Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние проблемы энзимотерапии при секреторной недостаточности органов гастродуоденальной зоны 11
1.1. Основные гидролазы желудочно-кишечного тракта 11
1.2. Применение пищеварительных ферментов в гастро энтерологической практике 25
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Препараты ферментозаместительной терапии 38
2.1.1. Методы изучения активности ферментов в исследуемых препаратах 38
2.2. Методы постановки экспериментов на крысах и методы определения активности пищеварительных ферментов в гомогенатах слизистой желудка, двенадцатиперстной кишки и поджелудочной железы 44
2.3. Статистические методы исследования 51
Глава 3. Определение активности ферментов в патентованных препаратах ферментозаместительной терапии 53
3.1. Характеристика препаратов энзимотерапии 53
3.1.1- Определение протеолитической активности в препаратах ферментозаместительной терапии 55
3.1.2. Определение активности липазы и амилазы в препаратах ферментотозаместительной терапии 63
3.2 Зависимость стабильности ферментов в препаратах энзимотерапиитерапии от их формы выпуска 69
Глава 4. Ферментообразующая функция органов гастродуоденальноизоныукрыс при парентеральном введении препаратов заместительной ферментотерапии 79
4.1. Протеолитическая активность слизистой желудка, двенадцатиперстной кишки и поджелудочной железы крыс при парентеральном введении пептида В и препаратов ферментозаместительной терапии 84
4.2. Активность амилазы и липазы в поджелудочной железе и двенадцатиперстной кишке у крыс при парентеральном введении пептида Bj и препаратов ферментозаместительной терапии 93
Заключение 100
Выводы 111
Литература 113
Список печатных трудов, опубликованных по теме диссертации 136
- Основные гидролазы желудочно-кишечного тракта
- Методы изучения активности ферментов в исследуемых препаратах
- Определение протеолитической активности в препаратах ферментозаместительной терапии
- Протеолитическая активность слизистой желудка, двенадцатиперстной кишки и поджелудочной железы крыс при парентеральном введении пептида В и препаратов ферментозаместительной терапии
Введение к работе
Актуальность темы. Ферментозаместительная терапия является одной из наиболее важных звеньев лечебных мероприятий в гастроэнтерологии (Златкина А.Р., 1998; Охлобыстин А.В., 2001).
Многие заболевания органов гастропанкреатодуоденальной зоны сопровождаются снижением их секреторной функции, что приводит к нарушению процессов пищеварения в желудочно-кишечном тракте (Логинов А.С., Исакова З.С., 1984; Багненко С.Ф. и соавт., 2000; Andersen B.N. et al., 1982). К наиболее частым причинам ферментативной недостаточности относятся хронический панкреатит, состояние после резекции поджелудочной железы, хронический гастрит с пониженной кислотообразующей функцией желудка, хронический энтерит, опухоль поджелудочной железы, диетический фиброз (Яхонтова О.И., 1980; Петухов В.А., Дибров А.Д., 1999; HalgreenH., 1986; KashknaK., 1997).
Такие заболевания, как правило, сопровождаются изменением процесса адсорбции панкреатических ферментов на поверхности слизистой оболочки тонкой кишки, что приводит к нарушению переваривания и всасывания пищевых веществ - синдрому мальдегистии / мальабсорбции нутриентов (Клюева Ж.И. и соавт., 1980; Каретерс Дж.М, 1997). Для лечения этого синдрома широко используются ферментные препараты фер-ментозаместительной терапии.
В настоящее время мировая фармацевтическая промышленность выпускает большое количество ферментных препаратов в виде таблеток, порошка или капсул. Они отличаются друг от друга по количеству входящих компонентов, активности энзимов, способу произвоства, а также по коммерческой стоимости. (Машковский М.Д., 1998; РЛС - Энциклопедия лекарств, 2000; Справочник Видаль, 2001).
Основным компонентом всех ферментных препаратов, изготовленных из животного сырья (поджелудочная железа свиней) является панкреатин, который в своем составе содержит протеазы, липазу и амилазу.
