Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор.., .8
1.1 Препараты протеаз из поджелудочной железы 8
1.2 Характеристика панкреатических протеолитических ферментов 11
1.2.1 Трипсин 12
1.2.2 Химотрипсин 16
1.2.3 Эластаза 19
1.2.4 Коллагеназа 22
1.3 Протеазы поджелудочной железы человека 24
1.4 Протеолитические ферменты кур 27
1.5 Использование протеолитических ферментов в народном хозяйстве 31
2 Материал и методы исследования 37
2.1 Определение концентрации белка 37
2.2 Высаливание, обессоливание, концентрирование 38
2.3 Определение активности ферментов 39
2.3.1 Определение активности ферментов по природным і субстратам 39
2.3.2 Определение активности ферментов по синтетическим субстратам - 41
2.4 Разделение и очистка ферментов 43
2.4.1 Гель-хроматография 40
2.4.2 Ионообменная хроматография * 44
2.4.3 Изоэлектрическое фокусирование 45
3 Результаты исследования и их обсуждение 44
3.1 Разработка способа определения активности эластазы по N-трет-бутилоксикарбонил-аланин-р-нитрофениловому эфиру 47
3.2 Получение ферментных препаратов из поджелудочной железы кур, свиней и крупного рогатого скота 48
3.2.1 Содержания ферментов в поджелудочной железе 49
3.2.2 Изучение условий экстракции 52
3.2.3 Активация проферментов поджелудочной железы кур 61
3.2.4 Высаливание протеолитических ферментов 67
3.2.3 Общая схема получения комплексного ферментного препарата 75
3.3 Сравнение препарата протеаз из поджелудочной железы кур с
аналогичными свиней и крупного рогатого скота 80
3.3.1 Активность ферментов в полученных препаратах 80
3.3.2 Хроматографический анализ препаратов на сефадексе G-75 82
3.3.3 Исследование ферментного состава препаратов методом изоэлектрофокусирования 87
3.3.4 Анализ препаратов ионообменной хроматографией 94
3.4 Сравнение лечебных свойств препарата из поджелудочной железы курс аналогичными крупного рогатого скота и свиней 109
3.4.1 Разработка условий применения препаратов при лечении ожогов 109
3.4.2 Клиническая апробация препаратов при лечении ожогов 112
Выводы 114
Список литературы 116
Приложения * 136
- Препараты протеаз из поджелудочной железы
- Протеазы поджелудочной железы человека
- Определение концентрации белка
- Разработка способа определения активности эластазы по N-трет-бутилоксикарбонил-аланин-р-нитрофениловому эфиру
Препараты протеаз из поджелудочной железы
Поджелудочная железа является традиционным сырьем для получения медицинских препаратов с протеолитическим действием и широко используется с этой целью в промышленности. Налажен выпуск как высокоочищенных кристаллических ферментов, так и комплексных препаратов, содержащих широкий спектр активных биологических веществ.
Кристаллические трипсин и химотрипсин (Химотрипсин кристаллический. Ферментный препарат, 1966) получают из свежей поджелудочной железы крупного рогатого скота по прописи Д. Нортропа и М. Кунитца (1950), а также из свежезамороженной - по методике, разработанной Н.Г. Беленьким и Л.Б.Полонской (1962), которые модифицировали способ получения этих ферментов, предложенный вышеназванными авторами. Из поджелудочной железы крупного рогатого скота получают химопсин (в основном, смесь трипсина и химотрипсина) (Химопсин. Ферментный препарат, 1966). Поджелудочная железа свиней также используется для этих целей (Проскуряков М.Т., 1973), но кроме того из нее получают эластазу (эластолитин) и коллагеназу (коллалитин) (Беленький Н.Г. с соавт., 1966).
Комплексные ферментные препараты производятся в большом количестве и содержат различные ферменты, часто не только протеолнтические. В состав одних препаратов входят все растворимые белки, присутствующие в ткани железы, другие же препараты являются более очищенными.
