Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.АФК 6
1.1 .Источники возникновения АФК 7
1.2. Последствия действия АФК 7
2. Антиоксиданти 9
2.1. Супероксиддисмутазы (SOD) 10
2.2. Каталаза 11
2.3. Глутатионпероксидазы (GPx) 13
2.4. Пероксиредоксины (Ргх) 15
2.4.1. Открытие пероксиредоксинов. Эволюция Ргх и их классификация 15
2.4.2. Каталитический цикл Ргх 15
2.4.3. Структура Ргх 17
2.4.4. Регуляции активности Ргх 21
2.4.5. Ргх из различных организмов 25
Ргх прокариот 25
Ргх архебактерий 26
Ргхэукариот 26
2.4.6. Ргх человека 31
Prxl 31
Ргх2 33
РгхЗ 33
Ргх4 34
Ргх5 36
Ргхб 37
2.4.7.Возможное применение Ргх в медицине 45
II. Материалы и методы 47
1. Материалы 47
2. Методы 48
2.1. Выделение РНК 48
2.2. Определение чистоты и концентрации нуклеиновых кислот 49
2.3. ОТПЦР 50
2.4. Мутагенез Ргхб человека 51
2.5. Электрофорез ДНК 52
2.6. Сравнение уровня экспрессииргхбХ. laevis на разных стадиях развития 52
2.7. Клонирование и экспрессия генов ргхб 53
2.8. Выделение и очистка белков Ргхб 53
2.9. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 54
2.10. Иммунноблоттинг 55
2.11. Определение активности SOD слитой конструкции Mn-SOD-Ргхб 55
2.12. Определение антиоксидантной активности 56
2.13. Определение пероксидазной активности 56
2.14. Определение констант Михаэлиса 56
2.15. Определение оптимума рН и температуры 56
2.16. Определение фосфолипазной активности 57
2.17. Определение термостабильности 57
2.18. Исследование структуры Ргхб 58
2.19. In silico методы 58
III. Результаты исследований и их обсуждение 59
1. Получение генов ргхб 59
2. Экспрессия генов ргхб 59
3. Получение ферментов Ргхб 62
4. Антиоксидантная активность Ргхб 64
5. Пероксидазная активность Ргхб 64
6. Субстратная специфичность Ргхб 66
7. Оптимум рН и температуры пероксидазной реакции 67
8. Фосфолипазная активность Ргхб 68
9. Термостабильность Ргхб 71
10. Структура Ргхб 74
11. Перспективы применения Ргхб в медицине 81
Заключение 85
Выводы 86
Публикации по теме диссертации 87
Список цитируемой литературы 88
Приложение 108
Введение к работе
Актуальность проблемы
Пероксиредоксины (Ргх, КФ 1.11.1.15) - сравнительно недавно открытое семейство селен-независимых пероксидаз. Ргх осуществляют ферментативную деградацию Н2О2, органических гидропероксидов и пероксинитрита [Hofmann В. ct al., 2002; Flohe L. ct al., 2007]. Пероксиредоксины - широко представленная группа ферментов обнаруженная как в про - так и в эукариотических организмах. У млекопитающих известно шесть типов пероксиредоксинов. По числу активных остатков цистеина (Cys) в каталитическом центре и механизму ферментативной реакции, Ргх млекопитающих подразделяют на типичные 2-Cys (Ргх1-4), атипичные 2-Cys (Ргх5) и І-Cys (Ргхб). Особый интерес представляет Ргхб, который в отличие от других Ргх, восстанавливает гидроперекиси фосфолипидов и обладает активностью фосфолипазы А2 [Kim T.S. et al.,1997, 1998], функция которой на сегодняшний день недостаточно изучена.
Ргхб в большей степени представлен в эпителиальных тканях. Так, Ргхб является основной пероксидазой эпителия верхних дыхательных путей и легких крысы и, по-видимому, играет наиболее важную роль в антиоксидантной защите этих органов [Новоселов В.И. и др. 1999, 2003]. Важная антиоксидантная функция Ргхб была продемонстрирована в работах с нокаутом гена ргхб мыши. Нокаутные по гену ргхб мыши, характеризовались снижением выживаемости, высоким уровнем окисления белков и значительными повреждениями многих органов, несмотря на нормальный уровень экспрессии генов других антиоксидантних ферментов таких, как каталаза, глутатионпероксидаза и супероксид дисмутаза [Wang X. et al., 2003].
