Введение к работе
Актуальность проблемы.
Фуллерены - новая аллотропная форма углерода, обладающая уникальной геометрической структурой и необычными для углеродных веществ физическими, химическими и биологическими свойствами. В настоящее время углеродные наночастицы интенсивно применяются в различных областях промышленности и медицины. Рост объемов нанотехнологической продукции обуславливает значимость рассмотрения фуллеренов как фактора риска для здоровья живых организмов и состояния экосистем. Установлено, что углеродные наночастицы проникают через мембраны клеток, преодолевают гематоэнцефалический барьер, что потенциально может приводить к их накоплению в органах и тканях и влиянию на физиологические процессы. В связи с этим актуальна задача разработки высокоспецифичных, чувствительных и быстрых методов определения фуллеренов в биообъектах.
Перспективны для детекции фуллеренов иммунохимические методы, основанные на связывании анализируемых соединений с антителами и сочетающие экспрессность, высокую специфичность, низкий предел обнаружения. Из иммунохимических методов анализа в настоящее время наиболее широко применяется микропланшетный иммуноферментный анализ, что обусловлено развитой приборной базой, обеспечивающей высокую производительность анализа и автоматизацию его проведения. В литературе ранее не сообщалось о разработке иммуноаналитических систем, пригодных для определения фуллеренов и в растворах и в составе биопроб. Реализация таких систем требует получения специфических антител и детальной характеристики иммунного взаимодействия с фуллеренами, их производными и структурными аналогами в разных реакционных средах.
Цель и задачи работы.
Получение антител к фуллерену С6о, характеристика их антиген-связывающих свойств и изучение возможности применения анти-фуллереновых антител для детекции углеродных наночастиц в различных матриксах методом иммуноферментного анализа.
Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач: 1) синтез конъюгатов фуллерена С6о;
Используемые сокращения и обозначения: АС - антисыворотка, БСА - бычий сывороточный альбумин, ДМФА - диметилформамид, ИФА - иммуноферментный анализ, ППР - поверхностный плазмонный резонанс, ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия, СИТ - соевый ингибитор трипсина, ТГ - тиреоглобулин, ФБ - 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, ЭДФ - этилендиаминфлуоресцеинтио-карбонат, 2,4-D - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, 1Сю - предел обнаружения, Кд- равновесная константа ассоциации.
получение поли- и моноклональных антител к фуллерену С6о;
характеристика аффинности и специфичности полученных антител;
выбор среды, оптимальной для сольватации фуллеренов и проведения иммунного взаимодействия;
разработка иммуноферментного метода определения фуллерена С6о, его производных и структурно близких углеродных наночастиц;
апробация метода для определения фуллерена С6о в гомогенатах тканей животных.
Научная новизна работы.
Изучена специфичность взаимодействия анти-фуллереновых антител с водорастворимыми производными фуллерена С6о (конъюгатами фуллерен-белок, фуллеренолом, карбоксилированным фуллереном), а также с немоди-фицированными фуллеренами С6о, С7о и углеродными нанотрубками. Впервые разработан иммуноферментныи метод определения фуллерена в водно-органической среде и биологическом материале.
Практическая значимость работы.
Показана возможность иммунохимического определения углеродных наночастиц с пределом обнаружения для фуллерена С6о 0,4 нг/мл. Разработанные методы перспективны для использования в токсикологических исследованиях, в экологическом и санитарно-гигиеническом мониторинге, а также для технологического контроля на предприятиях наноиндустрии.
Связь работы с государственными программами.
Работа выполнена при поддержке Федеральных целевых программ «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2011 годы» и «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.
Апробация работы.
Основные результаты исследования представлены на Втором и Третьем Международных форумах по нанотехнологиям (2009, 2010), конференции «Горизонты нанобиотехнологии» (2009), Съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (2010), Шестом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2011).
Публикации.
По материалам диссертации опубликованы 2 статьи в журналах и 5 тезисов докладов.
Объем и структура работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (7 глав), выводов и списка использованной литературы (188 ссылок). Работа изложена на 110 страницах и включает 51 рисунок и 13 таблиц.