Так, широко известный панкреатин производится из поджелудочной железы свиней. Процесс состоит из водной экстракции ткани и высушивания экстракта на распылительной сушилке или в приготовлении ацетонового порошка измельченной поджелудочной железы (Гуров В.А., 1976). Панкреатин содержит амилазу, липазу и протеазы. По данным П.Г. Сторожука (2001) протеазы панкреатина представлены, в основном, трипсином, которому отводят ведущую роль в инактивации холецистокинин-КР-фактора, в результате чего снижается содержание холецистокинина в крови и панкреатическая секреция. Введение в препарат желчных кислот увеличивает панкреатическую секрецию и холерез, стимулирует моторику кишечника и желчного пузыря.
Амилаза, липаза и протеазы входят в состав таких известных препаратов, как панзинорм форте, панкурмен, фестал, днгестал, котазим форте, мезим форте, трифермент, холензим, вигератин и др. По составу препараты представляют собой или чистый панкреатин, или панкреатин с гемицеллюлозой и компонентами желчи. Причем в современных препаратах ферменты покрыты специальной оболочкой, которая защищает их от разрушения в желудке под действием пепсина и соляной кислоты. Ферменты высвобождаются только в кишечнике. Некоторые препараты имеют двухслойное строение, например, панзинорм: наружный слой, содержащий экстракт слизистой оболочки желудка и аминокислоты, растворяется в желудке, а кислотоустойчивое ядро содержит панкреатин в экстракте желчи крупного рогатого скота и распадается в кишечнике.
Большое количество разнообразных патентованных гастроэнтерологических препаратов отличаются друг от друга количеством входящих в них компонентов, ферментативной активности, способу производства и форме выпуска. Они широко используются в гастроэнтерологии, но не всегда дают желаемый эффект вследствие низкой активности содержащихся в них ферментов (Афанасьева Л.М., Проскуряков М.Т., 1979; Башмакова И.А., 1988; Сторожук П.Г., 1994; 2000).
Активность трипсина и суммарная протеолитическая активность некоторых патентованных препаратов ферменто-заместительной терапии (дигестал, креон, мезим-форте, панцитрат, панзинорм, панкреатин, фестал, энзистал, холензим) была изучена при одинаковых условиях. Установлено, что при сравнении суммарной протеолитической активности наиболее активным является панзинорм (449 ед. в таблетке). К нему приближаются по данному показателю фестал (418 ед.) и панцитрат (372 ед.) Высокая протеолитическая активность у фестала и панзинорма обеспечивается за счет трипсина, а у панцитрата за счет химотрипсина и других протеиназ. Очень низкой активностью обладают мезим-форте и холензим. Поэтому, чтобы получить такой же протеолитический эффект, как при приеме дигестала иди панзинорма, их дозы надо увеличивать в десятки раз (Сторожук П.Г., Быков И.М., Хвостова Т.С. и др. ,2001).
В 1987 г. П.Г. Сторожук, И.М. Быков и И.И. Павлюченко получили препарат панинтестин, обладающий высокой протеолитической активностью, не уступающий, а по некоторым показателям даже превосходящий многие зарубежные аналоги. А в 1996 г. под руководством П.Г. Сторожука был разработан метод получения некролизирующих повязок "Девитас" из поджелудочной железы и слизистой двенадцатиперстной кишки убойных животных.
Из гепатопанкреаса камчатского краба получен препарат "Морикраза", содержащий комплекс эндопротеиназ и экзопептидаз. Помимо обшей протеолитической, он обладает высокой фи бри нолити ческой и коллагенолитической активностью (Исаев В.А. с соавт., 1993, 1997; Руденская ПН., 1997; Сахаров И.Ю. с соавт., 1988-1994).