В ряде работ показана защитная роль Ргхб при различных патологиях: кожи [Kumin А. et al., 2006], легких [Kinnula V.L. et al., 2004; Fisher A.B. et al., 2004], глаз [Kubo E. Et al., 2008] и нервной системы [Power J. et al., 2008]. Терапевтическая активность Ргхб была продемонстрирована при лечении ран у крыс, после механических и термических травм кожи, а также после химических ожогов верхних дыхательных путей [Новоселов В.И. и др. 2000,2003].
Таким образом, существуют основания полагать, что Ргхб может применяться в терапии заболеваний, патогенез которых связан с окислительным стрессом.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы является сравнительное исследование Ргхб из различных источников с перспективой последующего создания на их основе лекарственного препарата антиоксидантного действия.
Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:
Клонировать и экспрессировать различные гены ргхб.
Сравнить ферменты по активности и субстратной специфичности.
Определить оптимальные условия ферментативной реакции.
Сравнить Ргхб по термостабильности.
Провести структурный анализ белков Ргхб методами кругового дихроизма и ЯМР. Научная новизна
В одних экспериментальных условиях проведено сравнительное исследование физико-химических свойств Ргхб из различных источников. Впервые получены гены и белки Ргхб шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Изучена динамика экспрессии двух генов ргхб в ходе развития головастика, а также экспрессия генов ргхб в различных органах взрослой лягушки. Методами кругового дихроизма и ЯМР показано, что все изученные Ргхб близки как по вторичной, так и по третичной структуре. Экспериментально подтверждено для одного из Ргхб шпорцевой лягушки и дрозофилы (Xenl и DPx6005 соответственно) отсутствие активности фосфолипазы А2, предсказанное теоретически из аминокислотной последовательности. Помимо активности фосфолипазы А2, для Ргхб человека, дрозофилы DPx2540 и шпорцевой лягушки Хеп2 обнаружена ранее неизвестная деметилазная активность.
Научно-практическая пенность
Гомологичные ферменты могут довольно сильно отличаться по основным физико-химическим свойствам: активности, специфичности к различным субстратам и термостабильности. Ранее не предпринимались попытки провести сравнительный физико-химический анализ Ргхб из различных источников в одних экспериментальных условиях. Такое сравнение играет важную роль в последующем создании лекарственного препарата на основе Ргхб, так как фермент, для достижения максимального терапевтического эффекта, должен обладать достаточно высокой активностью и стабильностью.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на IV Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Крым, 2008), на Всероссийской конференции молодых ученых «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданти» им. академика Н.М. Эммануэля (Москва, 2008), на 12-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2008), на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в реферируемых журналах.
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего/ /б/источников. Работа изложена т((0 страницах машинописного текста и содержит 39 рисунков и У таблиц.
Структура Ргх
Функция белка напрямую зависит от его структуры, и поэтому знание пространственной структруры белка играет важнейшую роль в понимании его функции на молекулярном уровне. Но структурное исследование белка это не только координаты его атомов, но также его динамические и энергетические свойства. С момента публикации первых данных по структуре Prx (Ргхб человека) в 1998 [Choe H.J. et. al, 1998], эта область знаний росла очень быстро и на сегодняшний день известно более 35 структур Prx (включая дикие типы и мутантные формы), среди которых имеются представители типичных 2-Cys, атипичных 2-Cys и І-Cys пероксиредоксинов. Анализ этих структур показал, что Prx имеют общую для всех пероксиредоксинов тиоредоксиновую укладку [Copley S.D. et al. 2004], с небольшими отличиями в виде вставок дополнительных вторичных элементов структуры (различные вариации длины петель и изменение протяженности N- и С-концевых областей) (рис.3.(а)).
Ядро структуры, включает в себя 7 Р-структур и 5 а-спиралей. Пять центральных антипараллельных Р-структур (Р5-Р4-рЗ-Р6-р7) формируют р - лист, который с одной стороны прикрывается Р-шпилькой и двумя а-спиралями (Р1-Р2-а1-а4), а с другой стороны тремя a-спиралями (а2, аЗ и а5) (рис.3.(6)).
В полностью свернутой конформации Ргх (как показано на рис.3), пероксидазный остаток цистеина Cp-SH находится на первом витке а2-спирали и разматывание одного или двух витков этой спирали, в ходе катализа, является общим явлением (локального разворачивания) для всех пероксиредоксинов.
