Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Источники целлюлозосодержащего сырья и его состав 8
Глава 2. Состав, строение и основные свойства компонентов растительной клеточной стенки 12
2.2. Целлюлоза 13
2.2. Гемицеллюлозы 14
2.3. Пектины и лигнин 16
Глава 3. Ферментативная деградация целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ) 18
3.1. Общие сведения о гликозил-гидролазах, участвующих в гидролизе ЦСМ 18
3.2. Целлюлазы 19
3.3. Гемице ллю лазы 24
3.4. Механизм действия целлюлазного комплекса 32
3.5. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы 35
Глава 4. Штамм Penicillium verruculosum и компоненты секретируемого им ферментного комплекса 39
Экспериментальная часть 43
Глава 5. Объекты исследования и методы экспериментов 43
5.1. Ферментные препараты 43
5.2. Субстраты 43
5.3. Прочие реактивы 43
5.4. Хроматографические сорбенты 44
5.5. Проведение полимеразной цепной реакции и получение генетических конструкций 44
5.6. Окрашивание агаризованной среды с аморфной целлюлозой конго красным 45
5.7. Культивирование трансформантов P. verruculosum в 3-л ферментерах 45
5.8. Метод определения концентрации белка 46
5.9. Методы определение биохимических характеристик ферментов 47
5.10. Методы определения активности ферментов 47
5.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков 49
5.12. Определение температурного и рН-оптимума действия ферментных препаратов 50
5.13. Изучение термо- и рН-стабильности ферментных препаратов 50
5.14. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов
гидролиза целлюлозосодержащего сырья 50
5.15. Хроматографическое фракционирование препаратов P. verruculosum 51
5.16. Гидролиз цсллюлозосодержащих материалов 52
Результаты и их обсуждение 53
Глава 6. Получение ферментных препаратов на основе рекомбинантньк штаммов Р. verruculosum 53
6.1. Выделение генов и создание экспрессионных конструкций 54
6.2. Трансформация штамма-реципиента P. verruculosum 537 57
6.3. Первичный скрининг полученных трансформантов 57
6.3.1. Первичный скрининг трансформантов, содержащих гетерологичные целлюлазы 57
6.3.2. Первичный скрининг трансформантов, содержащих гетерологичные гемицеллюлазы 64
6.4. Получение рскомбинантных ферментных препаратов 73
Глава 7. Физико-химические свойства новых ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов P. verruculosum 74
7.1. Анализ ферментных препаратов с помощью методов электрофореза и изоэлектрофокусирования 74
7.2. Активность ферментных препаратов по отношению к различным субстратам 77
7.3. рН- и температурные оптимумы активности ферментных препаратов, стабильность ферментных препаратов 73
Глава 8. Гидролиз полисахаридных субстратов лабораторными мультиферментными препаратами, полученными с помощью рекомбинантных штаммов P. verruculosum 88
8.1. Результаты гидролиза измельченной осиновой древесины 88
8.2. Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины 97 8.2. Результаты гидролиза измельченной багассы 105
8.4. Результаты гидролиза микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) 112
8.5. Сравнение эффективности гидролиза растительных субстратов ферментными
препаратами, полученными с помощью рекомбинантных штаммов P. verruculosum
и коммерческими ферментными препаратами 120
8.6. Влияние рН и температуры на эффективность гидролиза ЦСМ 124
Глава 9. Состав рекомбинантных ферментных препаратов 128
Выводы 131
Список литературы
- Гемицеллюлозы
- Механизм действия целлюлазного комплекса
- Хроматографические сорбенты
- Трансформация штамма-реципиента P. verruculosum
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В современном мире истощение запасов ископаемых источников энергии является актуальной проблемой. Кроме этого, существуют серьезные экологические проблемы, связанные с увеличением объема выброса парниковых газов в атмосферу. Биотехнологическая переработка сельскохозяйственных и лесотехнических отходов снизит нагрузку на экосистему Земли, используя возобновляемый и наиболее распространенный на нашей планете растительный биоматериал - лигноцеллюлозную биомассу. Глюкоза и другие сахара, получаемые путем ферментативного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, могут быть конвертированы с помощью микроорганизмов в биотопливо - этанол, бутанол, а также другие полезные продукты - органические и аминокислоты, кормовые продукты, адгезивные материалы, биосинтезируемые лекарственные препараты, биоразлагаемые пластики и другие полезные продукты.
