Содержание к диссертации
Введение 6
Глава 1. Обзор литературы 13
1. Развитие представлений о методах классификации бактерий 13
Виды информации, используемые в бактериальной таксономии 13
Генотипические методы определения таксономической принадлежности и родства микробных культур 16
Определение соотношения азотистых оснований в ДНК (Г+Ц состав) и уровня геномного родства методом ДНК-ДНК-гибридизации 16
Методы типирования ДНК 18
Типирование, основанное на изучении хромосомных и плазмидных профилей штаммов бактерий 18
Типирование, основанное на использовании метода полимеразной цепной реакции 20
1.2.3. Секвенирование рибосомных РНК как метод, позволяющий
наиболее точно проводить таксономическую идентификацию бактерий ....22
1.3. Сравнительный анализ методов ДНК-ДНК-гибридизации и
определения нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК при
идентификации бактерий на разных таксономических уровнях 27
2. Методы, используемые для идентификации и классификации
молочнокислых бактерий 29
Проблемы идентификации и классификации термофильных молочнокислых кокков 29
Свойства штаммов молочнокислых бактерий и методы,
применяемые для их идентификации 31
2.2.1.Фенотипические свойства термофильных молочнокислых
бактерий 31
Особенности Г+Ц состава молочнокислых бактерий 33
Применение метода ДНК-ДЬЖ-гибридизации для идентификации молочнокислых бактерий 34
Применение метода геномной рестрикции для идентификации молочнокислых бактерий 36
Плазмиды молочнокислых бактерий 37
Использование метода ДНК-типирования с помощью ПЦР для идентификации молочнокислых бактерий 40
Использование данных анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК для идентификации молочнокислых бактерий и
установления их филогенетического родства 42
3 Изучение молочнокислых бактерий с точки зрения их практического
применения 44
Молочнокислые бактерии как закваски 44
Молочнокислые бактерии как пробиотики животных и человека 46
Свойства культур молочнокислых бактерий, обеспечивающие их использование как заквасок при производстве кисломолочных продуктов питания и пробиотиков 49
Антагонистические свойства молочнокислых бактерий 49
Способность ароматообразования у молочнокислых бактерий 51
Фагоустойчивость молочнокислых бактерий 52
Энтерококки как стартовые культуры при производстве кисломолочных продуктов питания и пробиотиков 53
Патогенные энтерококки 54
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. Объекты и методы исследований 57
1. Штаммы и условия культивирования 57
1Л. Объекты исследований 57
1.2. Среда и условия культивирования термофильных
молочнокислых бактерий 58
2. Методы исследований 59
Микробиологические методы исследования 58
Генетические и молекулярно-биологические методы исследования 61
Выделение ДНК 61
Анализ ДНК 62
Амплификация генов и фрагментов генов 64
Определение нуклеотидной последовательности фрагмента reHal6SpPHK 66
2.3. Филогенетический анализ 66
Глава 3. Результаты и обсуждение 68
1. Идентификация отечественных штаммов термофильных
молочнокислых стрептококков с использованием подходов,
основанных на изучении сходства их геномов 68
Определение нуклеотидного состава ДНК у штаммов термофильных молочнокислых бактерий 68
Анализ сходства тотальных геномов штаммов термофильных молочнокислых бактерий по результатам
ДНК- ДНК-гибридизации 72
13. Определение размера геномов термофильных молочнокислых
бактерий и анализ сходства хромосомной ДНК методом
геномной рестрикции и пульс-гель электрофореза 79
1.4. Изучение плазмидных профилей штаммов
термофильных молочнокислых бактерий 84
2. Изучение фенотипических особенностей и биохимических
свойств термофильных молочнокислых бактерий 86
2.1. Микроскопирование 86
2.2, Изучение ферментационной активности термофильных
молочнокислых кокков 87
2.3. Сравнительный анализ степени термофильности
молочнокислых термофильных кокков 87
Изучение способности штаммов термофильных молочнокислых бактерий к росту при повышенных концентрациях NaCl в среде 88
Изучение способности штаммов термофильных молочнокислых бактерий синтезировать экзополисахарид , 89
Способность штаммов термофильных молочнокислых
бактерий ферментировать эскулин 89
2.7. Способность штаммов термофильных молочнокислых
бактерий ферментировать различные сахара 91
2.8. Устойчивость штаммов термофильных молочнокислых
бактерий к бактериофагам 93
2.9. Устойчивость штаммов термофильных молочнокислых
бактерий к различным антибиотикам 94
2.10. Способность штаммов термофильных молочнокислых
бактерий к гемолизу 96
Генотипирование штаммов термофильных молочнокислых бактерий методом видоспецифичной полимеразной цепной реакции (species-specific PCR) 97
Определение нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК штаммов термофильных молочнокислых бактерий для установления их систематического положения. Филогенетический анализ результатов сравнения генов 16S рРНК 101
Тестирование признаков вирулентности у молочнокислых
энтерококков методом ПЦР 108
Заключение 114
Выводы 117
Список цитируемой литературы 119
Приложение 146
Введение к работе
Постановка проблемы и её актуальность.