В последнее время задачи стабилизации ферментов, снижения их им-муногенности, способности быть направленными к пораженному органу решаются методами иммобилизации - связывания ферментов с полимерными носителями (Березин И.В., Мартинек К., 1983). В качестве носителей используются волокнистые материалы на основе целлюлозы, поливинилового спирта, солей альгиновой кислоты, полиамидное и коллагеновое волокно; гранулированные -целлюлозные шарики, гранулы декстрана, предварительно гидролизованные шарики капрона и др. Применяются препараты, изготовленные нековалентным включением фермента в растворимые целлюлозы, в медленно рассасывающийся коллаген. Готовятся нити, в которые при формовании включался фермент и используются в качестве шовного материала. Иммобилизации подвергают химотрипсин, трипсин, террилитин, субтилизин, коллагеназу и др. О применении иммобилизованных протеиназ в медицинской практике сообщают многие авторы (Ларионова Н.И., Торчилин В.П., 1983; Рыльцев В.В., Филатов В.Н., 1997; Игнатюк с сотр., 1997; Филатов В.Н., Рыльцев В.В., 1997). Белов А.А. с сотр. (1997) иммобилизовали на диальдегипиеллюлозе полиферментный препарат "Коллитин" из поджелудочной железы свиней и коллагенолитический комплекс из гепатопанкреаса краба. Апробация в клинических условиях показала их высокую эффективность.
Очевидно, что препараты панкреатических протеаз получают из поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней, с недавнего времени из гепатопанкреаса камчатского краба. С другой стороны ведется поиск других источников сырья. В.В. Нечепуренко (1996) предложил использовать с этой целью поджелудочную железу кур. П.Г. Сторожу к (2001) использовал не только поджелудочную железу, но и слизистую двенадцатиперстной кишки убойных животных. Однако коммерческое производство этих препаратов по разным причинам не налажено. Куриная поджелудочная железа как сырье в этих целях не используется. С нашей точки зрения, среди нетрадиционных источников получения препаратов с протеолитическим действием перспективной является все-таки поджелудочная железа кур.
Протеазы поджелудочной железы человека
Протеолитические ферменты поджелудочной железы человека представляют собой интерес в связи с тем, что при ферментозаместительной терапии протеиназы других млекопитающих вводятся в его организм, поэтому возникает необходимость изучения взаимодействия протеиназ разной природы происхождения.
В J Buck (1967) с сотр. подробно изучили трипсин человека. Затем Keller PJ., Allan B.J. (1968) и Silberberg V.L., Hadron В. (1968) сообщили о наличии двух трипсинов и двух химотрипсинов. А в 1971-1972 гг. Coan N.H., Travis J. (цит. по Feinstein G., et al., 1974) обнаружили три формы химотрипсина в поджелудочной железе человека. Видимо, применение различных методов выделения и очистки привели к получению противоречивых результатов.
В 1974 г. G. Feinstein с сотр. комбинацией аффинной и ионообменной хроматографии на SE-Sephadex выделили из активированного экстракта поджелудочной железы человека два трипсина, два химотрипсина и одну наиболее очищенную форму эластазы, в то время как другая фракция, обладающая эластазной активностью проявляла хотя и слабую, но измеримую химотрипсиноподобную активность при гидролизе АТЭЭ и содержала небольшое количество калликреина. Высокоочищенные ферменты были гомогенными при гель-электрофорезе, ультрацентрифугировании и иммунологических исследованиях.
Было найдено, что трипсины человека по удельной активности при гидролизе ТАМЭ менее активны, чем бычий трипсин. Минорный трипсин и эластаза слабо устойчивы в кислой среде.
Два химотрипсина человека отличались друг от друга по электрофоретической подвижности и по удельной активности при гидролизе АТЭЭ и АТНА, но были иммунологически идентичны при двойной диффузии, что позволило авторам предположить, что два химотрипсина представляют собой два разных продукта активации одного профермента. То есть то, что химотрипсин 2 подобен се-химотрисину быка, а химотрипсин 1 - р- или у-форме. Лишь в некоторых опытах была получена третья полоса преципитации, которая позволяла предположить существование третьей формы химотрипсина (второй минорной). Трипсины человека ингибировались ТЛХК (96%), химотрипсины -ТФХК (98%), тогда как и те и другие ингибировались ДПФ, что доказывало наличие серинового и гистидинового остатков в их активном центре. Куриный овоингибитор не угнетал трипсины человека, а куриный овомукоид — трипсины и химотрипсины- Тогда как ингибитор из бобов лимы оказывал сильное ингибирующее действие на зги ферменты. В то же время, панкреатический сок человека оказывал угнетающее действие на трипсин быка и не действовал на его химотрипсин.