Ферментные препараты, наряду с ферментозаместительной терапией в гастроэнтерологии, широко применяются в хирургии, педиатрии, а также населением как безрецептурные лекарственные средства (Яковенко Э.П. 1998; Фролькис А.В., 2000). К сожалению, большинство из них часто оказываются мало эффективными, поскольку обладают небольшим потенциалом активности содержащихся в них ферментов. Крупнейший специалист в области ферментозаместительной терапии в России профессор Н.П. Пятницкий установил, что для нормального желудочного пищеварения желудочные железы здорового взрослого человека в течение суток должны продуцировать не менее 1 г пепсина. (Сторожук П.Г., 1985; Сторожук П.Г. и соавт., 2001)
Поэтому вопрос об изыскании новых средств энзимотерапии и изучении их влияния на экскреторную функцию поджелудочной железы остается актуальным и в настоящее время.
На кафедре биохимии Кубанской государственной медицинской академии в этом направлении на протяжении многих лет ведутся исследовательские работы. Так, проф. H.IL Пятницким и его учениками были созданы и внедрены в практическое здравоохранение препараты с высоким содержанием ферментов (пепсидил, копепсидил, панинтестин), широко применяемые в гастроэнтерологии.
При изучении состава и механизмов действия отечественных препаратов было установлено, что в них содержатся биологически активные пептиды, обладающие способностью влиять на секреторные процессы пищеварительных желез. Из пепсидила и копепсидила, которые получают из слизистой оболочки желудка свиней или из сычуга крупного рогатого скота, а также из панинтестина выделены пептиды, обладающие способно-
стью стимулировать не только секрецию пепсина, но и ферментообразова-ние в поджелудочной железе и в слизистой тонкой кишки (Быков И.М., 1982; Быков ИМ. и соавт., 2000).
В последнее время появились экспериментальные доказательства того, что эффективность действия препаратов энзимотерапии определяется главным образом высокой активностью ферментов, при помощи которых частично компенсируется секреторная недостаточность пищеварительных ферментов, и наличием в препаратах биологически активных пептидов, которые обладают свойством преимущественно стимулировать ослабленную патологическим процессом секреторную деятельность пищеварительных желез (Сторожук П.Г. и соавт., 2001; Lankisch P.G., 1998).
Однако при всем многообразии ферментных препаратов для эффективного лечения патологий желудочно-кишечного тракта, подобрать соответствующую ферментозаместительную терапию, представляется весьма нелегкой задачей. В каждом конкретном случае, подбор ферментного пре-, парата в основном проводится по наличию в их составе высокой активности того или иного фермента (особенно трипсина и липазы), содержащегося в нем.
При изучении сигнатурных данных установлено, что почти во всех препаратах сведения о раздельном содержании основных протеиназ -трипсина и химотрипсина отсутствует, указывается только суммарная протеолитическая активность, хотя основанием для выбора ферментного препарата в качестве обезболивающего средства при хроническом панкреатите является высокое содержание трипсина в таблетке (Охлобыстин А.В.,2001).
Кроме того, по сигнатурным данным активность протеиназ, амилазы и липазы в разных препаратах сравнивать невозможно, так как ферменты в одних препаратов выражаются в единицах ИР (единица действия Международной Федерации фармации), для других - в единицах Ph Eur
(единица действия Европейской фармакопии), а для третьей категории препаратов активность ферментов отдельно не указывается, только приводится количество основного компонента (панкреатина) в мг.
Поэтому изучение и сравнительная оценка патентованных препаратов энзимотерапии по активности ферментов содержащихся в них, и по механизму их действия на секреторную функцию пшцеварительных желез представляет теоретический и практический интерес, так как успех корре-гирующей ферментотерапии зависит от правильного подбора препарата.
Целью настоящей работы явилось проведение сравнительного анализа активности ферментов в патентованных импортных и отечественных препаратах с препаратом панинтестин, разработанным на кафедре биохимии и изучение их биологического действия на активность ферментов в пищеварительных железах.
В связи с этим перед исследователем стояли следующие задачи:
Определить активность основных протеиназ (трипсина, химотрипси-на), а также амилазы и липазы в наиболее широко распространенных препаратах энзимотерапии.
Провести сравнительный анализ активности ферментов, выраженных в международных единицах, в девяти патентованных препаратах: панзи-норм, ликреаза, панцитрат, креон, энзистал, фестал, дигестал, мезим форте и панкреатин (Югославия) с результатами собственных исследований.
Изучить в условиях in vitro способность защитных оболочек в различных лекарственных формах (таблетки, драже, капсулы) противостоять соляной кислоте желудочного сока.