Аминокислотная последовательность и структура пероксидазного центра консерватина среди всех представителей Ргх. В восстановленной форме пероксидазный остаток цистеина (Cp-SH) находится в узком, доступном для растворителя, кармане (который сформирован мотивом «спираль-петля») (рис.4(а,б)). Cp-SH находится на первом витке а-спирали и окружен тремя консервативными для всех Ргх аминокислотными остатками: Рго44, Thr48 и Argl27 (нумерация для 2-Cys Ргх). Рго44 защищает активный остаток цистеина Cp-SH от растворителя, а также предотвращает его дальнейшее переокисление пероксидом из Cp-SOH (обратимое состояние) до Cp-SC H, CP-SO3H (необратимое состояние). Консервативный Thr48 образует водородную связь с атомом серы пероксидазного цистеина, способствуя тем самым депротонированию Cp-SH. Кроме того, водородную связь с Cp-SH образует Argl27. В результате действия этих трех аминокислотных остатков на Cp-SH, константа диссоциации (рКа) пероксидазного цистеина значительно ниже 7.3 , чем у свободного остатка цистеина 8.5. Сайт-направленным мутагенезом было показано, что остатки Thr48 и Argl27 являются абсолютно необходимыми для пероксидазной активности Ргх. Так как пероксидазный (Ср) и восстанавливающий (Сг) цистеины пространственно разобщены (как в случае типичных так и нетипичных 2-Cys Ргх) более чем на 13А, для образования между ними дисульфидной связи и последующего восстановления Cp-SOH, требуется локальное разворачивание мотива «спираль-петля» (рис.4(в)). На сегодняшний день известны и изучены локально развернутые формы для представителей типичных и атипичных 2 Cys Ргх, однако для І-Cys Ргх такие данные отсутствуют. Но, по-видимому, процесс локального разворачивания а2-спирали и формирование так называемой Ср-петли является общим для всех Ргх [Wood Z.A. et al. 2003].
Кристаллическая структура белка, помимо информации о координатах атомов, дает также важную информацию об их структурной подвижности. Такие данные можно получить из температурных факторов атомов (В-факторы). Атомы с большой величиной В-фактора чаще всего расположены в неструктурированных участках белка (петли). На рис.3(a) структура Ргх окрашена в различные цвета: красные оттенки - более подвижные участки, а синие - наименее подвижные. Из этого рисунка становится понятно, что наиболее подвижными участками структуры (на поверхности) являются петли, по которым, кстати, чаще всего происходят вставки и делеции [Bruns СМ. et al., 1999]. Как отмечалось ранее, все Ргх имеют общую топологию укладки и трехмерная структура довольно консервативна, несмотря на отличия в аминокислотной последовательности. Однако значительные структурные отличия между разными представителями семейства Ргх наблюдаются на олигомерном уровне организации (четвертичная структура). Атипичные 2-Cys пероксиредоксины - это мономерные ферменты, в то время как типичные 2-Cys и І-Cys Ргх являются олигомерными и гомодимерными белками, соответственно (рис.5). Необходимо отметить, что три из известных типичных 2-Cys Ргх закристаллизованы в виде декамеров (5 гомодимеров), которые формируют комплексы в виде тороида или замкнутых колец; такая олигомерная организация структуры Ргх влияет на его ферментативную активность (см. ниже) [Chang T.S. et al. 2002].
Ргхб
Ргхб - представитель 1-Cys Ргх, содержащих только один активный остаток цистеина (Cys47). Ргхб обнаружен во всех клетках млекопитающих, однако его наибольшие количества выявляются в цитоплазме эпителиальных клеток: легких, дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта и ротовой полости, а также в клетках печени и поджелудочной железы. Экспрессия гена ргхб млекопитающих регулируется фактором роста кератиноцитов, эпителиальным фактором роста, а также окислительным стрессом [Wang X. et al. 2003; Kim H.S. et al. 2003].
