется химический состав костной ткани. Применение аминокислотной смеси оказывает протекторное действие на течение репаративного процесса в печени, это влияет на химический состав костной ткани при её репаративной регенерации у экспериментальных животных.
Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые сведения о морфофункциональных и функциональных изменениях печени, которые детализируют представления о развитии реактивных изменений органов при действии на организм повреждающих факторов. Результаты исследования печени на различных этапах восстановительного периода после перелома костей голени могут быть использованы при разработке способов оптимизации репаративного процесса. Использование аминокислотной смеси в восстановительном периоде после травмы может найти применение в травматологии и ортопедии, диетологии, гепатологии, терапии, токсикологии.
Методология и методы исследования.
Работа выполнена на базе экспериментального и клинико-экспериментального лабораторных отделов ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России. На проведение экспериментального исследования получено разрешение комитета по этике при ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России. Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназию осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Минздрава СССР от 12.08.1977) и требованиями инструкции №12/313 Министерства здравоохранения РСФСР «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальных биологических клиник» от 06.01.73 г.
Мышам 1-й группы (n=36) моделировали перелом костей голени (ПГ), животным 2-й группы (n=36) - острую печеночную недостаточность (ОПН) интоксикацией четыреххлористым углеродом (CCl4), в 3-й группе (n=36) на 3 сутки после моделирования ОПН животным моделировали ПГ. Животные 1-3-й групп в ходе эксперимента получали стандартный рацион питания сбалансированный по белку и углеводам (приказ № 1179 от 10.10.83 г. «Об утверждении нормативов затрат кормов лабораторных животных в учреждениях здравоохранения»). Мыши 4-й группы (n=36) после моделирования ПГ содержались на изокалорийном, обедненном белком рационе (ИКОБР). Животные 5-й группы (n=36) после моделирования ПГ также содержались на ИКОБР, но недостаток белка в пище у них компенсировали введением в рацион аминокислотной смеси (АС). Животные 6-й группы (n=36) после моделирования ОПН, содержались на ИКОБР с возмещением недостатка белка в пище АС. Животным 7-й группы (n=36) перелом костей голени моделировали на 3 сутки после интоксикации CCl4, и в ходе эксперимента мыши содержались на ИКОБР с возмещением недостатка белка АС. В группу интактных животных (ИН) вошли мыши 2-х (n=14) и 3-х (n=12) месяцев постнатального развития. Животные 4-7-й групп получали ИКОБР при содержании перевариваемого протеина не более 0,88г/сутки, в котором источником белка служил пшеничный глиадин, неполноценный по содержанию аргинина, гистидина, метионина, лизина. В 5-7-й группах недостаток белка восполняли путем смешивания мучной массы со смесью аминокислот L-ряда: лейцин, изолейцин, аргинин, метионин (Sigma) в отношении 1:1:1:1 (патент РФ на изобретение № 2454227, Стогов М.В. с соавт., 2012), в количестве, равном суммарному содержанию аминного азота в стандартном рационе.
Для питья животные получали дистиллированную воду в свободном доступе.
Перелом костей голени моделировали путем механического повреждения сегмента конечности в верхней трети с медиальной поверхности (патент РФ №
2456927). Острую печеночную недостаточность - внутрибрюшинным введением 20% раствора CCl4 на оливковом масле.
Из эксперимента животных выводили на 3, 7 и 28 сутки после перелома (кроме 2 и 6-й групп, которые выводились из эксперимента на 3, 6 и 31 сутки после введения CCl4). Животных взвешивали индивидуально на электронных весах AND (Япония), определяли массу тела, печени, отношение массы печени к массе тела. Материалом исследования служили: печень, кости, сыворотка крови.
