Введение к работе
Актуальность темы. Род Yersinia, относящийся к семейству Enterobacteriaceae, включает 14 видов бактерий. Медицинское значение однозначно установлено только для трех видов: У. pestis - возбудитель чумы, Y. pseudotuberculosis - возбудитель псевдотуберкулеза и Y. enterocolitica - возбудитель кишечного иерсиниоза. Клиническое значение других видов остается до сих пор неясным и мало освещенным (Sulakvelidze, 2000). Повсеместная распространённость, психротолерантность, варьирующая вирулентность и широкий спектр хозяев делают иерсинии модельным родом для генетических и эволюционных исследований патогенеза и экологии бактерий. Несмотря на то, что работы по ДНК-ДНК гибридизации и сравнительному анализу генов «домашнего хозяйства» показали значительную гетерогенность некоторых видов и послужили основой для характеристики недавно описанных новых видов (К. similis, Y. aleksiciae, Y. massiliensis), современная идентификация иерсинии по-прежнему основана на описании фенотипических и биохимических характеристик. В связи с этим, для уточнения таксономии и прояснения филогении и эволюции рода Yersinia необходимо изучение молекулярной эволюции разных генов. На основе этих данных возможна разработка методов быстрой и точной видовой идентификации этих бактерий.
Механизмы адаптации иерсинии к различным хозяевам и различным условиям окружающей среды недостаточно изучены. Мембранные поверхностные молекулы в этом контексте представляют особый интерес, так как первыми реагируют на изменения условий окружающей среды и участвуют в процессах взаимодействия патогенного микроорганизма и хозяина. Одними из таких молекул являются неспецифические порины - доминирующие белки наружной мембраны бактерий, которые обладают уникальными структурными свойствами и функционируют как поры, регулируя проницаемость мембраны. Кроме того, некоторые порины участвуют в бактериальном патогенезе, например, адгезии и инвазии (Su et al., 1990; van Putten et al, 1998), а также индуцируют протективный ответ иммунной системой хозяина (Singh et al., 1999; Zhang et al., 1997). Для некоторых видов иерсинии были выделены и охарактеризованы OmpF- и OmpC-подобные порины (Вострикова et al., 2006). Для патогенных видов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica была охарактеризована первичная структура и топология OmpF порина (Гузев et al., 2005). Однако исследования были выполнены на единичных штаммах и ограниченном числе видов, что не даёт полного понимания степени разнообразия OmpF поринов и их роли в широких адаптивных возможностях представителей рода Yersinia.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение полиморфизма и эволюции ompF гена и OmpF порина в пределах рода Yersinia и разработка многопраймерной ПЦР тест-системы для идентификации иерсинии и дифференциации патогенных видов. Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
-
Генотипирование исследуемых штаммов иерсинии на основе секвенирования генов «домашнего хозяйства» - 16S рДНК и gyrB.
-
Определение нуклеотидных последовательностей, филогенетический и эволюционный анализ ompF генов 14 видов иерсинии.
-
Сравнительный анализ и компьютерное моделирование структурных вариантов OmpF поринов иерсинии.
-
Разработка и апробация многопраймерной ПЦР тест системы для идентификации бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных видов.
Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе данной работы впервые определены нуклеотидные последовательности (НП) ompF, 16S рДНК и gyrB генов из 69 штаммов иерсиний, представляющих все виды рода Yersinia. На основании этих данных проведён комплексный филогенетический и эволюционный анализ пориновых генов и выведенных аминокислотных последовательностей (АП) белков. В молекуле порина выявлены районы и сайты, испытывающие действие адаптивной эволюции. Впервые для иерсиний на примере ompF гена обнаружена внутривидовая и межвидовая внутригенная рекомбинация. Методом сравнительного моделирования получены теоретические модели пространственных структур некоторых вариантов OmpF поринов иерсиний {Y. aldovae, Y. aleksiciae, Y. bercovieri, Y. similis, Y. rohdei, Y. frederiksenii, Y. mollaretii, Y. intermedia, Y. kristensenii и Y. ruckeri).
На основе последовательностей ompF генов иерсиний разработана не имеющая аналогов многопраймерная ПЦР тест-система, позволяющая за одну реакцию идентифицировать бактерии рода Yersinia и дифференцировать патогенные для человека виды. Оптимизированы условия, определены чувствительность и специфичность реакции, исследована ее диагностическая информативность.
Апробация результатов. Результаты работы были представлены на: IX международном симпозиуме «Иерсиний», г. Лексингтон, США, 2006; II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями», Санкт-Петербург, 2006; II Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», г. Владивосток, 2006; I Дальневосточном симпозиуме с международным участием «Науки о жизни», г. Владивосток, 2008.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 146 цитируемых работ. Диссертационная работа изложена на 101 странице машинописного текста и содержит 13 таблиц и 30 рисунков.