Изучить способность препаратов энзимотерапии и пептида В], выделенного из панинтестина влиять на активность пищеварительных ферментов одновременно в слизистой желудка, поджелудочной железе и слизистой двенадцатиперстной кишки при их парентеральном введении в экспериментах на крысах.
Основные положения, выносимые на защиту
Экспериментально установлено, что активность ферментов в лекарственной форме (таблетки, драже, капсулы) препаратов энзимотера-пии не одинакова и колеблется в широких пределах. Разработанный на кафедре препарат панинтестин по активности ферментов не уступает многим отечественным и зарубежным аналогам, а по некоторым биохимическим показателям их превосходит.
Выявлено, что процентное соотношение активности основных ферментов в патентованных препаратах ферментозаместительной терапии отечественного и зарубежного производства по сигнатурным данным не всегда совпадает с результатами собственных исследований.
Экспериментально доказано, что традиционные лекарственные формы ферментных препаратов — крупные таблетки и драже — покрыты защитной оболочкой, которая недостаточно устойчива в кислой среде, а высокая резистентность к действию соляной кислоты наблюдается у препаратов нового поколения с формой выпуска в виде микросфер или микротаблеток.
Установлено, что ферментные препараты при парентеральном введении обладают способностью оказывать влияние на активность ферментов в в поджелудочной железе, желудке и двенадцатиперстной кишке.
Выявлено, что сила действия панинтестина, в большей степени зависит от биологически активных пептидов, которые наряду с пищеварительными ферментами входят в его состав.
Предполагается, что в патентованных препаратах ферментозаместительной терапии основной компонент — панкреатин также содержит биологически активные пептиды, обладающие способностью влиять на секреторные процессы пищеварительных желез.
Новизна исследования
Впервые дан сравнительный анализ наиболее распространенных патентованных препаратов ферментозаместительной терапии: мезим форте, панкреатин (Акрихин), креон, панцитрат, панкреатин (Югославия), панкреатин (Биомед), дигестап, панзинорм, холензим, энзистал, фестал, лик-реаза, вобэнзим ипентал, по результатам собственных исследований и сигнатурным данным, показывающий, что активность ферментов в изучаемых препаратах не всегда совпадает с сигнатурными данными.
В эксперименте in vitro установлено, что в традиционных лекарственных формах в виде таблеток и драже защитные оболочки не обладают достаточно высоким кислотоустойчивым свойством, в результате чего все ферменты, содержащиеся в препарате, подвергаются частичной инактивации, и особенно липаза.
В экспериментах на крысах дана сравнительная оценка способности панинтестина, патентованных препаратов ферментозаместительной терапии и пептида В|, выделенного из панинтестина методом гель-хроматографии влиять на активность ферментов в поджелудочной железе, желудке и двенадцатиперстной кишке.
Научно-практическая значимость работы
Полученные результаты по сравнительному анализу активности ферментов в препаратах энзимотерапии как в разовой лекарственной дозе (таблетки, драже) так и в пересчете на 1 г белка могут быть реализованы в гастроэнтерологической практике для разработки оптимальной схемы лечения больных с нарушенной внепгаесекреторной функцией поджелудочной железы.
Установленые данные, что в крупных таблетках и драже диаметром 3-5 мм (фестал, энзистал, панкреатин и др.) защитные покрытия не обладают достаточным кислотоустойчивым свойством, приводящим к инак-
тивации большей части ферментов, могут способствовать наиболее правильному подбору лекарственной формы или соответствующей дозы ферментных препаратов при назначении заместительной ферментотерапии.
Сведения о внедрении результатов исследования в практику
Материалы диссертационной работы используются гастроэнтерологами Республиканского гастроцентра и в лечебных учрежденях г. Краснодара, а также при чтении курса лекций на кафедрах биохимии, нормальной физиологии, патофизиологии, гастроэнтерологии с курсом интроскопии факультета последипломной подготовки врачей Кубанской государственной медицинской академии.
По материалам проведенных исследований опубликовано 7 печатных работ. Основные положения работы доложены на IV Международном конгрессе по проблеме «Парентеральное и энтеральное питание» (Москва, 2000) и Всероссийской научно-практической конференции «Органосо-храняющие принципы в хирургии неотложных состояний» (Ейск, 2001).