Морфологические и морфометрические методы исследования. Для гистологического исследования образцы левой боковой доли печени фиксировали в 10% нейтральном формалине, срезы окрашивали гематоксилином - эозином, по методу Ван-Гизон. На гистологических срезах определяли диаметр сосудов печени (центральных и междольковых вен, междольковых артерий, синусоидных капилляров, междольковых желчных протоков), с помощью объект-микрометра ОМ-ДТ7.216.009ПС и окулярной измерительной линейки (объектив х40). С помощью АПК «ДиаМорф-cito» (Россия, рег. удостоверение МЗ РФ № 98/219-137) оцифровывали поля зрения центральной, интермедиарной, периферической зон печеночной дольки (объектив х40). Используя программу для анализа изображений «ВидеоТесТ-Мастер 4,0» измеряли диаметр одноядерных форм гепатоцитов, определяли площадь сечения ядра и цитоплазмы, вычисляли ядерно-цитоплазматический индекс гепатоцитов (ЯЦИ), объем клетки и ядра согласно принципу M. Delesse (Автандилов Г.Г., 2002); процентное содержание двуядерных форм гепатоцитов в 3-х зонах печеночной дольки; митотический индекс гепатоцитов (на 1000, ).
Биохимические методы исследования. Для биохимического исследования забирали образцы печени, крови, кости травмированного сегмента конечности.
Образцы кости высушивали в лиофильной сушке HETO LyoLab 3000 (Дания). Определяли содержание фосфата, используя наборы реагентов фирмы «Витал Диагностикс» (РФ), содержание оксипролина по реакции с реактивом Эрлиха.
Активность АсАТ, АлАТ в супернатанте печени определяли унифицированным методом, используя наборы реагентов фирмы «Витал Диагностикс». Концентрацию общего белка определяли по методу Лоури. Содержание общих липидов печени находили гравиметрическим методом. Концентрацию общего белка, альбумина, мочевины (в супернатанте крови и гомогенате печени), глюкозы, общего кальция и активность аминотрансфераз в сыворотке крови определяли на биохимическом фотометре StatFax 1904+, Awareness (США, рег. удостоверение ФСЗ № 2004/1258), используя наборы реагентов фирмы «Витал Диагностикс» (РФ).
Статистические методы исследования. Результаты исследования обрабатывали методами непараметрической статистики, Значимость различий между двумя выборками оценивали с помощью W-критерия Вилкоксона для независимых выборок. Значимость межгрупповых различий определяли с помощью непараметрического критерия Крускала-Уоллиса, с последующим множественным сравнением с использованием критерия Данна.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
В восстановительном периоде после перелома костей голени в печени мышей наблюдаются структурные и функциональные изменения, свидетельствующие о вовлечении органа в процесс адаптационных перестроек организма, определяющих характер репаративной регенерации кости после нарушения ее целостности.
-
Применение аминокислотной смеси (лейцин, изолейцин, аргинин, метионин в равном весовом соотношении) оказывает протекторное действие на морфофункциональное состояние печени после травмы и на течение репаративного процесса в костной ткани.
Достоверность результатов исследования. Исследование выполнено на достаточном по объёму фактическом материале (278 самцов мышей линии CBA в возрасте 2-х месяцев постнатального развития), с использованием современных морфологических, морфометрических и биохимических методов исследования. С использованием АПК «ДиаМорф-cito» (Россия, рег.
удостоверение МЗ РФ № 98/219-137), программы для анализа изображений «ВидеоТесТ-Мастер 4,0». Полученные результаты анализированы с помощью адекватных статистических методов, используя пакет анализа данных приложения «Microsoft Excel» и программу AtteStat 1.0.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 6 опубликованы в изданиях перечня ВАК Минобрнауки РФ, рекомендованного для публикации результатов диссертационных исследований, имеется патент РФ на изобретение (№ 2456927).
Апробация работы. Материалы диссертационного исследования доложены: на I и II съездах травматологов и ортопедов УрФО (Курган, 2008); на V международной конференции АСАМИ (Санкт-Петербург, 2008); на международной научно-практической конференции «Остеопороз и остеоартроз – проблема ХХI века» (Курган, 2009); на I всероссийском конгрессе ASAMI (Курган, 2009); на международной конференции «Илизаровские чтения» (Курган, 2010; 2011; 2012); на международной научно-практической конференции «Физиологические механизмы адаптации человека» (Тюмень, 2010).
Объем и структура работы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, главы с описанием результатов собственного исследования, состоящей из двух разделов, заключения, выводов, списка литературы. Результаты представлены в виде 37 таблицы и 30 рисунков. Библиографический указатель включает 253 источников: из них 165 – отечественных, 88 – зарубежных.
Структурные и функциональные изменения печени при действии повреждающих факторов
Печень - одна из наиболее крупных железистых органов позвоночных. Абсолютная и относительная масса печени подвержены значительным колебаниям в зависимости от вида, возраста и питания [63, 69, 157].