Главными компонентами клеточной стенки растений являются природные полисахариды: целлюлоза и гемицеллюлоза. Деградация полисахаридов клеточной стенки происходит под действием комплекса ферментов карбогидраз (целлюлаз и гемицеллюлаз), от сбалансированности состава которого зависит эффективность гидролиза растительной биомассы. В мировой практике основными микроорганизмами, продуцирующими ферментные комплексы карбогидраз, являются микроскопические грибы рода Trichoderma. Однако ферментные препараты (ФП), получаемые на основе штаммов Trichoderma, характеризуются относительно невысокой удельной активностью и обладают низким содержанием (3-глюкозидазы -одного из ключевых ферментов целлюлолитического комплекса, что приводит к недостаточно эффективному использованию ФП в промышленной биотехнологии. В отличие от грибов рода Trichoderma, секретируемый ферментный комплекс низшего гриба Penicillium verruculosum имеет более высокую удельную активность, лучше сбалансирован по составу целлюлолитических ферментов, поэтому ферментные препараты, полученные на его основе, обладают большей эффективностью при осахаривании целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ). Тем не менее, очевидно, что необходимо искать пути дельнейшего увеличения активности ферментного комплекса Р.verruculosum - этого можно добиться привнесением в комплекс дополнительных целлюлолитических ферментов, а также ферментов гемицеллюлаз (ксиланаз, маннаназ), обеспечивающих деградацию гемицеллюлозной матрицы растительного сырья и, как следствие, облегчающих доступ целлюлаз к целлюлозному субстрату.
Таким образом, получение новых мультиферментных комплексов карбогидраз на основе штамма гриба P.verruculosum, обладающих улучшенной осахаривающей способностью по отношению к природному растительному сырью, является важной и
актуальной задачей, поскольку их применение будет способствовать увеличению эффективности процессов переработки ЦСМ.
Цели и задачи исследования. Целью работы являлось увеличение эффективности гидролиза целлюлозосодержащего сырья с использованием новых комплексных ферментных препаратов, обладающих высокими значениями целлюлазных и гемицеллюлазных активностей, полученных на основе высокопродуктивных рекомбинантных штаммов Р.verruculosum. В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:
Получить экспрессионные плазмиды, содержащие гены гемицеллюлаз (эндо-1,4-Р-ксиланазы A (xylA), эндо-1,4-Р-ксиланазы III (хуІЗ), эндо-1,4-Р-маннаназы В (тапВ), эндо-1,4-Р-ксиланазы III (хуІЗ)) и целлюлаз (эндо-1,4-Р-глюканазы IV (egl4), эндо-1,4-Р-глюканазы I (egll) и целлобиогидролазы II (cbhlly) T.reesei nP.canescens;
Провести трансформацию штамма-реципиента P.verruculosum 537 (піаП) и осуществить скрининг трансформантов на целевые активности (ксиланазную, маннаназную, КМЦ-азную, авицелазную), удостовериться в стабильности новых рекомбинантных штаммов;
Исследовать каталитические, физико-химические и биохимические свойства новых ферментных комплексов, продуцируемых полученными рекомбинантнвми штаммами;
Проанализировать осахариваюшую способность новых ферментных комплексов карбогидраз по отношению к различным видам ЦСМ (измельченной багассе, измельченной обессмоленной сосновой древесине, измельченной осиновой древесине и микрокристаллической целлюлозе) и сравнить ее с осахаривающей способностью имеющихся коммерческих и лабораторных ферментных препаратов;
Определить компонентный состав ферментных комплексов, обладающих наиболее высокой осахаривающей способностью.
Научная новизна. Впервые созданы плазмидные конструкции, обеспечивающие экспрессию целевых генов (целлюлаз и гемицеллюлаз) под контролем индуцибельного промотора cbhl гена мажорного секреторного белка целлобиогидролазы І (ЦБГІ) в штамме-реципиенте P. verruculosum 537. На базе наилучших штаммов-продуцентов целевых ферментов впервые получены новые мультиферментные комплексы карбогидраз с увеличенной осахаривающей способностью, определен их компонентный состав и описаны биохимические свойства. Найдены корреляции между составом растительного сырья, составом полученных комплексов и результатами осахаривания природных субстратов. На основе полученных экспериментальных данных впервые предложена методика получения мультиферментных комплексов заданного состава.
Практическая значимость работы. Показано, что ферментные комплексы карбогидраз обладают увеличенной осахаривающей способностью (за счет привнесения в их состав новых гетеро логичных ферментов). Применение новых ФП при гидролизе различных видов ЦСМ (измельченной багассы, измельченной осиновой древесины, измельченной сосновой древесины, микрокристаллической целлюлозы) позволяет увеличить выход сбраживаемых Сахаров на 10-130% по сравнению с существующими лабораторными и коммерческими ферментными препаратами.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях: «BIOCATALYSIS 2009: Fundamentals&Applications» (Архангельск, 2009), московской международной научно-практической конференции "БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов" (Москва, 2010), втором международном конгресс-партнеринге и выставке по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике «EURASIABIO» (Москва, 2010), Sixth International Conference on Renewable Resources and Biorefineries (Dusseldorf, 2010), седьмой всероссийской научной молодежной школы с международным участием (Москва, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; отдельной главы, посвященной материалам и методам исследования; четырех глав, в которых приведены полученные результаты и их обсуждение; выводов и
списка литературы, содержащего ссылок на публикации в отечественных и
зарубежных журналах. Объем диссертации составляет страниц и включает
рисунков и таблиц.