Основные гидролазы желудочно-кишечного тракта
По современным представлениям поступающая в организм пища подвергается действию различных ферментов класса гидролаз, которые синтезируются специализированными клетками и катализируют гидролитическое расщепление пищевых субстратов (Тимофеева Н.М., 1998).
Процесс переработки пищи осуществляется по мере продвижения пищевых масс по желудочно-кишечному тракту. В ротовой полости пища смешивается со слюной, обладающей амилазной активностью, и подверга-f ется механической обработке. Значение желудка состоит в депонировании и разжижении пищи под действием соляной кислоты и пепсинов, денатурировании и начальном гидролизе белков, создании пищевого комка для эвакуации в двенадцатиперстную кишку. Основные гидролитические процессы происходят в тонкой кишке, где пищевые вещества расщепляются до мономеров, всасываются и поступают в кровь и лимфу (Полтырев С.С, Курцин И.Т., 1980; Кушак Р.И., 1983; Alpers D.H., 1987).
Число протеиназ — ферментов, способных катализировать гидролиз пептидной связи, - весьма велико. Это в известной мере обусловлено множественностью субстратов, последовательно образующихся при расщеплении компактной белковой глобулы до коротких пептидов, а затем - до аминокислот. Так, для того чтобы обеспечить полный ферментативный гидролиз коротких пептидов - завершающую стадию протеолиза, понадобится около трех десятков пептидаз (Степанов В.М., 1998).
Главные клетки желудочных желез синтезируют ряд проферментов, объединенных в группу пепсиногенов. Первые работы по их разделению выполнены на кафедре биохимии Кубанского мединститута А.З. Вафиным (1966) и Р.В. Завьяловой (1976) под руководством проф. Н.П Пятницкого. Методом ионообменной хроматографии и электрофореза в крахмальном блоке авторами было установлено, что в слизистой оболочке желудка у взрослого человека и детей, в том числе и у новорожденнных содержатся 3 профермента: пепсиноген I, пепсиноген II и пепсиноген Ш.
Позже методом электрофореза выделено 7 проферментов (Hirschow-itz В J., 1984), а при иммунологическом исследовании пепсиногены делят на восемь фракций, входящих в две иммунологически гетерогенные группы - пепсиноген I и пепсиноген II (Samlofif L, Liebman W., 1973; Weinstetn W. et al., 1977; Lanas A.L. et aL, 1994).
Песиногены I вырабатываются в фундальной, а пепсиногены II — в антральной части желудка и проксимальной части двенадцатиперстной кишки (Waterman F., Schwann N., 1969), а также в кардиальной и, в небольшом количестве, в фундальной части желудка (Neutra М., Fostner J., 1996).
Активирование пепсиногенов происходит достаточно быстро при сдвиге рН среды в кислую сторону ( 5,0) и осуществляется аутокаталити-чески. Наличие некоторого количества активного пепсина (например, на слизистой оболочке желудка) дает начальное ускорение процессу активирования (Танг Дж.Н. и соавт., 1976).
В желудочном соке человека выделяют пепсиноген А (песиногены 1— 5-й групп), пепсиноген С (6 - 7-й групп), пепсиноподобную протеиназу, катепсин D. Важнейшими из них являются пепсин А, обозначаемый как пепсин (КФ 3.4.4.1), и пепсин С - как гастриксин (КФ 3.4.4.3) (Maiwald L., 1979).
Пепсин — белок с молекулярной массой 34100. Его молекула представляет собой одну полипептидную цепь, состоящую из 343 аминокислотных остатков (Валцева Т.А. и соавт., 1973; Dixon М, Mebb Е.С., 1982). Особенностью аминокислотного состава в молекуле пепсина является выраженное преобладание остатков кислых аминокислот (аспарагиновой и глутаминовой) над остатками основных. Кроме того, отмечается высокое содержание аминокислот гидрофобного характера с неполярными боковыми цепями, а также остатков пролина и серина. В молекуле пепсина содержатся сера, образующая дисульфидные мостики, и остаток фосфорной кислоты, присоединенный к гидроксильной группе серина. В отличие от других ферментов, в пепсине не содержится какой-либо простетической группы небелковой природы (Вахитова Э.А. и соавт., 1970; Foltmann В., Pedersen V.B., 1977).