Молекулярная масса трипсинов человека была равна 20800 (при расчете по аминокислотному составу) - 21500 (при ультрацентрифугировании) и 22400-20700 Да, химотрипсинов - 23700-23300 и 23100-22100 Да, эластазы -25050-24100 Да. Молекулярная масса трипсина быка в параллельных опытах была равна 23800 (ультрацентрифугирование), химотрипсина - 21600 Да. По данным Hartley B.S., Shotton D.N. (1971) молекулярная масса эластазы быка равна 25900 (по аминокислотному составу) или 25000 (ультрацентрифугирование). Таким образом, авторами был сделан вывод о близости молекулярных масс ферментов человека и быка.
Кроме протеиназ в поджелудочной железе человека были обнаружены, очищены и изучены 4 белковых ингибитора протеолитических ферментов. Два мажорных компонента, обладающих антитрипсиновой активностью, были отнесены к ингибиторам Казаля. Наиболее основная форма, с молекулярной массой 5200 Да, имела рї 8,7, содержала 48 аминокислотных остатков. Самая анионная имела pi 6,5, молекулярную массу 4300 Да, в ее состав входило 39 аминокислотных остатков. Оба ингибитора были активны по отношению к бычьему трипсину и двум трипсинам человека и не ингибировали химотрипсины человека, но обладали слабой активностью к химотрипсину быка.
Определение концентрации белка
Концентрацию белка определяли методом Лоури (Кочетов Г.А., 1980), используя в качестве стандарта бычий кристаллический химотрипсин. При очистке ферментов оперативное измерение концентрации белка производили по поглощению в УФ-области (Нортроп Д. с сотр., 1950; Скоупс Р., 1985). Для этого образец помещали в кювету с длиной оптического пути 10 мм и измеряли на спектрофотометре экстинкцию при длине волны 280 нм. Результат измерения принимали за количество единиц белка в 1 мл образца при показаниях прибора до 1,0. Удельную активность ферментов рассчитывали как количество единиц изменения оптической плотности реакционной смеси на единицу оптической плотности раствора исследуемого образца при длине волны 280 нм. Степень очистки рассчитывали по изменению удельной активности ферментов и выражали в количестве единиц изменения оптической плотности в растворе при гидролизе природных и синтетических субстратов на единицу оптической плотности раствора белка при длине волны 280 нм. Первоначальным этапом очистки ферментов была экстракция. В дальнейшем производилось высаливание кристаллическим сульфатом аммония "х. ч." Количество соли, необходимо для получения заданной степени насыщения, рассчитывали, используя формулу (Кочетов Г.А., 1980): где V - объем исходного раствора с концентрацией сульфата аммония, равной Сі насыщения; Сг - требуемая степень насыщения; X - количество граммов сухого сульфата аммония, которое должно быть добавлено для получения насыщения, равного Cz- Перед добавланием сульфат аммония взвешивали, измельчали и медленно добавляли соль к раствору ферментов. По мере приближения к заданной степени насыщения соль добавляли все медленнее. Сульфат аммония обладает слабым подкисляющим действием [99], поэтому в процессе высаливания осуществляли контроль рН. После получения требуемой степени насыщения раствор оставляли на 10 - 12 часов при температуре +4 С, после чего фильтровали. Полученный осадок использовали в дальнейшей работе и именовали высолом.
Для определения степени насыщения раствора сульфатом аммония, при которой происходит наиболее полное осаждение исследуемых ферментов, проводили ступенчатое высаливание от 0 до 0,9 степени насыщения с интервалом 0,1 насыщения. В результате мы получили 9 осажденных при разных степенях насыщения фракций. Растворы дважды фильтровали через один и тот же фильтр диаметром 5 см. Фильтр подсушивали, нарезали квадратиками 1 х 1 мм, заливали 10 мл охлажденной дистиллированной воды, определяли активность ферментов, количество белка и находили значения концентрации сульфата аммония, при которых осаждалось максимальное количество ферментов. Активность ферментов и концентрацию белка определяли и в фильтрате.