Гемицеллюлозы
Ферментативный гидролиз целлюлозы и сопутствующих ей природных полисахаридов ф-глюканов, ксиланов и др.) осуществляется комплексом ферментов, различающихся по субстратной специфичности, которые получили название гликозил-гидролазы [26]. Гликозил-гидролазы, также называемые гликозидазами и карбогидразами, катализируют гидролиз гликозидных связей с образованием олигосахаридов и простых Сахаров. По типу действия на субстраты карбогидразы делят на ферменты эндо- и экзо-деполимеразы [27].
В настоящее время гликозил-гидролазы классифицируются по гомологии первичных аминокислотных последовательностей и структурным особенностям с учетом доменной организации молекулы белка. На начало 2011 года было известно 122 семьи гликозил-гидролаз. В пределах одной семьи ферменты проявляют сходство і аминокислотных последовательностей и характеризуются одинаковым типом укладки (фолдинга), т.е. имеют одинаковую трехмерную структуру. Кроме того, все ферменты, принадлежащие к одной и той» же семье, функционируют по одинаковому механизму с точки зрения стереохимии катализа [28]. Большинство целлюлаз демонстрируют модульную архитектуру, включающую один или несколько каталитических модулей (КМ) и один или несколько модулей (доменов), вовлеченных в связывание субстрата (целлюлозо-связывающий домен, ЦСД), либо образуют мультиферментные комплексы [29]. Помимо этих модулей бактериальные целлюлазы могу содержать дополнительные, например, гомологичные фибронектину III типа (Fnlll) или иммуноглобулину [30]. Индивидуальные модули часто соединены линкерными пептидами различной длины.
Модульная структура грибных целлюлаз была открыта в 1980х годах в экспериментах с ограниченным протеолизом [31,32]. Гибкость и неоднородность О-гликозилирования линкеров, как предполагается, является главным препятствием кристаллизации интактных грибных целлобиогидролаз, содержащих КМ и ЦСД. Линкеры значительно различаются в длине, и в большинстве случаев, сходство их последовательностей из различных организмов мало либо вовсе не обнаруживается, хотя в большинстве своем они часто богаты остатками пролина и серина [33]. Кооперативность между КМ и УСМ может быть списана на внутримолекулярный синергизм. Было показано, что КМ Се17А Т. reesei действует в согласии с ЦСД, и пространственное разделение между модулями играет важную роль в механизме действия фермента [34].
В соответствии с современной классификацией каталитических модулей целлюлолитических ферментов по семьям они больше не разделяются на эндо- и экзо-глюканазы по типу действия на полимерный субстрат, и называются просто «целлюлазами», причем по новой номенклатуре они должны обозначаться как Се16А, Се17А, Се17В и т.п, где «Cel» обозначает целлюлазу, цифра указывает семью гликозил-гидролаз, а следующий за. ней индекс «А», «В», «С» и т.д. обозначает ферменты, продуцируемые конкретным (одним и тем же) организмом, которые принадлежат одной семье, но кодируются разными генами (буквы следуют в порядке открытия соответствующих каталитических доменов у данного организма) [35].
ЦСД целлюлаз также классифицированы по семьям, содержимое и нумерация которых отличаются от семей каталитических доменов. Практически все грибные ЦСД (точнее эукариот) высокогомологичны и принадлежат к 1-й семье (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/V
Эффективный гидролиз целлюлозы до глюкозы требует кооперативного действия трех ферментов: эндо-1,4-Р-глюканазы (ЕС 3.2.1.4), экзо-1,4-Р-глюканазы (ЕС 3.2.1.91) и Р-глюкозидазы (ЕС 3.2.1.21). Кооперативное действие целлюлолитических ферментов приводит к деградации целлюлозы до глюкозы [35].
Эндоглюканазы. Для эндоглюканаз, прежде всего, характерна высокая активность по отношениюк растворимым производным целлюлозы и р-глюканам, содержащим Р-1,4-связи, а именно по отношению к карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ), глюкану из ячменя и лихенану, причем в первую очередь это выражается в быстром уменьшении вязкости растворимых полисахаридов (а также образованием восстанавливающих Сахаров (ВС)) [27,36]. Как правило, эндоглюканазы способны достаточно эффективно гидролизовать аморфную целлюлозу. Однако, их активность по отношению к кристаллической целлюлозе - например, к хлопку, фильтровальной бумаге "Whatman №1", микрокристаллической целлюлозе (МКЦ) - относительно низка по сравнению с целлобиогидролазами [27,37, 38]. Грибные эндоглюканазы, как правило, не активны по отношению к целлобиозе, а так же далеко не все из них способны расщеплять целлотриозу. Например, из всех эндоглюканаз Т. reesei и Н. insolens только ЭГ I, принадлежащая к 7-й семье, способна с достаточно высокой скоростью гидролизовать трисахарид [37, 39-42]. Из пяти эндоглюканаз P. pinophilum только ЭГ III И ЭГ IV обладали таким свойством [43]. Многие эндоглюканазы способны гидролизовать целлоолигосахариды со степенью полимеризации более 3, причем скорость гидролиза, как правило, возрастает с увеличением СП олигосахарида [37, 40-42]. Однако некоторые ферменты не могут гидролизовать целлотетраозу, например ЭГ V (Се145А) из Т. reesei [37] и ЭГ I и V из P. pinophilum [43]. Две из указанных эндоглюканаз - ЭГ V из Т. reesei и ЭГ I из P. pinophilum не действуют и на целлопентаозу, и самым коротким олигосахаридом, который они способны расщеплять, является целлогексаоза. При действии на целлоолигосахариды эндоглюканазы предпочтительно действуют на внутренние связи, удаленные от концов молекул олигосахаридов, при этом для различных ферментов распределение гидролизуемых связей различается [40-43].