Пепсин является уникальным ферментом, действующим на белки в резко кислой среде (оптимум вблизи рН 1,5 - 2,0). С повышением рН его активность падает и при рН 4,0 становится незначительной, а при рН 8,5 пепсин денатурируется с потерей активности. Однако при обратном переходе к нейтральной и кислой среде небольшая его часть снова реактивируется (Зинченко А.А. и соавт., 1978; Шлыгин Г.К., 1985; Baron J.H., 2000).
В зоне оптимальной активности пепсин проявляет мощное протеоли-тическое действие. Под его влиянием в белковой молекуле разрываются преимущественно пептидные связи, образованные карбоксильными группами фенилаланина, тирозина и триптофана, а также, хотя и с меньшей скоростью, связи лейцина и дикарбоновых аминокислот (Орехович В.Н. и соавт., 1961; Владимиров Т.Е. и соавт., 1962; Янсоне И.Л., 1975; Lehrringer A.L., 1985).
Пепсин не обладает строгой специфичностью: в некоторых белках, помимо указанных связей, он расщепляет и связи целого ряда других аминокислот. В результате его действия белковая частица распадается главным образом на крупные фрагменты; наряду с этим от белка отделяются мелкие пептиды и даже некоторое количество свободных аминокислот (Ивашкин В.Т., 1981; Панасюк Е.Н. и соавт., 1990; Roberts N.B. et al, 1995).
Пепсин оказывает также створаживающее действие на казеиноген молока (Пятницкий Н.П., 1965; Латышева Т.Е., 1975). Особенно важно, что под влиянием пепсина расщепляется коллаген - главный компонент волокон соединительной ткани. На этот белок другие пищеварительные про-теиназы действуют слабо. Расщепление коллагена межклеточной соединительной ткани мяса и других животных продуктов открывает возможность проникновения пищеварительных ферментов в клетки и переваривания клеточных белков (Шлыгин Г.К., Василевская Л.С., 1985).
Особый интерес представляет тот факт, что желудочный сок в зависимости от значения рН имеет два выраженных пика наибольшей активности: при рН 1,5 - 2,0 и 3,3 - 4,0 (Янсоне ИЛ., 1974; Taylor W.H., 1959). Существует мнение (Taylor W.H., 1968), что, действуя на многие белковые субстраты, пепсин имеет два максимума активности: при рН около 2,0 и при рН 3,3 - 4,0. Полагают, что в его молекуле имеется два активных центра. Однако этот вопрос остается дискуссионным. Другие исследователи данное явление объясняют наличием в соке разных изоформ пепсина (Ко-ротько Г.Ф., 1980; Haschen R.J., 1981).
Методы изучения активности ферментов в исследуемых препаратах
Биологическая ценность препаратов ферментозаместительной терапии, применяемых для коррекции секреторной недостаточности органов гастродуоденальной зоны, определяется по содержанию и сочетанию в них удельной активности ферментов-протеиназ, амилазы и липазы.
Для определения содержания ферментов в исследуемых препаратах из них получали экстракты. Для этих целей их вначале тщательно очищали от кислотоустойчивой оболочки и измельчали в фарфоровой ступке до мелкой порошкообразной массы. Далее на аналитических весах определяли вес каждого препарата без оболочки, а для панинтестина брали навеску, равную средней массе исследуемых таблеток. Полученную порошко 39 образную массу растворяли в 10 мл дистиллированной воды и оставляли на 30 минут в рефрижераторе при температуре +4С для экстракции содержащихся в препаратах ферментов: трипсина, химотрипсина, других протеиназ, амилазы и липазы. После этого растворы центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин и фильтровали. Перед опытами данные экстракты подогревались в водяном термостате до 37С и в них производили определение фактической активности вышеперечисленных ферментов.