Разнообразие кисломолочных продуктов обусловлено применением бактериальных заквасок, состав которых представлен различными видами молочнокислых бактерий. Наиболее широко для производства кисломолочных продуктов используются культуры мезофильных лактококков и термофильных стрептококков. Специфика вкуса, консистенция и ряд других свойств кисломолочных продуктов зависят от штаммов, входящих в состав бактериальной закваски. Способность термофильных молочнокислых бактерий расти и размножаться при температуре 42-45С является важным условием технологического процесса, связанного с производством таких кисломолочных продуктов как йогурт и некоторые виды сыров.
В последнее время возрос интерес к изучению именно термофильных молочнокислых бактерий. В большей степени это связано с развитием молочной промышленности в мире вообще и в России в частности и как следствие этого производством новых кисломолочных продуктов и поиском новых штаммов молочнокислых бактерий, пригодных для их использования в качестве заквасок. Однако до сих пор штаммы, использующиеся как закваски в России и странах СНГ, недостаточно изучены, нет чётко выработанной схемы, по которой бы определялась не только технологическая пригодность, но и безопасность использования вновь внедряемых в молочную промышленность культур бактерий.
Молочнокислые бактерии выделяют из различных источников: самоквасных кисломолочных продуктов, частей растений, в частности цветов, а также с овощей и фруктов. Поэтому очень важно правильно провести все этапы выделения и идентификации для определения видовой принадлежности бактерий, в дальнейшем планируемых для использования в
качестве заквасок. До недавнего времени идентификация и классификация молочнокислых бактерий проводилась на основе изучения морфологических, физиологических и биохимических признаков. Очевидная ограниченность этих методов требует для более точной идентификации микроорганизмов исследований геномных характеристик, что является особенно важным в отношении штаммов, рекомендуемых для использования при производстве кисломолочных продуктов питания и пробиотиков. Отечественные штаммы термофильных молочнокислых бактерий, использующиеся в пищевой промышленности, практически не анализировались по генотипическим характеристикам и их уровень дивергенции по сравнению с зарубежными штаммами и типовыми культурами не изучен [Ганина и др., 1999]. Так, например, отнесение многих промышленных штаммов термофильных стрептококков к виду Streptococcus thermophilus было условным вследствие недоступности ранее многих методов идентификации бактерий. В связи с этим несомненный интерес представляют исследования с применением различных методов идентификации молочнокислых термофильных бактерий, вводимых в состав бактериальных заквасок для получения кисломолочных продуктов.
Предыстория работы,
В лаборатории генетики бактерий ГосНИИгенетики (зав. лаб. - проф.
Суходолец В. В.) была проведена совместная работа с лабораторией
Института Микробиологии РАН (с.н.с. Лысенко А. М.), по изучению
штаммов молочнокислых термофильных бактерий, использующихся в
качестве заквасок при производстве различных кисломолочных продуктов.
Среди изучаемых штаммов различного происхождения,
идентифицированных ранее (на основании микробиологических тестов и данных ДНК-ДНК-гибридизации) как Streptococcus thermophilus было выявлено 5 обособленных групп гомологии. Внутри отдельных групп
(геномоваров1) уровень геномного родства составил 80-90%, тогда как между штаммами из разных групп обычно реассоциировало 20-60% ДНК. Столь низкие значения геномного родства в рамках вида S. thermophilics могли быть результатом горизонтального переноса и накопления чужеродных адаптивных генов в геномах исследуемых штаммов. Но, с другой стороны, эти данные могли указывать на возможное присутствие в изученной группе штаммов, определяемых как S. thermophilics, других видов молочнокислых термофильных бактерий. Таким образом, причины выявленного полиморфизма по уровню геномного родства между штаммами одного вида оставались не ясными, что потребовало применения современных методов изучения генома для точного установления систематического положения изучаемых штаммов.
Цель и задачи исследования.
Целью работы являлась идентификация и характеристика отечественных штаммов термофильных молочнокислых стрептококков, использующихся при изготовлении кисломолочных продуктов.
В процессе выполнения работы были поставлены и решены следующие задачи:
Создание коллекции штаммов термофильных молочнокислых кокков.
Идентификация и характеристика штаммов термофильных молочнокислых бактерий на основании изучения их фенотипических и биохимических свойств.
Идентификация отечественных штаммов термофильных молочнокислых кокков с использованием подходов, основанных на изучении их генома.