После введения в практику исследований хромогенных субстратов целлюлаз -метилумбеллиферильных (МУФ), п-нитрофенильных (п-ИФ) и других производных моно-и олигосахаридов - в ряде работ изучали действие эндоглюканаз на эти субстраты. Как правило, только ферменты, принадлежащие к 7-й семье (например, ЭГ I из Т. reesei), способны расщеплять ковалентную связь между МУФ и гликозидным остатком в молекуле МУФ-р-О-целлобиозида; в случае более длинных олигосахаридов многие эндоглюканазы способны к этому [41,43,44].
Единственными низкомолекулярными продуктами гидролиза КМЦ, авицела (МКЦ), и предобработанной фосфорной кислотой целлюлозы (аморфной целлюлозы) под действием ЭГ I (Се17В) из Т. reesei являлись глюкоза и целлобиоза [37]. ЭГ II (Се15А), кроме указанных продуктов образовывала также целлотриозу. ЭГ III (Cell2А) дополнительно образовывала целлотетраозу. В случае же ЭГ V (Се145А) основными продуктами гидролиза являлись целлотетраоза, а так же целлопентаоза и целлотриоза [37].
Известны эндоглюканазы, способные гидролизовать ксилан - так называемые «целлюлазы-ксиланазы». Например, такое свойство характерно для ЭГ I (Се17В) из Т. reesei [38,40]. Другим примером служит ЭГ из Irpex lacteus [45]. Некоторые из эндоглюканаз могут расщеплять основную цепь ксилоглюкана, например ЭГ I (Се17В) и ЭГ III (Cell2А) из Т. reesei [38,46].
Механизм действия целлюлазного комплекса
На протяжении ряда последних лет в лаборатории биотехнологии ферментов ИНБИ РАН, совместно с лабораторией биосинтеза и получения ферментов ИБФМ РАН ведутся работы со штаммами гриба P. verruciilosum. Этот микромицет был идентифицирован как продуцент целлюлаз в 1981 году. Особенностью дикого штамма Р. verruciilosum WA 30 являлась высокая способность к гидролизу КМЦ. Он также обладал целлобиазной активностью более чем в 10 раз превосходящей целлобиазную активность Т. reesei [1В4].
Первоначальная продуктивность дикого штамма P. verruculosum WA ЗО составляла около 7 г/л секретируемого белка в культуральной жидкости (КЖ). Такая продуктивность довольно низка по сравнению с промышленными штаммами-продуцентами целлюлаз на основе Т. reesei (до 100 г/л). С целью увеличения продуктивности штамм WA 30 подвергли серии последовательных мутагенезов с использованием УФ-облучения после обработки 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанином (рис.7).
Полученные штаммы P. verruculosum В1-221-151 и В221-6 обладали высокой продуктивностью внеклеточных ферментов целлюлазного и гемицеллюлазного комплекса, которая составляет 30-40 г/л. Надо отметить, что биосинтез ферментов в целлюлолитических штаммах низших грибов индуцируется целлюлозой, а также продуктами ее деструкции и в большинстве случаев подвержен катаболитной репрессии глюкозой. Однако катаболитная репрессия биосинтеза карбогидраз в полученных мутантных штаммах P. verruculosum В1-221-151 и В221-6 была значительно снижена. Это явилось значительным преимуществом перед исходным диким штаммом и позволило проводить периодические подпитки растущей культуры клеток гриба глюкозой. Целенаправленные изменения рН в процессе ферментации позволяют влиять на состав целлюлазного комплекса. Некоторые побочные активности, как например, гемицеллюлазная, амилазная и целлобиазная становятся выше при более высоких значениях рН [1 85].
Следует отметить, что получение перспективных штаммов с устойчивой способностью к сверхсинтезу необходимых ферментов является весьма непростой задачей, так как многие мутантные штаммы со временем теряют такую способность [186]. Однако, мутантные штаммы P. verruculosum В1-221-151 и В221-6 обладают стабильной продуктивностью и секрецией гидролитических ферментов, что было неоднократно доказано при пересевах штаммов на селективные среды.