Открытие Ргхб. Впервые Ргхб был получен из цилиарного тела глаза быка [Shichi Н., Demar J., 1990] и бьш назван селен - независимой глутатион пероксидазой (NSGPx), на основании N - концевой последовательности аминокислот. Позже было обнаружено, что клонированный фрагмент кДНК человека (названный ORF6) кодирует этот белок и по аминокислотной последовательности имеет гомологию с пероксиредоксинами [Nagase Т., et al. 1995]. Затем бьш получен Ргхб из легких крысы и назван в то время Са2+ независимой фосфолипазой А2 (aiPLA2) [Kim T.S., etal. 1997]; позднее по частичной аминокислотной последовательности было установлено, что aiPLA2 имеет гомологию с белком человека, кодируемый ORF6. Исследования рекомбинантных белков Ргхб человека и крысы подтвердили наличие как пероксидазной [Kang S.W., et al. 1998] так и фосфолипазной активности [Kim T.S. et al. 1998]. Для Ргхб также известны другие исторические названия: LTW4 [Iakoubova О.А. et al., 1997], АОР2 (antioxidant protein 2) [Phelan S.A., 1999], белок 26 клеток Clara [Power J.H. et al, 1999], p67phox - связывающий белок [Leavey P.J. et al., 2002]; так как экспрессия гена ргхб регулируется KGF (фактор роста кератиноцитов), Ргхб бьш назван как KGF - регулируемый ген 1 [Frank S., et al. 1997].
Пероксидазная активность Ргхб. Подобно другим пероксиредоксинам Ргхб восстанавливает пероксиды различной природы, но при этом, помимо Н2О2 и алкил-гидропероксидов, способен восстанавливать пероксиды фосфолипидов [Chen J.W. et al. 2000]. Пероксидазный каталитический центр Ргхб формируется тремя высококонсервативными остатками: His39, Cys47 и Argl32 (рис.9).
В отличие от других представителей семейства Ргх, в ходе каталитического цикла Ргхб, не использует тиоредоксин в качестве восстановителя и до сих пор, нет однозначных данных о физиологическом доноре электронов для Ргхб. Для неселеновой глутатион пероксидазы (Ргхб), полученой из цилиарного тела глаза быка, была продемонстрирована глутатион - зависимая пероксидазная активность [Shichi Н., Demar J., 1990]. Однако позже для рекомбинантного Ргхб быка, полученного в Escherichia coli, было показано, что глутатион (GSH) не является восстановителем при катализе [Peshenko I. V., Shichi, Н., 2001]. Было сделано предположение, что такое отличие в использовании GSH в качестве донора электронов между нативным и рекомбинантным Ргхб быка, может быть связано с пост-трансляционными модификациями нативного белка. При этом для рекомбинантного Ргхб быка показано, что некоторые неприродные тиолы такие как дитиотриетол (DTT), Na2S, H2S, а также дигидролипоеваевая кислота поддерживали относительно низкий уровень пероксидазной активности. Низкая эффективность этих тиолов как восстановителей возможно связана с тем, что скорость образования дисульфидной связи между ними (R-SH) и окисленным остатком активного цистеина (Cp-SOH) меньше, чем скорость восстановления из R-S-S-Cp до R-SH и Cp-SH [PeshenkoI.V., Shichi Н., 2001].
На рекомбинантном Ргхб быка было показано, что небольшие по размеру пероксиды (Н2О2) гораздо быстрее окисляют активный остаток цистеина Cp-SH, чем более крупные молекулы пероксидов (гидропероксид кумена, гидропероксид трет-бутипа). Также оказалось, что низкомолекулярные тиолы (например H2S) быстрее восстанавливают Cp-SOH в Cp-SH, чем более крупные молекулы тиолов (например DTT, GSH) [Peshenko I. V., Shichi Н., 2001]. Таким образом, неспособность рекомбинантного Ргхб быка использовать GSH в качестве восстановителя, по-видимому, связана со структурными особенностями пероксидазного активного центра. Кристаллографический анализ рекомбинантного Ргхб человека показал, что активный остаток цистеина расположен в узком кармане (диаметром около 4 А) глобулы [Choi H.J. et al., 1998], в который неспособны проникнуть крупные молекулы тиолов. По-видимому, для того, чтобы GSH восстанавливал Cp-SOH, необходимы конформационные перестройки в области пероксидазного активного центра (раскрытие кармана). Оказалось, что такие конформационные перестройки могут происходить под действием к глутатион S-трансферазы (7iGST). Так, из легких быка был выделен гетеродимер Ргхб и 7iGST, который проявлял пероксидазную активность в присутствии глутатиона [Manevich Y. et al., 2004]. В экспериментах in vivo также было показано, что Ргхб способен использовать GSH в качестве донора электронов в