На основании филогенеза и онтогенеза структурно-функциональной единицей печени считается классическая печеночная долька, включающая железистую паренхиму, расположенную вокруг центральной вены и по периферии окруженную прослойками междольковой соединительной ткани, содержащей печеночные триады. Эпителиальные клетки располагаются в виде анастомозирующих между собой печеночных балок, которые по толщине состоят из двух гепатоцитов, образующих желчные канальцы. Между балками располагаются особого вида капилляры – синусоиды. В печеночной дольке выделяют 3 зоны: центральная - примыкает к центральной вене (соответствует перивенулярной зоне ацинуса), периферическая окружает портальный тракт (соответствует перипортальной зоне ацинуса), интермедиарная (промежуточная) располагается между центральной и периферической зонами [29, 35, 119].
Гепатоциты находятся примерно в одинаковых условиях функционирования в пределах зоны дольки (ацинуса) [148]. Данные ряда авторов свидетельствуют о зависимости ультраструктуры гепатоцитов, их функциональной и регенераторной активности, чувствительности к гепатотропным ядам, от локализации в пределах зон ацинуса (дольки). Однако механизм этого явления остается до сих пор не выясненным [148, 250, 253].
Считается, что полного соответствия между зонами дольки и ацинуса нет. Вместе с тем, существование двух подходов при анализе морфофункциональных характеристик печени, в настоящее время, является достаточно обоснованным, облегчает понимание морфогенеза структурных нарушений печени при анализе различных зон функциональной организации печени.
Основной функциональной клеткой печени является гепатоцит. По данным современных исследований, гепатоцит представляет собой полигональную клетку, в которой выделяют два полюса - базальный (синусоидальный) и апикальный (билиарный), которые различаются характером расположения органелл и функций. Экзокринную секрецию гепатоцит выполняет через апикальный (билиарный) полюс, а эндокринную – через базальный (синусоидальный), обращенный в перисинусоидальное пространство Диссе. Латеральной и контактной поверхностями гепатоциты соединяются друг с другом в составе печеночной балки [35].
По данным современных исследований, в процессе эволюции животных клеточный состав печени не менялся [9]. Отмечено изменение количественных показателей. Прослеживается тенденция к увеличению диаметра артериолы от рыб к млекопитающим [81]. Структура гепатоцитов имеет видовую специфичность по количественным показателям размеров ядер, строению ядрышкового аппарата, митохондрий, ГЭС, лизосом, по содержанию гликогена и липидов. Отмечен видоспецифический характер распределения в печени клеток Купфера, клеток Ито, однако не выявлено особенностей в локализации двуядерных гепатоцитов [9].
Известно, что у млекопитающих к моменту рождения дифференцировка печени в основном завершена, гепатоциты в постнатальном онтогенезе обладают низкой пролиферативной активностью. При отсутствии стимуляции роста у крыс гепатоциты делятся 1-2 раза в течение жизни [12, 93, 190, 248]. Характерным способом физиологической регенерации гепатоцитов у млекопитающих является полиплоидизация за счет ацитокинетических митозов, у птиц одноядерные полиплоидные гепатоциты, у эктотермных оба способа в равной мере [9]. У млекопитающих по мере развития и окончательного формирования печени происходит постепенное дифференцирование регенераторной реакции. Клеточный механизм регенерации, со временем начинает сочетаться с внутриклеточным, удельный вес последнего нарастает, и во взрослом организме он приобретает большее значение в компенсации нарушенных функций, чем клеточное деление. Вместе с тем на протяжении всего онтогенеза он сочетается с другим механизмом регенерации – митозом [98, 121].
Развитию печени посвящены многочисленные работы, которые показывают, что гистогенез этого органа у млекопитающих и человека осуществляется сходным образом [33, 113, 138]. По данным ряда авторов, гепатобласты/гепатоциты образуются из эпителиальных клеток, а синусоидные клетки дифференцируются из клеток мезенхимы [10, 141]. Однако в современной литературе также известна возможность развития гепатоцитов из стволовой кроветворной клетки мезенхимальной природы [33, 93, 220].
Морфологическая организация сосудистой системы печени занимает особое место в структурной организации печени, обеспечивая её многофункциональность [6, 54].