Свойства основных целлюлолитических ферментов P. verruculosum частично описаны в работах [187,188,189,190]. В результате хроматографического фракционирования [191, 192] комплекса P. verruculosum было обнаружено, что в его составе находятся 16 ферментов: 6 эндоглюканаз (ЭГ III 25, ЭГ II 33, ЭГ II 39, ЭГ I 52, ЭГ I 57 и ЭГ I 70), 4 целлобиогидролазы (ЦБГ II 50, ЦБГ II 60, ЦБГ I 55 и ЦБГ I 66), 2 ксилоглюканазы (КГ 25 и КГ 70), (3-глюкозидаза (бГлю 116), ксиланаза (Ксил 23), а-галактозидаза (а-Гал 60) и глюкоамилаза (ГА 66) (рис.8). Молекулярные массы изменялись в широком диапазоне: от 19100 до 114800 Да. Изоэлектрические точки изменялись в диапазоне от 2 до 5,8. Значения рН-оптимумов действия находились в узком диапазоне 3,5-5,5, температурные оптимумы варьировали в широком диапазоне 50-80С. Щ
Данные о сравнении осахаривающих свойств комплексов ферментов Р. erruculosum и Т. reesei, а так же тот факт, что первый гриб секретирует значительно большие количества Р-глюкозидазы (10-12 ед/мл целлобиазной активности при культивировании в колбах), в то время как целлобиазная активность Т. reesei при тех же условиях составляет 3-4 ед/мл [193], могут объяснить повышенную осахаривающую способность препаратов P. verruculosum. При гидролизе лигноцеллюлозы гидролитические ферменты этого штамма имеют дополнительное преимущество над ферментами Т. reesei, а именно - пониженное сродство к лигнину и меньшую чувствительность к ингибированию производными лигнина.
Как отмечалось выше, для мутантного штамма P. verruculosum В1-221-151 характерна, высокая активность целлюлаз, но активность гемицеллюлаз недостаточно высока. По этой причине он был подвергнут следующему этапу мутагенеза. В результате был получен штамм P. verruculosum 537, который является ауксотрофом и не способен усваивать нитратный азот, вследствие дефекта в гене нитратредуктазы (niaD). Этот штамм-реципиент используется в лаборатории биотехнологии ферментов для получения рекомбинантных штаммов путем котрансформации целевой плазмидой, несущей ген целевого белка (под контролем сильного промотора гена целлобиогидролазы I P. verruculosum), и трансформирующей плазмидой, несущей полноценный ген нитратредуктазы. Возврат трансформантов к прототрофности является маркером при отборе трансформантов. Следует особо отметить, что качественный и количественный состав ферментных комплексов в штаммах P. verruculosum В1-221-151 и P. verruculosum 537 одинаков.
Система экспрессии в грибе P. verruculosum 537 хорошо зарекомендовала себя, например, при получении штамма P. verruculosum F10 — продуцента гетерологичной бГлю A. niger. Целлобиазная активность в ферментном препарате, полученном на основе этого штамма, составляет 84 ед/мг белка. Коммерческий препарат Novozym 188, получаемый на основе гриба A. niger, обладает целлобиазной активностью равной 5 ед/ мг[194].
Учитывая то, что доступное растительное непищевое сырьё в значительной мере различается по компонентному составу: отходы переработки лиственной древесины и однолетние растения, содержат много ксиланов, отходы переработки хвойной древесины - маннанов, отходы производства некоторых производств — аморфизованой целлюлозы, возникает необходимость получения ферментных препаратов с различным соотношением целлюлаз и гемицеллюлаз. Мультиферментные препараты, уникальный ферментативный комплекс которых подобран исходя из строения клеточной стенки растения, должны с повышенной эффективностью гидролизовать виды конкретного сырья, подвергаемого биоконверсии.
Таким образом, целью диссертации являлось увеличение выхода Сахаров при гидролизе различных видов ЦСМ с помощью новых мультиферментных препаратов на основе высокопродуктивных рекомбинантных штаммов P. verruculosum, обладающих повышенным уровнем целлюлазных и гемицеллюлазных активностей. ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Для определения активностей препаратов использовали следующие субстраты: синтетические - гс-НФ-р-Глюк (Sigma, США); полимерные - глюкуроноксилан березы, КМЦ и галактоманнан (Sigma, США), а также МКЦ (Дзержинск, Россия)
В экспериментах по ферментативному гидролизу (осахариванию) использовали МКЦ (Дзержинск, Россия), измельченные на шаровой мельнице осиновую древесину, обессмоленпую сосновую древесину и измельченную багассу (любезно предоставлены ГосНИИСинтезбелок).
Для проведения ПЦР использовали смесь высокоточной и процессивной полимераз- Long polymerase mix, 10х Long polymerase PCR buffer + MgC12 и dNTP mix (Fermentas, Литва). Так же использовались Т4-полимераза и Т4-лигаза (Fermentas, Литва). Выделение, наработка и очистка ДНК проводились с использованием наборов фирмы Qiagen (США).
В качестве калибровочного стандарта при определении концентрации белков в растворе методом Лоури использовали комплексный препарат P. verriiculosum.