В некоторых препаратах энзимотерапии определено фактическое содержание трипсина, суммарных протеиназ, амилазы и липазы после их инкубации в течение 60 мин при 137С в растворе 0,1 н. соляной кислоты. Определение активности трипсина методом Н. Турру et al. (1962) Принцип метода основан на способности трипсина расщеплять синтетический бесцветный субстрат бензоиларгинин-р-нитроанилид (БАПНА) с образованием окрашенного р-нитроанилина. Техника определения. Навеску БАПНА растворяли в трис-буфере (рН 8,2). К раствору субстрата добавляли опытную пробу и измеряли оптическую плотность при X -400 нм, после чего пробу оставляли в водяном термостате при 35С на один час и вновь измеряли оптическую плотность. Прирост оптической плотности за один час инкубации пропорционален активности фермента. Активность трипсина выражали в ММОЛЬ-S/MHH. Определение суммарной протеолитической активности Панкреатические протеиназы суммарно определяли спектрофото-метрически по H.JL Ансону (1938) в модификации П.Г. Сторожука и В.Л. Криштопы (1969). Принцип метода основан на расщеплении гемоглобинового субстрата с освобождением свободных аминокислот. Приготовление гемоглобинового субстрата Гемоглобиновый субстрат готовили следующим образом: отвешивали на аналитических весах 2,2 г сухого гемоглобина, переносили в колбу на 100 мл, туда же добавляли 8 мл 1 н. едкого натра, 36 г мочевины ХЧ и 50 мл воды (щелочная среда создается для растворения гемоглобина). Через 30 минут добавляли 4 г мочевины, 10 мл 1 М раствора однозамещен-ного фосфата калия, и количество субстрата дистиллированной водой доводилось до метки. Субстрат можно хранить несколько дней в холодильнике (+4С).
Техника определения. К 1 мл прогретого до 35С раствора субстрата добавляли микропипеткой 0,1 мл панкреатического сока и инкубировали в водяной бане при 35С в течение 10 минут. Затем реакцию останавливали путем добавления 2 мл 0,3 М раствора трихлоруксусной кислоты и выдерживали при этой же температуре еще 30 минут. Смесь фильтровали и к 1 мл фильтрата добавляли 2 мл дистиллированной воды. Контроль ставили аналогичным образом, но вместо панкреатического сока к раствору субстрата добавляли 0,1 мл дистиллированной воды.
Пробы спектрофотометрировали на СФ-46 при длине волны А,-280 нм по отношению к контрольной пробе. О протеолитической активности судили по циклическим аминокислотам, освободившимся в результате реакции, в пересчете на тирозин. Протеолитическую активность выражали в ммоль-тирозин/минут. Для этих целей строился калибровочный график по растворам чистого тирозина (рис. 2.1).
Расчет общей активности протеиназ. Пользуясь калибровочным графиком, находили количество миллиэквивалентов тирозина в 1 мл спек-трофотометрируемой жидкости, затем рассчитывали по формуле количество миллимоль тирозина в минуту.
Определение протеолитической активности в препаратах ферментозаместительной терапии
Ферментные препараты, предназначенные для проведения заместительной терапии при заболеваниях органов гастропанкреатодуоденальной зоны, сопровождающихся сниженной секреторной функцией, отличаются друг от друга по количеству входящих компонентов, активности энзимов и способу производства. Биологическая ценность препаратов энзимотерапии, а также эффективность их действия определяется, главным образом, составом и высокой активностью ферментов (особенно трипсина и липазы), формирующих препарат.
Из таблицы 3.1 видно, что при описании препаратов приводится суммарная активность протеиназ, но ни в одной аннотации не указывается активность трипсина отдельно, хотя основанием для выбора ферментного препарата в качестве обезболивающего средства при хроническом панкреатите является высокая активность трипсина в таблетке. Трипсин, инактивируя холецистокинин-ЯГ-фактор, угнетает панкреатическую секрецию, и это сопровождается снижением внутрипротокового давления, уменьшается повреждающее действие собственных панкреатических ферментов на ткань поджелудочной железы и ведет к прекращению болей (Коротько Г.Ф., 1994, Brown A. et al., 1997).
Кроме того, в сигнатурных данных многих отечественных препаратов вместо единиц активности ферментов указываются только количество (в мг) панкреатина - основного вещества ферментного препарата. Однако следует подчеркнуть, что лечебный эффект заместительной терапии наблюдается лишь при назначении адекватной дозы того или иного фермента, содержащегося в препарате. В связи с этим представляет интерес установить, какова активность ферментов, входящих в состав наиболее широко распространенных препаратов энзимотерапии и провести сравнительный анализ между ними.