1 Термин геномовар в таксономическом отношении строго не определён и может практически соответствовать как разным видам (для которых фенотипические различия пока не установлены), так и разным расам в рамках одного и того же вида [Rossello-Mora, Amann, 2001].
4. Оценка безопасности штаммов термофильных молочнокислых кокков, использующихся при изготовлении кисломолочных продуктов, путём определения в составе их геномов генов, кодирующих признаки вирулентности.
Научная новизна работы.
На примере штаммов бактерий собранной коллекции проведена идентификация и дана характеристика штаммам термофильных молочнокислых бактерий, использующимся при изготовлении кисломолочных продуктов на территории России и стран СНГ.
Проведена оценка безопасности культур термофильных молочнокислых кокков в случае их использования в пищевой промышленности.
Изучена разрешающая способность разных методов исследования, использующихся при идентификации и таксономической классификации штаммов термофильных молочнокислых бактерий.
Практическая значимость работы.
Получено представление о таксономическом положении штаммов, использующихся в качестве заквасок на территории России и южных регионов СНГ.
Даны рекомендации о возможности использования изученных штаммов в качестве стартовых культур.
Продемонстрирована разрешающая способность используемых в работе методов для оценки таксономического положения штаммов термофильных молочнокислых бактерий.
Сделано заключение о приемлемости полученных в ходе исследования результатов для анализа культур, внедряемых в производство кисломолочных продуктов и для характеристики степени их безопасности.
5. Методы, используемые в работе, рекомендуются для использования в лабораториях, занимающихся выделением и идентификацией новых культур с целью применения их как заквасок в молочной промышленности.
Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались на 3 Всероссийских и Международных конференциях. Основные положения диссертации отражены в 8 публикациях, из которых 4 статьи и 4 тезисов; 2 статьи сданы в печать.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа содержит 159 страниц машинописного текста, 11 рисунков, 13 таблиц. Библиография включает 245 литературных источников отечественных и зарубежных авторов.
Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий (зав. лабораторией д.б.н., профессор, академик. РАЕН Суходолец В.В.) Государственного научно-исследовательского института генетики и
селекции промышленных микроорганизмов, Москва.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
Ботина С.Г., Суходолец В.В., Лысенко A.M. Дивергенция по гомологи ДНК среди отечественных штаммов Streptococcus thermophilics. I Материалы Всероссийской научной конференции «Экологические проблемы и пути их решения в зоне среднего Поволжья». С. 181 - 182. Саранск: 27-30 сентября 1999 г.
Лысенко A.M., Ботина С.Г., Ганина В.И., Суходолец В.В. Дивергенция по уровню гибридизации ДНК и образование видов-двойников у молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus. II Микробиология.
2001. Т. 70. № 1.С. 70-76.
Ботина С.Г., Лысенко A.M., Суходолец В.В., Тренина М.А. Сравнение геномов у штаммов молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus различного происхождения. // Микробиология. 2002. Т. 71. № 6. С. 819 -823.
Лысенко A.M., Ботина С.Г., Суходолец В.В. Подтверждение систематического положения Streptococcus salivarius. II Микробиология.
2002, Т. 71. №5. С. 713-716.
Ботина С.Г., Лысенко A.M., Суходолец В.В. Дивергенция по гомологии ДНК среди отечественных штаммов Streptococcus thermophilus, использующихся в качестве заквасок при производстве молочнокислых продуктов. / Материалы Международной научной конференции: «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий». С. 71 - 72. Саранск: 12 -15 сентября 2002 г.
Ботина С.Г., Лобанов А.О., Лысенко A.M., Суходолец В.В. Генетическое многообразие штаммов молочнокислых термофильных бактерий на территории стран СНГ. // Биотехнология. 2004. Т. 2, С. 3 - 12.
Ботина С.Г. Изучение плазмидного состава и устойчивости к бактериофагам штаммов молочнокислых термофильных стрептококков,
использующихся при приготовлении различных кисломолочных продуктов. / Материалы Международной научной конференции: «Наука и бизнес. Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина». С. 119 - 121. Пущино: 17-19 марта 2004 г.
Ботина С. Г. Определение нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК у штаммов молочнокислых термофильных бактерий для установления их систематического положения. / Материалы Международной научной конференции: «Наука и бизнес. Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина». С. 122 - 124. Пущино: 17 - 19 марта 2004 г.
Ботина С.Г.. Лысенко A.M., Суходолец В.В. Выяснение таксономического положения отечественных штаммов термофильных молочнокислых бактерий по данным секвенирования генов 16S рРНК. // Микробиология (в печати).
10.Ботина С.Г., Суходолец В.В. Отечественные штаммы энтерококков, используемые в качестве заквасок, не содержат генов вирулентности, обычно присутствующих в патогенных штаммах Е. faecalis. II Биотехнология (в печати).