Известно, что в печени плода и новорожденного сосудистая система значительно преобладает над другими тканевыми структурами [156].
Дифференцировка кровеносных сосудов по диаметру происходит в первый год после рождения [91, 156]. В процессе онтогенеза у крыс гемомикроциркуляторное русло печени последовательно усложняется. Увеличивается количество компонентов сосудистого русла. Просвет внутриорганных желчевыводящих путей уменьшается от периода новорождённого до конца первого месяца постнатальной жизни, а к шести месяцам увеличивается [91].
Морфометрические исследования сосудов дольки печени свидетельствуют о взаимосвязи их дифференцировки с функциональной активностью органа [81]. Исследования ряда авторов показывают, что стимулятором развития и дифференцировки печени во внутриутробном периоде и после рождения является функциональная (пищевая) нагрузка [156]. В печени обнаружено увеличение числа активно функционирующих структур – печеночных долек, гепатоцитов, а также ультраструктур в каждой клетке. В частности, авторы ряда работ указывают на то, что структурная организация ядра гепатоцитов (крысы, человека) напрямую коррелирует с функциональным состоянием печени [15, 121, 139, 212].
Методы исследования
Работа выполнена на базе экспериментального и клинико-экспериментального лабораторных отделов ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России. Экспериментальные исследования проведены на лабораторных мышах-самцах линии СВА. Материалом исследования служили: печень, кости, сыворотка крови. В ходе выполнения исследования применялись гистологические, биохимические и статистические методы.
На проведение экспериментального исследования получено разрешение комитета по этике при ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России. Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназия осуществлялись в соответствии с требованиями Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18.03.1986, ETS № 123); «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 № 755); требованиями инструкции №12/313 Министерства здравоохранения РСФСР «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальных биологических клиник» от 06.01.73 г.
Экспериментальное исследование выполнено на 278 самцах мышей линии CBA в возрасте двух месяцев постнатального развития, весом 25-30 г. Эксперимент проводился в весенне-летний период 2007-2010 гг. Животные были разделены на 7 экспериментальных групп.
1-я группа (n=36) - мышам моделировали перелом костей голени (ПГ). 2-я группа (n=36) - животным моделировали острую печеночную недостаточность (ОПН) путем интоксикации четыреххлористым углеродом (CCl4).
3-я группа (n=36) - животным моделировали острую печеночную недостаточность, затем на 3-и сутки после интоксикации CCl4 этим мышам моделировали перелом костей голени (ОПН+ПГ).
Все животные 1-3-й групп в ходе эксперимента получали сбалансированный, стандартный рацион питания.
4-я группа (n=36) - животным моделировали перелом костей голени, после перелома костей голени эти мыши получали изокалорийный, обедненный белком рацион (ИКОБР) (ПГ+ИКОБР).
5-я группа (n=36) - животным моделировали перелом костей голени, после перелома костей голени эти мыши получали изокалорийный, обедненный белком рацион (ИКОБР), но недостаток белка в пище этим животным компенсировали введением в рацион смеси аминокислот (АС) лейцин, изолейцин, аргинин и метионин в равных весовых соотношениях (ПГ+ИКОБР+АС).
6-я группа (n=36) - животным моделировали острую печеночную недостаточность, после интоксикации CCl4 эти мыши получали изокалорийный, обедненный белком рацион с возмещением недостатка белка в пище за счет введения в рацион смеси аминокислот (ОПН+ИКОБР+АС).
7-я группа (n=36) – животным моделировали острую печеночную недостаточность, затем на 3-и сутки после интоксикации CCl4 этим мышам моделировали перелом костей голени, в ходе эксперимента мыши содержались на изокалорийном, обедненном белком рационе с возмещением недостатка белка в пище за счет введения в рацион смеси аминокислот (ОПН+ПГ+ИКОБР+АС).