Для биохимического исследования активности ферментов включили 14 наиболее широко распространенных препаратов энзимотерапии: мезим форте, панкреатин (Акрихин), креон, панцитрат, панкреатин (Югославия), панкреатин (Биомед), дигестал, панзинорм, холензим, энзнстал, фестал, ликреаза, ипентал и вобэнзим.
В качестве препарата сравнения (эталона) взяли препарат панинте-стин, разработанный на кафедре биохимии Кубанской государственной медицинской академии (Сторожук П.Г, с соавт., 1987). Предлагаемый препарат панинтестин обладает высокой ферментативной активностью и оказывает выраженное стимулирующее влияние на внешнесекреторную функцию поджелудочной железы и секреторную функцию желудка (Пав-люченкоНИ., 1987).
Активность суммарных протеиназ, трипсина, химотрипсина, амилазы и липазы определяли в унифицированных единицах для всех препаратов. Для этого из препаратов энзимотерапии готовили экстракты. Способ получения таких растворов и необходимые условия при определении активности ферментов в данных препаратах подробно описаны в главе 2.
На протяжении работы с ферментными препаратами, их хранили в соответствие с инструкцией, при этом провели несколько серий опытов с некоторыми из них, имеющими разный состав и форму выпуска, для определения изменений активности ферментов во время их хранения (табл. 3.2).
Из таблицы видно, что во всех ферментных препаратах на период установленный производителем срока действия препарата при соблюдении условий хранения, протеолитическая и амилолитическая активности практически не изменяются (р 0,01) для всех препаратов.
В просроченных препаратах (1год после истечения срока годности, при соблюдении условий хранения данных лекарственных средств) происходит незначительное уменьшение указанных ферментов. Так, среди исследуемых препаратов статистически достоверное изменение (р 0,05) протеолитической активности ферментов наблюдается в панзинорме. СПА у него уменьшается на 17%, активность трипсина и химотрипсина падает на 11 - 14%. В остальных препаратах изменение протеолитической активности составляет 3 — 9% и не является статистически достоверным (р 0,05). Что же касается активности амилазы, то во всех исследуемых препаратах энзимотерапии после истечения их срока действия, указанных в аннотациях» она остается стабильна (р 0,01) .
Таким образом, в препаратах энзимотерапии активность ферментов, входящих в их состав, не изменяется на протяжении установленного производителем срока их хранения, и даже через год после истечения срока годности остаются практически в тех же пределах, если соблюдаются условия хранения этих лекарственных средств, в соответствие с их инструкцией.
Протеолитическая активность слизистой желудка, двенадцатиперстной кишки и поджелудочной железы крыс при парентеральном введении пептида В и препаратов ферментозаместительной терапии
Хронические заболевания органов гастропанкреатодуоденальной зоны, в частности, поджелудочной железы, часто сопровождаются снижением их внешнесекреторной функции, и как следствие этого — нарушаются процессы пищеварения в желудочно-кишечном тракте. Лечение таких заболеваний включает комплекс различных препаратов общего и местного действия. Важным звеном в этом лечении является применение как широко распространных препаратов заместительной ферментотерапии (панкреатин, фестал, энзистал), так и недавно поступивших на российский рынок новых лекарственных средств (креон, ликреаза, вобэнзим).
Успех коррегирующей ферментотерапии зависит от правильного подбора ферментного препарата с учетом патологии в каждом конкретном случае. Поэтому кафедра биологической химии уже несколько десятилетий занимается не только созданием препаратов ферментозаместительной терапии, но одновременно исследует их биологические свойства.
Так, Н.П. Пятницким с соавторами была разработана технология получения препаратов ферментозаместительной терапии в гастроэнтерологии. Среди них наибольшее распространение получили: «Пепсидил» (Пятницкий Н.П. Авт. св. СССР, № 200740, 1967) и «Сальпепсин» (Пятницкий Н.П. и Пятницкая И.Н. Авт. Свид. СССР, № 263808, 1967). Эти препараты прошли широкую апробацию в терапевтической и педиатрической клиниках.
Лечебное действие ферментных препаратов Н.П, Пятницким приписывалось исключительно пепсину - ферменту, восполняющему его недостаточность в собственном желудочном соке как взрослых больных так и детей,
В диссертации Т.Н. Хангалдовой, посвященной технологии создания новых отечественных препаратов пепсина и изучению их биологических свойств, установлены два новых, ранее неизвестных научных факта: а) препараты пепсина обладают свойством усиливать желудочную секрецию, вызванную пищевым раздражителем, и б) свойство стимуляции секреции обусловлено наличием в препаратах биологически активных пептидов с ММ 10000-12000 Да.