При изготовлении пластин (70 х 80 х 0.75 мм) с полиакриламидным гелем (ПААГ) для электрофореза в денатурирующих условиях (ДДС-ЭФ) с концентрирующим (4%) и разделяющим (12%) гелями, а также для изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в 4% ПААГ (125 х 65 х 0.75 мм) использовали реактивы и наборы производства Reanal (Венгрия), Sigma и Bio-Rad (США). Окраску белка в гелях производили красителем Coomassie-Brilliant Blue R-250 производства Ferak (Германия) в 25% трихлоруксусной кислоте или уксусной кислоте производства Poch (Польша).
Хроматографические сорбенты
На основе наилучших рекомбинантных штаммов-продуцентов, коллегами в ИБФМ РАН им. Г.К.Скрябина была проведена наработка КЖ трансформантов в ферментёрах объемом 3 л, и получены сухие ФП, представлявшие собой лиофильно высушенную КЖ (табл.12). В табл. 13 приведена активность ФП по отношению к различным субстратам. Целью дальнейшей работы являлось исследование свойств ФП и анализ их осахаривающей способности при гидролизе различных видов ЦСМ.
Был проведен ДДС-ЭФ сухих ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов P. verruculosum (рис.26-27). На электрофореграммах наблюдаются полосы, соответствующие ЭГ IV Т. reesei ( 39 кДа), ЭГ I Т. reesei (-55 кДа), ЦБГ II Т. reesei ( 55 кДа), ксиланазе А P. canescens ( 31 кДа), маннаназе В Т. reesei ( 50 кДа), ксиланазе III Т. reesei ( 38 кДа). Характерно, что при увеличении экспрессии целевых генов, уменьшается экспрессия ЦБГ I, фланкирующие элементы которой использовали в трансформирующей конструкции.
Данные ИЭФ полученных ферментных препаратов приведены на рис.28. Сравнивая значения pi для соответствующих ферментов (рис.28) с литературными данными, следует сделать вывод, что полоса в районе 4,55 соответствует маннаназе В Т. reesei (нативная маннаназа В имеет значение pi 4,6 [204]); 8,5 - ксиланазе А P. canescens (нативная ксиланазе А имеет pi 8,3-9,1 [205]); 2,8 - ЭГ IV Т. reesei. ЭГ I Т. reesei [38], ЦБГ II T.reesei [206] и ксиланаза III Т. reesei [207] не проявляются при ИЭФ препаратов. Ю Х Г- СО (активность по пНФ-Р-О-Глюк); ксиланазная активность: от 1,27 до 9,66 ед/мг.
Содержание белка составляло от 378 до 755 мг/г ФП. Целлюлолитические активности препаратов ЭГГУ-1-8 лежали в диапазонах: 0,09 -0,19 ед/мг (активность по авицелу), 4,85 - 10,90 ед/мг (активность по КМЦ), 0,84 - 1,56 ед/мг (активность по пНФ-Р-О-Глюк). Ксиланазная активность от 12,53 до 33,32 ед/мг. Содержание белка составляло от 620 до 1000 мг/г ФП.
Целевая КМЦ-азная активность препаратов ЭП-1-4 лежала в диапазоне 10,67 -24,15 ед/мг. Активность других базовых целлюлолитических активностей: 0,69 - 0,93 ед/мг (активность по авицелу), 1,02 - 1,22 ед/мг (активность по иНФ-Р-Б-Глюк). Ксиланазная активность: от 9,06 до 17,22 ед/мг. Содержание белка составляло от 685 до 940 мг/г ФП.
Целевая авицелазная активность препаратов ЦБГИ-1-4 лежала в диапазоне 0,91 -1,36 ед/мг. Активность других базовых целлюлолитических активностей: 14,67 - 19,28 ед/мг (активность по КМЦ), 1,13 - 1,46 ед/мг (активность по пНФ-р-О-Глюк). Ксиланазная активность: от 9,06 до 17,22 ед/мг. Содержание белка составляло от 685 до 940 мг/г ФП.
Целевая ксиланазная активность препарата КсилШ-1 составляла 20,84 ед/мг, активность базовых целлюлолитических активностей: 0,08 ед/мг (активность по авицелу), 17,96 ед/мг (активность по КМЦ), 1,12 ед/мг (активность по пИФ-р-Э-Глюк). Содержание белка составляло 807 мг/г ФП.
Значения активностей для контрольного препарата В1-221-151 были следующими: 0,33 ед/мг (активность по авицелу), 12,95 ед/мг (активность по КМЦ), 1,05 ед/мг (активность по пНФ-Р-Б-Глюк). Ксиланазная активность: от 12,90 ед/мг. Содержание белка составляла 847 мг/г ФП.
Исходя из данных табл.13, рекомбинантные препараты можно разделить на две группы (табл.14): имеющие высокие целевые и базовые активности (например, КсилА-4, МанВ-2, ЭПУ-2, ЭП-4, ЦБГП-3, КсилШ-1) и высокие целевые активности (например, КсилА-3, МанВ-1, ЭПУ-8, ЦБГП-4).
Можно предположить, что гидролиз растительных субстратов с использованием препаратов первой группы (КсилА-4, МанВ-2, ЭГР/-2, ЭП-4, ЦБГП-3, КсилШ-1) будет проходить с большей эффективностью, чем с использованием препаратов второй группы (КсилА-3, МанВ-1, ЭПУ-8, ЦБГП-4). Таблица 13. Содержание белка и удельная активность ФП (ед/мг белка).