В группу интактных животных вошли мыши двух месяцев постнатального развития (ИН) (n=14) и мыши трех месяцев постнатального развития (n=12). Распределение и количество животных экспериментальных групп
Примечание. ИН – интактные животные; ПГ – перелом костей голени; ОПН – моделирование острой печеночной недостаточности; ИКОБР – изокалорийный обедненный белком рацион; АС – аминокислотная смесь. - для 2-й и 6-й групп сроки эвтаназии: 3-и сутки после введения CCl4; 6-е сутки после введения CCl4 (соответствуют третьи суткам после травмы); 31-е сутки после введения CCl4 (соответствуют 28-м суткам после перелома)
Животные интактные и экспериментальных 1, 2 и 3-й групп получали обычный рацион вивария сбалансированный по белку (3,3 г/сутки перевариваемого протеина) и углеводам (приказ № 1179 от 10.10.83 г. «Об утверждении нормативов затрат кормов лабораторных животных в учреждениях здравоохранения»). Животные 4-7-й групп получали изокалорийный углеводный, обедненный белком рацион при содержании перевариваемого протеина не более 0,88г/сутки, в котором источником белка служил пшеничный глиадин, неполноценный по содержанию аргинина, гистидина, метионина, лизина. Мышам 5-7-й групп, получавшим изокалорийный, обедненный белком рацион, недостаток белка восполняли путем смешивания мучной массы со смесью аминокислот L-ряда: лейцин, изолейцин, аргинин, метионин (Sigma) в отношении 1:1:1:1 (патент РФ на изобретение № 2454227), в количестве, равном суммарному содержанию аминного азота в стандартном рационе. Для питья животные получали дистиллированную воду в свободном доступе. Перелом костей голени у животных моделировали по оригинальной методике путем механического повреждения сегмента конечности в верхней трети с медиальной поверхности (патент РФ № 2456927). Острую печеночную недостаточность моделировали путем внутрибрюшинного введения 20 % раствора четыреххлористого углерода на оливковом масле. Развитие ОПН подтверждено данными гистологического исследования и биохимического анализа крови.
Из эксперимента животных выводили в утренние часы декапитацией на 3, 7 и 28-е сутки после перелома (кроме 2-й и 6-й групп, см. примечание к табл. 1). Животных взвешивали индивидуально на электронных весах AND (Япония), определяли массу тела (г), массу печени (г), вычисляли отношение массы печени к массе тела (%). Все манипуляции на мышах проводили под ингаляционным эфирным наркозом. Распределение животных по группам проводили методом случайной рандомизации [18, 75], матрица формирования групп сравнения представлена в таблице 2. Таблица 2 - Формирование групп сравнения
Структурные изменения печени у мышей после перелома костей голени на фоне острой печеночной недостаточности
По результатам исследования эффективности применения смеси аминокислот (в равном весовом соотношении: лейцин, изолейцин, аргинин, метионин), проведен сравнительный анализ структурных и функциональных изменений печени мышей трех экспериментальных групп. Мыши 1-й (контрольной) группы в восстановительном периоде после перелома костей голени находились на стандартном рационе питания, сбалансированном по белку (3,3 г/сутки перевариваемого протеина) и углеводам. Мыши 4-й группы в восстановительном периоде после перелома костей голени находились на изокалорийном, обедненном белком рационе (ПГ+ИКОБР). Мыши 5-й группы в восстановительном периоде после перелома костей голени находились на изокалорийном, обедненном белком рационе, но при этом недостаток белка восполняли тестируемой смесью аминокислот (ПГ+ИКОБР+АС) (табл. 2).
При светооптическом исследовании печени животных 4-й группы, получавших изокалорийный, обедненный белком рацион, при сравнении с 1-й группой (контрольной), через 3-е суток после травмы обнаружена лейкоцитарная инфильтрация, носящая диффузный характер, в интермедиарных зонах печеночных долек. Выявлены единичные клетки Купфера с набухшими ядрами между эндотелиальными клетками. Гепатоциты - несколько округлые по форме с четкими границами. Ядра имели четкие границы, в них определялись 1-2 ядрышка (рис. 26а).
Через 28 суток после перелома костей голени у животных 4-й группы лейкоцитарная инфильтрация отмечена в единичных печеночных дольках. Обнаружены группы гепатоцитов, в которых мембраны клеток и их ядер были нечеткие. Ядра были либо интенсивно окрашены, либо с явлениями кариолизиса. Очаги цитолиза распределялись мозаично в трех зонах печеночных долек (рис. 26б).
Неравномерное кровенаполнение сосудистой сети центральных, междольковых вен и синусоидных капилляров было выражено в меньшей степени (рис. 27а). Гепатоциты и их ядра имели четкие границы. В ядрах определялись 1-2 ядрышка.