присутствии TtGST. Доставка окисленного — неактивного Ргхб с помощью липосом в клетки линии Н441, которые не экспрессируют Ргхб, но экспрессирующие 7tGST, увеличивала пероксидазную активность клеток. С другой стороны доставка обоих белков (Ргхб + TtGST) в клетки MCF-7, в которых отсутствует экспрессия 7tGST, увеличивала пероксидазную активность клеток, но доставка белков по отдельности не приводило к изменению их пероксидазной активности [Manevich Y., et al., 2004]. В экспериментах in vitro было показано, что рекомбинантный Ргхб в присутствии GSH неспособен восстанавливать гидропероксиды, однако добавление в эквимолярном соотношении рекомбинантного 7tGST приводило к появлению пероксидазной активности. По мнению авторов, это может объясняться локальным разворачиванием активного центра Ргхб и его доступностью для молекулы GSH (разворачивание мотива «спираль-петля», см. раздел «структура Ргхб») [Ralat L.A., et al., 2004]. Образование гетеродимера Ргхб и TUGST и формирование межсубъединичной дисульфидной связи, с ее последующим восстановлением молекулой глутатиона, напоминает каталитический цикл типичных 2-Cys пероксиредоксинов (см. раздел «каталитический цикл») [Ralat L.A., et al., 2006]. Таким образом, возможным восстановителем Ргхб в клетке является глутатион (GSH), при условии доступности активного остатка цистеина [Manevich Y., et al., 2004].
В работе Ли СП. и др. [Lee S.P. et al., 2001] было показано, что циклофиллин А может восстанавливать окисленный Ргхб, однако механизм его действия пока неизвестен и эти результаты не были воспроизведены в других лабораториях. Есть данные, которые указывают, что дигидролипоевая и аскорбиновая кислота также могут выступать в роли физиологических доноров электронов в ходе каталитического цикла Ргхб [Peshenko I. V., Shichi Н., 2001; Monteiro G. et al. 2007].
Пероксидазный остаток цистеина Ргхб может переокисляться из сульфеновой кислоты (CpS-OH) до сульфиновой (CpS-C 2H). Возможный механизм восстановления CpS-CbH до CpS-OH для Ргхб до сих пор неизвестен. Для Prxl-4 показано, что сульфоредоксины (Srx) в присутствии АТР восстанавливают сульфиновую кислоту до сульфеновой, однако Srx не восстанавливают переокисленный (CpS-ОгН) цистеин Ргхб [Chang T.S. et al., 2004].
Субстратная специфичность Ргхб. Ргхб способен восстанавливать широкий спектр пероксидов, включая Н2О2, небольшие органические гидропероксиды такие как гидропероксид трет-бутила и гидропероксид кумена, гидропероксиды жирных кислот и гидропероксиды фосфолипидов. При этом Ргхб способен восстанавливать как свободные молекулы гидропероксидов жирных кислот, так и в составе фосфолипидов [Fisher A. et al., 1999; Peshenko I.V. et al., 2001]. Пероксидазная активность Ргхб человека в присутствии GSH и TCGST составляет от 1.8 до 5 мкмоль/мин/мг белка [Manevich Y. et al. 2004], в присутствии неприродного тиола - DTT составляет от 30 до 200 нмоль/мин/мг белка [Kang S. et al., 1998]. Константы Михаэлиса (Км) Ргхб человека, отражающие субстратную специфичность (чем выше значение Км, тем ниже сродство и субстратная специфичность и наоборот), для органических и неорганических пероксидов находятся в пределах 100-180 мкМ [Manevich Y. et al. 2004], которые коррелирует с полученными нами данными (см. «результаты»).
Структурные особенности Ргхб, влияющие на пероксидазную активность. Структурные исследования окисленного Prx2 (Cp-SOH), его промежуточной формы (гомодимера, образующего между субъединицами Ср—S-S-Cr связь в ходе каталитического цикла) [Hirotsu S. et al., 1999], восстановленной формы Prx5 [Evrard С. et al., 2004] и окисленного Ргхб (со стабильной сульфиновой кислотой Cp-SChH) [Choi H.J. et al., 1998], позволили определить структурные детерминанты пероксидазной активности пероксиредоксинов. В разделе «структура Ргх» было отмечено, что для всех Ргх характерна тиоредоксиновая укладка, однако для Ргхб характерно наличие дополнительного С — концевого субдомена, функция которого на сегодняшний день неясна, но есть предположение, что он может играть роль при образовании гетеродимера между Ргхб и TCGST [Ralat L.A. et al., 2006]. Необходимо отметить, что на рекомбинантном Ргхб человека, в котором с помощью методов белковой иженерии этот С-концевой домен был «отрезан», наблюдалось снижение пероксидазной активности примерно на 20% [Nekrasov A.N. et al., 2007].