Название Ген Бслок, мг/г КМЦ-аза р-Глюканаза АФБ Авице-лаза Целлобиаза Ксплапаза Маннаназа Р-Глюкозндаза
Важными характеристиками ФП являются рН- и температурные оптимумы целевых активностей, а также их стабильность при воздействии различных рН и температуры - эти параметры во многих случаях являются ключевыми при выборе ферментов для различных биотехнологических процессов. В этом разделе приведены результаты исследований ферментных препаратов, касающиеся влияния на целевые активности рН и температуры (табл. 16). Для полученных рекомбинантных ФП были определены рН- и температурные оптимумы активности по отношению к различным субстратам — КМЦ, МКЦ, ксилану, галактоманнану, а также температурная стабильность.
Влияние температуры. Известно, что для ферментативной реакции характерно наличие интервала температуры, в котором скорость ее максимальна. Температурные зависимости активности препаратов по отношению к глюкуроноксилану, галактоманнану, МКЦ и КМЦ представлены на рис.29.
Температурный профиль активности по глюкуроноксилану препарата КсилШ-1 (температурный оптимум ксиланазной активности 55С), содержащего КсилЗ Т. reesei, несколько сдвинут в область более высоких температур по сравнению с препаратами КсилА-3 (температурный оптимум 50С) и КсилА-4 температурный оптимум 54С), содержащими КсилА P. canescens. Кроме того, диапазон температуры, в котором препараты проявляют более половины активности OW») для КсилШ-1 расположен в более высокотемпературной области, чем для КсилА-3 и КсилА-4. При увеличении температуры от 50 до 70С для препаратов с КсилА P. canescens, характерно более заметное падение активности.
Температурные профили активности по галактоманнану ФП МанВ-2 и МанВ-б, содержащих маннаназу Т. reesei, практически совпадали, температурный оптимум составил 80С. Диапазон температуры, в котором препараты проявляли более половины активности (Tso%) составил 60-85С. Небольшой пик на профиле зависимости активности от температуры со значением 60С, вероятно, объясняется наличием а-галактозидазы Р. verruculosum, обладающей способностью к гидролизу галактоманнана, температурный оптимум которой составляет 60С [204].
Препараты ЭП-4 и ЭГТУ-2, содержащие гетерологичные ЭП и ЭПУ Т. reesei соответственно, имели схожие температурные профили активности по КМЦ с максимальной активностью около 60С. ФП ЭП-4 и ЭПУ-2 обладали «широким» профилем температурной зависимости КМЦ-азной активности, эта активность превышала половину от максимальной в диапазоне температур от 43 до 76С (для препарата с ЭПУ Т. reesei) и от 44 до 71 С (для препарата с ЭП Т. reesei).
Трансформация штамма-реципиента P. verruculosum
Из данных, представленных в табл. 17 можно сделать следующие выводы: при гидролизе измельченной осиновой древесины наилучшими для осахаривания рекомбинаптными ферментными препаратами являются КсилА-4, ЭПУ-2 и КсилШ-1; измельченной обессмоленной сосны - КсилА-4, и КсилШ-1; измельченной багассы - КсилА-4 и ЭПУ-2; среди препаратов с рекомбинантной эндо-Р-1,4-ксиланазой А максимальный выход Сахаров наблюдался в случае препарата КсилА-4; с рекомбинантной эндо-Р-1,4-ксиланазой III наилучшим показал себя препарат КсилШ-1; с рекомбинантной эндо-р-1,4-маннаназой - препарат МанВ-2; с рекомбинантной эндо-р-1,4-глюканазой IV -препараты ЭГР/-1 и ЭПУ-2; с рекомбинантной эндо Р-1,4-глюканазой I - препарат ЭП-4; с рекомбинантной целлобиогидролазой II - препарат ЦБГП-1.
Характерно, что при увеличении дозировки рекомбинантных ферментных препаратов наблюдается относительно меньшее (в %) увеличение выхода ВС и глюкозы по сравнению с контрольным препаратом, что обусловлено исчерпыванием субстрата и выхода Сахаров, близкого к максимальному.
Использованное растительное сырье различалось по реакционной способности (в порядке уменьшения): измельченная осиновая древесина измельченная багасса измельченная обессмоленная сосновая древесина.
8.5 Сравнение эффективности гидролиза растительных субстратов ферментными препаратами, полученными с помощью рекомбинантных штаммов P. verruculosum и коммерческими ферментными препаратами
Было проведено сравнение полученных ФП с коммерческими препаратами на основе Т. ressei: Spezyme СР, Celluclast 1.5L, Accellerase 1000 (данные по активностям контрольных препаратов представлены в табл.18)ю По КМЦ-азной и авицелазной активностям коммерческие препараты превосходят препарат В1-221-151, однако уступают ему в активности по ксилану. По Р-глюкозидазной активности коммерческие препараты можно разделить на две группы - с высокой (Accellerase 1000) и низкой (Spezyme СР, Celluclast 1.5L) активностью.