Через семь суток эксперимента выявлены гепатоциты с интенсивно гомогенно окрашенными ядрами, либо с гетерохроматином по периферии и светлой нуклеоплазмой в центре.
Через двадцать восемь суток после травмы лейкоцитарная инфильтрация, носящая диффузный характер, выявлена в трех зонах печеночных долек. Обнаружено наличие центральных, междольковых вен и синусоидных капилляров с равномерным кровенаполнением. Клетки, ядра и ядрышки имели четкие границы. Гепатоциты были многогранные по форме. В цитоплазме обнаружены мелкие вакуоли со светлым содержимым. Ядра располагались в центре клеток с 1-2 ядрышками (рис. 27б).
У животных 5-й группы, отмечены признаки нормализации кровенаполнения сосудистой сети, наличие центральных, междольковых вен и синусоидных капилляров с равномерным кровенаполнением. Морфофункциональные изменения эпителиоцитов печени проявлялись преимущественно в ядрах. Относительная масса печени мышей 5-й группы на третьи (8,0±0,87%), седьмые (7,4±0,40%) и двадцать восьмые сутки (6,8±0,27%) эксперимента была значимо высокой при сравнении с показателями 4-й группы соответственно на третьи (6,5±0,48%), седьмые (6,8±0,39%) и двадцать восьмые сутки (5,6±0,33%) после перелома костей голени. При этом через двадцать восемь суток после травмы была в пределах значений возрастной нормы.
По результатам морфометрического исследования, диаметр центральных вен у мышей, получавших с пищей АС на фоне ИКОБР, был на уровне показателей интактных животных на всех сроках эксперимента, но значимо низким через 7 и 28 суток после перелома при сравнении с животными 1 и 4-й групп (табл. 6). Таблица 6 - Диаметр центральных вен печени у мышей в динамике эксперимента
Диаметр междольковых вен у животных 4 и 5-й групп на исследуемых этапах восстановительного периода был в пределах значений интактных животных, но значимо низким при сравнении с животными, получавшими обычный сбалансированный по белку и углеводам рацион вивария (табл. 7). Таблица 7 - Диаметр междольковых вен печени у мышей в динамике эксперимента (x±Sx, мкм)
В группе животных, получавших с пищей аминокислотную смесь на фоне ИКОБР он был значимо снижен на 3-и и 7-е сутки эксперимента при сравнении с животными интактными и 1-й группы (контрольной), к концу наблюдения - был в
У животных 5-й группы отмечено значимое повышение диаметра междольковых желчных протоков через 3-е суток эксперимента при сравнении с животными 1 и 4-й групп. Через 7 суток после перелома костей голени этот показатель был значимо ниже относительно животных интактной и 1-й (контрольной) групп.
Через 28 суток были выявлены значимо низкие показатели диаметра междольковых желчных протоков у животных, получавших изокалорийный углеводный, обедненный белком рацион (4-я группа) при сравнении с животными, получавшими обычный сбалансированный по белку и углеводам рацион вивария (1-я группа).
По результатам морфометрического исследования гепатоцитов, на всех этапах восстановительного периода после перелома костей голени у мышей, находившихся на изокалорийной, обедненной белком диете (4-я группа), выявлено значимое уменьшение объема клеток в трех зонах печеночных долек при сравнении с животными интактными, 1 и 5-й групп (табл. 11).
Оценка эффективности применения аминокислотной смеси для восстановления структурных и функциональных характеристик печени после перелома костей голени
Выявленное увеличение относительной массы печени животных 3-й группы на 3 сутки и 2-й группы на 6 сутки эксперимента, вероятно, связано с изменением проницаемости мембран гепатоцитов, эндотелиоцитов.
Как показал анализ морфологического исследования печени, при действии двух повреждающих факторов (интоксикация и травма) морфофункциональные нарушения печени носят более выраженный характер, это может являться причиной нарушения костного обмена.