Фосфолипазная активность Ргхб. В отличие от остальных пероксиредоксинов, Ргхб помимо пероксидазной активности, в кислой среде проявляет активность Са2+ независимой фосфолипазы А2 (iPLA2), которая может играть важную роль в метаболизме фосфолипидов эпителиальных клеток легких [Fisher A. et al., 2005]. Фосфолипазная активность Ргхб пропадает после добавления ингибиторов сериновых протеаз, это привело к предположению, что в активный центр iPLA2 входит серии [Kim T.S. et al., 1997]. Анализ аминокислотной последовательности Ргхб указал наличие «липазного мотива» GlyXSerXGly (X - любая аминокислота), который характерен для всех серин-зависимых липаз [Bhanot Р.К. et al., 2005]. Этот мотив не найден в других Ргх. Позже, исследование кристаллической структуры Ргхб подтвердило, что серии входит в состав каталитического центра, расположенного на поверхности молекулы и включающего в себя триаду аминокислот: His26, Ser32 и Aspl40 (рис.9).
Фосфолипазная активность Ргхб
Ргхб является бифункциональным ферментом, обладающий пероксидазной и относительно низкой Са2+ независимой фосфолипазной активностью (iPLA2) [Fisher А.В. et al. 2005]. При этом необходимо отметить, что в отличие от пероксидазного центра, который расположен в кармане глобулы, фосфолипазный центр расположен на поверхности молекулы (см. «обзор литературы» рис.9).
Несмотря на небольшую активность iPLA2 (20-50 нмоль/мин/мг белка - по данным Kim T.S. et al., 1997; Chen J.W. et al., 2000), по-видимому, она является достаточно важной в условиях окислительного стресса. Так, в недавних исследованиях in vivo на культуре клеток человека, было показано, что активность iPLA2 может значительно повышаться при переокислении активного остатка цистеина (из состояния -SH до -SO3H), которое происходит при высоких концентрациях пероксидов; возрастание активности iPLA2, в свою очередь, может запускать апоптоз [Kim S.Y. et al., 2008]. Таким образом, Ргхб служит своего рода датчиком предельно допустимой концентрации пероксидов в клетке, при которой ее дальнейшее существование нецелесообразно [Wood Z.A. et al., 2003].
Из сравнения последовательности аминокислот белков DPx2540 и DPx6005, и соответственно Xenl и Хеп2 видно, что у всех белков имеется нормальный центр пероксидазной активности, однако в центре фосфолипазной активности у белков Xenl и DPx6005 имеются замены аминокислот (рис.25). Таким образом, теоретически белки Xenl и DPx6005 не должны иметь фосфолипазной активности, что и было подтверждено нами экспериментально (рис.26).
Появление лизофосфотидилхолина («Б» на рис.26), образующегося в результате отщепляется пальмитоила во 2-м положении триглицерида, свидетельствует об активности iPLA2 ферментов Ргхб человека, шпорцевой лягушки Хеп2 и дрозофилы DPx2540. Ферменты Xenl и DPx6005 не обладают активностью iPLA2.
Интересно отметить, что для Ргхб человека, DPx2540 и Хеп2 помимо активности iPLA2 была обнаружена ранее неизвестная активность (предположительно -деметилазная), в результате которой дипальмитоилфосфотидилхолин (DPPC - «А» на рис.26) переводится в дипальмитоил-фосфотидилэтаноламин (DPPE - «В» на рис.26), что может быть результатом отщепления трех метальных групп от молекулы холина. В качестве контроля проводили экстракцию метанол:хлороформом (1:2) из различного количества Ргхб, с целью проверки - не является ли новая активность лишь результатом связывания Ргхб с бактериальным DPPE во время синтеза в E.coli. Как видно из рис.26 (II) напротив маркера DPPE нет пятен из экстрактов белка Ргхб Хеп2, что свидетельствует о появлении DPPE в ходе реакции, катализируемой Ргхб. Таким образом, по-видимому, для Ргхб найдена новая, ранее не изученная активность. Однако роль этой активности пока неясна и требует дальнейших исследований.