Полученные высолы содержали большое количество соли, которая удалялась диализом. Осадки диализовали в целлофановых трубках диаметром около 2 см в сосуде 3 л со сменой воды каждые 2-4 часа до отрицательной пробы на сульфаты с хлоридом бария. Концентрирование растворов проводили в тех же целлофановых трубках, что и диализ, с вентиляцией при температуре +3-(+7)С Активность пищеварительных ферментов определяли, используя природные и синтетические субстраты по оригинальным авторским методикам. 2.3 Л Определение активности ферментов по природным субстратам Протеолитическую активность трипсина и химотрипсина определяли по методу М. Кунитца (цит. по Нортропу Д. с сотр., 1950), сущность которого заключается в количественном спектрофотометрическом определении продуктов гидролиза казеина при длине волны 280 нм после осаждения непереваренных остатков трихлоруксусной кислотой (ТХУК). Ход определения: 1 мл \% - го казеина, приготовленного на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,6, прогревали с 1 мл пробы при 35 С в течение 20 минут, реакцию останавливали, добавляя 3 мл 0,3 М ТХУК. Пробы выдерживали 1-1,5 часа и фильтровали через плотный складчатый фильтр. В фильтрате определяли оптическую плотность против контроля, в который фермент добавляли после кислоты. За 1 единицу активности принимали количество фермента, которое в указанных условиях повышает оптическую плотность на 1,0 ед по сравнению с контролем. Протеолитическую активность трипсина и химотрипсина определяли так же с использованием денатурированного гемоглобина методом М. Anson (1938), измеряя спектрофотометрически продукты гидролиза гемоглобина после осаждения ТХУК. Субстрат готовили следующим образом: к 10 мл 22% -го раствора гемоглобина добавляли 8 мл і н NaOH, 36 г мочевины и 72 мл воды и выдерживали 1 час для денатурирования гемоглобина. Затем доводили рН до 7,5 концентрированным раствором однозамещенного фосфата калия. Ход определения: к 2,5 мл субстрата добавляли 0,5 мл раствора фермента, инкубировали при 35С 10 минут, после чего приливали 5 мл 0,3 М ТХУК, выдерживали 30 минут и фильтровали. В фильтрате определяли оптическую плотность при длине волны 280 нм против контроля, куда фермент добавляли после кислоты. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое в указанных условиях дает прирост оптической плотности на 1,0 ед.
Химазную (молокосвергывающую) активность химотрипсина определяли методом Н.П. Пятницкого (1969). Химотрипсин пренадлежит к числу ферментов, створаживающих молоко. Молокосвертывающая активность химотрипсина - отличительный признак в ряду других щелочных протеиназ. Под действием химотрипсина происходит ограниченный протеолиз казеиногена молока с отщеплением стабилизирующего гликомакропептида и образованием в воде нерастворимого п-казеина, который выпадает в осадок в виде хлопьев. Скорость створаживания молочно - ацетатной смеси (МАС) прямо пропорциональна активности фермента при времени створаживания от 4 до 60 минут. МАС представляет собой смесь равных объемов свежего коровьего молока и 1 М ацетатного буфера рН 5,0. Ход определения: к 0,5 мл пробы фермента приливали 5 мл прогретой до 35eC МАС и измеряли время до появления первых хлопьев выпадающего в осадок п-казеина. За единицу химазной активности принимали такое количество фермента, которое створаживало 5 мл МАС за 1 минуту при температуре 35 С. Активность вычисляли по формуле:
Разработка способа определения активности эластазы по N-трет-бутилоксикарбонил-аланин-р-нитрофениловому эфиру
Специфичные для эластазы синтетические субстраты М-сукцинил-три-L-аланин-р-нитроанилид (СТАПНА) и К-ацетил-три-Ь-аланин-р-нитроанилид (АТАПНА) достаточно дорогие и дефицитные, поэтому нами были предпринята попытка использовать более дешевый синтетический субстрат N-бутилоксикарбонил-Ь-аланин-р-нитрофен иловый эфир (БОКАНФ), ранее предложенный для определения эластазоподобной активности в гранулоцитах (Visser L. et al., 1972; Оглоблина ОТ. и др., 1980).
Методика определения была следующая: к 0,1 мл пробы добавляли 2,8 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 6,5 и ОД мл 0.01 М раствора БОКАНФ в ацетонитриле. Измеряли начальную оптическую плотность при длине волны 347,5 нм и конечную через 15 мин после инкубации при 25 С.