Действительно, по результатам исследования химического состава кости отмечается снижение содержание коллагена на 7-е сутки эксперимента у мышей 1, 2 и 3-й групп, к концу эксперимента у мышей с ОПН. У животных 1-й группы через 28 суток после травмы содержание коллагена оставалось повышенным относительно нормы. Снижение уровня коллагена через 7 суток, возможно, обусловлено как увеличением резорбции костного матрикса, так и недостаточностью его синтеза в группах с ОПН. Обнаруженное повышение соотношения Са/Р на этом сроке эксперимента в 1-й группе, вероятно, указывало на изменение структуры костного матрикса после перелома. Снижение соотношения Са/Р на 28-е сутки эксперимента во 2-й группе свидетельствовало о влиянии интоксикации на структуру костного матрикса. У животных 3-й группы отмечено снижение всех компонентов костного матрикса (кальция фосфата, коллагена), обусловленное действием двух факторов – травмы и CCl4.
Таким образом, представленные результаты исследования химического состава кости позволяют предположить, что морфофункциональные изменения печени в результате интоксикации сопровождали снижение содержания неорганических и органических компонентов кости, осложняя процессы репаративной регенерации кости после перелома на фоне ОПН. Анализ функциональных изменений печени позволяет полагать, что выявленное снижение содержания общих липидов печени на всех этапах восстановительного периода, вероятно, связано с повышением энергозатрат организма после травмы [73] и перестройкой энергетического обмена [45, 147]. Данные субстраты могли являться дополнительным и/или альтернативным источником энергии в восстановительном периоде.
Повышение содержания мочевины печени при высокой активности аминотрансфераз печени через 3-е суток после травмы свидетельствовало о обезвреживании аммиака, образующегося в реакциях дезаминирования аминокислот при повышенном катаболизме белков, в том числе и распаде белков травмированных тканей. Снижение содержания этого метаболита к концу эксперимента, возможно, связано с использованием аминного азота в процессах синтеза. Вероятно, в восстановительном периоде после травмы компенсаторные реакции печени, с одной стороны, были направлены на поддержание уровня белка, как в органе, так и в крови, а с другой – на утилизацию катаболического азота тканей поврежденных травмой органов.
Таким образом, можно заключить, что в восстановительном периоде после перелома костей голени на фоне ОПН происходило углубление структурных изменений печени, обусловленных интоксикацией четыреххлористым углеродом, нарушением кровообращения, интоксикацией токсичными продуктами аутолиза травмированных тканей. Морфофункциональные нарушения печени влияли на минеральный и органический состав костного матрикса, во многом определяя течение репаративной регенерации.
При анализе эффективности применения аминокислотной смеси на течение репаративного процесса по результатам гистологического исследования печени у животных 4, 5, 6 и 7-й групп отмечаются признаки регенерации с 3-х суток эксперимента: нормализация кровенаполнения сосудистой сети у мышей 5-й группы, внутриклеточная регенерация гепатоцитов у животных 7-й группы.
Наблюдались наименее выраженные изменения относительной массы печени у мышей, получавших смесь аминокислот в восстановительном периоде после перелома костей голени. У животных 5-й группы выявлено повышение на 3-и и
7-е сутки после травмы при сравнении с животными, содержавшимися на стандартном (1-я группа) и изокалорийном, обедненном белком рационе без добавления аминокислот (4-я группа). У животных 6 и 7-й групп установлено снижение на 7-е сутки эксперимента при сравнении с группами контроля (2 и 3-й). К концу эксперимента этот показатель был в пределах значений интактных животных.
Анализ результатов морфометрического исследования позволил выявить особенности реакции сосудов печени на добавку в пищу смеси четырёх аминокислот. Обнаруженные увеличение диаметра центральных, междольковых вен и синусоидных капилляров были менее выраженными у мышей, получавших с пищей аминокислотную смесь на фоне изокалорийном, обедненном белком рацион (5-я группа) при сравнении с мышами, содержавшимися на стандартном (1-я группа) и изокалорийном, обедненном белком рационе без добавления аминокислот (4-я группа). Если при переломе костей голени наблюдалось уменьшение диаметра междольковых артерий через 3-е и 7 суток, то при изокалорийном, обедненном белком рационе эти изменения более выражены и длительны (до 28-суток), а применение в этих условиях смеси аминокислот способствовало менее выраженному уменьшению диаметра междольковых артерий. Можно заключить, что применение аминокислотной смеси (лейцин, изолейцин, аргинин, метионин в равном весовом соотношении) оказывает протекторное действие на сосуды печени.