Таблица 18. Удельные активности контрольных препаратов по отношению к различным субстратам и содержание белка в контрольных препаратах (50 С, рН 5).
Названиеферментногопрепарата Содержаниебелка, мг/г( мг/мл) КМЦ-аза Авицелаза р-глюкози-даза Ксиланаза
На рис.72 представлены данные, характеризующие результаты гидролиза ЦСМ наиболее активными рекомбинантными ФП и коммерческими препаратами. В качестве рекомбинантных ФП были выбраны лучшие по осахаривающей способности в каждой из серий - КсилА-4, КсилШ-1, МанВ-2, ЭПУ-2, ЭП-4 и ЦБГН-1, в качестве коммерческих ФП использованы Spezyme СР, Celluclast 1.5L, Accellerase 1000 (их характеристики приведены 120 в табл.15). За критерий эффективности гидролиза ЦСМ принимали выход ВС и глюкозы за 24 часа гидролиза при дозировке ФП по белку в реакционной смеси 5мг/г субстрата при добавлении Р-глюкозидазного ФП F10 (40 ед. целлобиазной активности на 1 г субстрата).
Рекомбинантные ФП обладают высокой осахаривающей способностью по отношению к измельченным осине и багассе и превосходят по эффективности гидролиза измельченных осиновой древесины и багассы как контрольный препарат, полученный с помощью исходного штамма P. verruculosum В1-221-151, так и коммерческие ФП. Превосходство новых препаратов над коммерческими можно объяснить более низкой ксиланазной активностью последних: 3,3-7,5 ед/мг в коммерческих препаратах против 21,5-43,8 ед/мг в полученных.
В случае измельченной обессмоленной сосновой древесины рекомбинантные ферментные препараты несколько уступили по осахаривающей способности коммерческому препарату Spezyme СР, но превзошли контрольный препарат Р. verruculosum В1-221-151. Высокий выход Сахаров при гидролизе измельченной сосновой древесины препаратом Spezyme СР, вероятно, связан с более подходящим для осахаривания этого субстрата отношением активностей: самые высокие среди всех препаратов КМЦ-азная и авицелазная активности и более высокая, по сравнению с другими коммерческими препаратами, ксиланазная активность (табл.15).
При гидролизе измельченной осиновой древесины наилучшими для осахаривания рекомбинантными ферментными препаратами являются КсилА-4, ЭПУ-2 и КсилШ-1; измельченной обессмоленной сосны - КсилА-4, и КсилШ-1; измельченной багассы -КсилА-4 и ЭПУ-2.
Влияние рН и температуры на эффективность процесса осахаривания ЦСМ рекомбинантными ФП было изучено на примере гидролиза измельченных багассы и осиновой древесины (100 г/л). В качестве ФП были использованы лучшие по осахаривающей способности в каждой серий - КсилА-4, ЭПУ-2, МанВ-2, ЭП-4, ЦБГН-3 и КсилШ-1. В качестве контролей использовались контрольный препарат В1-221-151 и коммерческий препарат Celluclast 1.5L. Гидролиз ЦСМ проводили при дозировке ФП по белку 5 мг на 1 г субстрата, в присутствии препарата Р-глюкозидазы F10 (40 ед целлобиазнои активности на 1 г субстрата), температурах 40, 45, 50 и 60С и рН от 4 до 6 с шагом 0,5 единиц рН. На рис. 74-75 представлен выход ВС за 24 часа гидролиза при различных значениях температуры и рН.
Максимальный выход ВС при гидролизе всеми использованными рекомбинантными ФП измельченной багассы наблюдали при температуре 45С и рН 4,0-4,5 (27,3-35,6 г/л), рис.74. При рН 4,0-4,5 и температуре 60С выход ВС уменьшался в 2-3 раза (до 12,1-18,8 г/л). При температуре 45С и рН 6,0 эффективность гидролиза также уменьшается в 2-3 раза (выход ВС составил 12,7-15,8 г/л). Условиями гидролиза наименее подходящими для осахаривания измельченной багассы являлись 60С и рН 6,0: выход ВС составил всего 5,6-9,5 г/л.
Влияние рН и температуры на выход ВС (г/л) при гидролизе измельченной осиновой древесины ферментными препаратами. Условия: [S]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата, 40 ед. целлобиазной активности на 1 г субстрата. Таким образом, максимальный выход Сахаров при гидролизе измельченной осиновой древесины всеми использованными рекомбинантными ФП наблюдали при температуре 45С и рН 4,0-4,5 (24,9-32,2 г/л). При этих же значениях рН и температуре 60С выход ВС уменьшался в 2 раза (до 12,2-15,8 г/л). При температуре 45С и рН 6,0 выход ВС также уменьшается в 2 раза (выход ВС составил 12,7-16,2 г/л). Условиями гидролиза наименее подходящими для осахаривания измельченной осиновой древесины являлись 60С и рН 6,0: выход Сахаров составил всего 5,5-9,6 г/л.