Затем П.Г. Сторожуком и М.М. Мкртычаном была разработана технология получения нового искусственного желудочного сока (НИЖС) (Авт. свид. СССР, № 908358, 1978), который в дальнейшем стали называть «Копепсидилом». Особенности физиологического действия копепсидила были изучены в экспериментах на собаках и крысах (Быков И.М., 1982). Установлено, что этот препарат обладает способностью увеличивать секрецию не только объема желудочного сока, но его основных компонентов - соляной кислоты и пепсина. Стимулирующие свойства препарата хорошо проявляются как у экспериментальных животных со здоровым изолированным желудочком по Павлову так и у животных с гастритом, созданным при помощи гистамина и алкоголя (Быков И.М., 1982).
В связи с обнаружением сокогонного эффекта, развивающегося под действием копепсидила, возникла необходимость выяснить, чем он обусловлен. Для этих целей методом колоночной гель-хромотаграфии с использованием в качестве молекулярных сит сефадексов различных марок (G-100 и G-25) выделили несколько белковых фракций. Совместно с институтом Биохимии им. акад. Палладина (г. Киев) были изучены аминокислотный состав и молекулярная масса этих пептидов. Из них наиболее биологически активными оказались три низкомолекулярные фракции (А -2800, В - 2500 и С - 2200 Да). В специальных экспериментах на крысах и собаках было показано, что все три полипептида обладают способностью усиливать продукцию ферментов желудка, поджелудочной железы и тонкой кишки как у собак так и у крыс (Быков И.М., 1982).
В дальнейшем сотрудниками кафедры (Павлюченко И.И., 1987; Колесников А.Н., 1987) установлен стимулирующий эффект пепсинсодер-жащих препаратов на железистый аппарат слизистой желудка при их действии со стороны полости этого органа. В контрольных опытах с введением хроматограф ически чистого пепсина, выдел енного из пепсидила, усиления желудочной секреции не наступало.
При изучении действия этих препаратов со стороны слизистой тонкой кишки, на этих же животных, имеющих одновременно изолированный желудочек и фистулу двенадцатиперстной кишки, было установлено, что копепсидил, пепсидил и натуральный желудочный сок, действуя со стороны слизистой двенадцатиперстной кишки, тормозят секрецию желудочного сока, соляной кислоты и пепсина. В контрольных опытах с введением в полость двенадцатиперстной кишки 0,1 н. раствора соляной кислоты (одного из компонентов изучаемых препаратов) подобной ответной реакции желудочных желез не получено.
Этими экспериментами было показано, что лечебный эффект препаратов ферментозаместительной терапии, содержащих пепсин, обусловлен не столько пепсином, компенсирующим недостаточность фермента, сколько действием полипептидов, содержащихся в исследуемых препаратах. Они-то и стимулируют или тормозят функционирование железистого аппарата желудка. Ответная реакция желудочных желез зависит от места приложения действия пептидов, их состава и концентрации.
Установленное на собаках действие препаратов ферментозаместительной терапии на секреторную деятельность желудка и экскреторную функцию поджелудочной железы было проверено на другом виде животных, а именно на крысах. В острых экспериментах показано, что внутри-дуоденальное введение препаратов пепсина во всех случаях статистически достоверно угнетает пепсинообразование в желудке и стимулирует фер-ментосинтетические процессы в поджелудочной железе и слизистой двенадцатиперстной кишки. У копепсидила был более выражен, чем у других препаратов, тормозящий эффект на железы желудка и стимулирующий эффект на экскреторный аппарат поджелудочной железы и тонкой кишки.
При внутрижелудочном введении исследуемых препаратов пепсина наблюдается увеличение активности фермента не только в слизистой двенадцатиперстной кишки и в поджелудочной железе, но и пепсина - в слизистой желудка.
Наряду с препаратами, содержащими пепсин, на кафедре биохимии КГМА стали изучаться физиологические и биохимические свойства полиферментных препаратов, применяемых при лечении заболеваний органов пищеварения, сопровождающихся с недостаточностью ферментовыдели-тельной функцией поджелудочной железы и тонкой кишки.