БОКАНФ Поэтому в параллельных опытах мы определяли по специфическим субстратам содержание химотрипсина (MAC) и трипсина (БАПНА) в образцах и вычитали их из активности, определенной при гидролизе БОКАНФ.
Нами было определено, что удельная активность чистых ферментных препаратов при гидролизе БОКАНФ составила для эластазы свиньи ("Реахим") 15000 ед/r, химотрипсина крупного рогатого скота - 780 ед/г, трипсина ("СПОФА") - 370 ед/г. Таким образом, специфичность свиной эластазы к субстрату БОКАНФ приблизительно в 20 раз больше, чем химотрипсина быка и 40 раз, чем трипсина быка (Проскуряков М.Т., Фиалко А.И., 1999).
Таким образом, синтетический субстрат БОКАНФ применим для определения содержания эластазы. Неудобство заключается в его неспецифичности, что требует дополнительного анализа трипсина и химотрипсина. Это увеличивает ошибку определения- К тому же, при определении эластазы в поджелудочной железе кур необходимо учитывать специфическую активность куриных трипсина и химотрипсина. Поэтому, в дальнейшем, при наличии более специфичных субстратов АТАПНА и СТАПНА, мы проводили определение содержания эластазы с помощью этих субстратов (см. разд. 2.3.2).
Активность ферментов в препарате в большой степени зависит от потерь на пути выделения и очистки его из ткани животного сырья. Поэтому изучение условий, при которых наилучшим образом сохраняются ферменты, является важнейшей задачей в процессе получения препаратов. Для того, чтобы знать насколько удачно подобраны условия, необходимо определить содержание ферментов в сырье, в данном случае в поджелудочной железе кур, свиней и крупного рогатого скота. Активность ферментов в поджелудочной железе кур, свиней и крупного рогатого скота первоначально определялась в водных экстрактах.
Замороженный материал измельчали на мясорубке, затем суспендировали на гомогенизаторе типа MPW - 309 в течение 5 минут, добавив дистиллированную воду в соотношении вес/объем 1:10. Гомогенат выдерживали в течение 4 часов при температуре +4С в условиях постоянного перемешивания на магнитной мешалке. Полученную суспензию центрифугировали при 6000 оборотов в минуту в течение 15 минут. В экстракте поджелудочной железы определяли начальную химазную (по скорости створаживания молочно-ацетатной смеси (МАС)), трипсиновую (при гидролизе N - бензоил - D,L - аргинин - п - нитроанилида (БАЛНА)), эластазную активность (при гидролизе эластина и N-сукцинилтриаланин-п-нитроанилида (СТАПНА) или N-ацетилтриаланин-п-нитроанилида (АТАПНА), а также общую протеолитическую активность (при гидролизе гемоглобина и казеина). Экстракты ферментов подщелачивали 5 М едким натрием до рН 8,0, добавляли сухой хлорид кальция из расчета 0,05 М на литр экстракта и исследовали активацию проферментов. Фиксировали максимальную активность, достигнутую при активации.
Водные экстракты имели рН 6,0-6,2. Наряду с проферментами в свежей железе всегда обнаруживалось до 1,5 - 2,5% активных ферментов. Результаты измерения активности ферментов (в пересчете на 1 г сырого веса) после полной активации при рН 8,0 приведены в таблице 3.1.
При работе с кристаллическими ферментами: трипсином крупного рогатого скота (СПОФА), химотрипсином крупного рогатого скота (ОАО "Самсон") и эластазой из поджелудочной железы свиньи ("Реахим") было установлено, что Іед MAC соответствует содержанию химотрипсина крупного рогатого скота 1,5 мг, 1ед БАЛЛА - 0,171мг трипсина крупного рогатого скота, 1ед СТАПНА - 78,1мкг эластазы свиньи. По литературным данным удельная активность трипсина крупного рогатого скота при гидролизе БАПНА составляет 12,5 ед./мг (Нечепуренко В.В., 1998) или 13,8 едімг (Ikeno К., 1986), а трипсина кур - 15 ед./мг (Нечепуренко В.В., 1998), то есть приблизительно в 1,2 раза больше.