Перспективы применения Ргхб в медицине
Относительно недавно, в экспериментах на крысах была продемонстрирована более высокая антитромбозная активность двух антиоксидантных белков (каталазы и Cu/Zn-SOD человека), сшитых между собой химическим способом, по сравнению с использованием этих ферментов по отдельности [Maksimenko A.V., 2005]. Преимущество использования двух сшитых антиоксидантных белков, по-видимому, связано с более эффективной нейтрализацией АФК в очагах патологий, вызванных окислительным стрессом.
В лаборатории Механизмов рецепции ИБК РАН, ведется работа по созданию рекомбинантного слитого белка F («F» - fusion, от англ. - слияние, сплав), состоящего из Mn-SOD E.coli и Ргхб человека. Нами была создана генно-инженерная конструкция, в которой под промотором Mn-SOD последовательно располагаются гены Mn-SOD E.coli и ргхб человека. Таким образом, к N-концу Ргхб человека «пришит» Mn-SOD E.coli, а к С-концу шесть остатков His (рис.33).
Как видно из рис. 33 молекулы Mn-SOD и Ргхб «сшиты» между собой в области нерегулярных участков (петель), поэтому предполагалось, что такая химерная конструкция не должна значительно влиять на сворачивание и конечную структуру белков.
Получение (F) с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе
Как отмечалось выше, на С-конце слитого белка (F) содержится Hisag, что делает возможным его очистку на Ni-NTA агарозе. В клетках E.coli Rosetta удается достичь достаточно высокого уровня экспрессии (F), под промотором Mn-SOD, сопоставимого с экспрессией Ргхб человека под Т7 промотором в клетках E.coli BL21(DE3) (рис.34.А). Однако необходимо отметить, что около 90% слитого белка находится в водонерастворимой фракции клеток (рис.35), так называемых тельцах включений, поэтому в дальнейших исследованиях необходимо провести подбор условий по увеличению наработки водорастворимого (F) или получения активного (F) из телец включений. На иммунноблотте (рис.34.Б) видно, что Ргхб человека присутствует в клетках E.coli в нескольких формах: димер ( 50кДа), мономер ( 25кДа) и две укороченные формы ( 11кДа и 14кДа). Необходимо отметить, что 14 кДа форма Ргхб ранее была обнаружена в лаборатории Механизмов рецепции ИБК РАН в обонятельном эпителии крыс [Быстрова М.Ф., Буданова Е.Н., 2007]. Авторами было сделано предположение, что эта процессированная форма Ргхб крысы может играть определенную роль в клетках, однако в нашем случае белок был рекомбинантным, а не нативным, и, по-видимому, укороченная форма является следствием протеолиза Ргхб человека ферментами Е.соїі. В случае (F) также видно, наличие дополнительных минорных полос, ниже мажорной полосы, соответствующей ожидаемому молекулярному весу слитых Mn-SOD-Ргхб ( 47 кДа), что также может свидетельствовать о протеолизе (F) ферментами бактерии. По-видимому, при получении ферментов Ргхб и (F), помимо PMSF и леупептина, которые мы использовали при выделении, необходимо использовать дополнительные ингибиторы протеаз.
Проверка активности (F)
Получив достаточное количество (F) необходимой чистоты 90% (рис.35), определили активности химерного белка. Молекулярный вес (F) 47 кДа (Ргхб 25 кДа, Mn-SOD 22 кДа), поэтому в 1 мг (F) примерно в 2 раза меньше молекул Ргхб и Mn-SOD, чем в 1 мг белка Ргхб или Mn-SOD, следовательно, при расчете активности на 1мг (F) ожидается двукратное снижение активностей.
Супероксиддисмутазная активность (F) составила 9 ед./мг белка, что практически соответствует ожидаемой величине 17 ед./мг белка Mn-SOD E.coli [Roberts В. and Hirst R., 1996], где одна ед. соответствует количеству белка, необходимого для проявления 50% дисмутации супероксид радикалов.
Пероксидазная активность (F) составила 100 нмоль/мин на мг белка, что также соответствует ожидаемой величине по сравнению с Ргхб человека (200 нмоль/мин на мг белка).
Несмотря на некоторые проблемы при получении белка (F) (образование телец включений при синтезе), есть основания полагать, что дальнейшие исследования в этом направлении позволят разработать новый антиоксидантный препарат, который сможет найти применение при лечении патологий, вызванных окислительным стрессом.
