Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 9
1.1 Исследование спонтанной микрофлоры винограда и вина 9
1.2 Современная технология производства натуральных сухих виноградных вин 20
1.3 Биохимические основы производства плодовых вин 25
2 Объекты и методы исследований 29
2.1 Характеристика объектов исследований 29
2.1.1 Природные климатические условия произрастания исследуемых культур 29
2.1.2 Объекты исследований 32
2.2 Методы исследования 33
2.2.1 Сусло и виноматериалы ...33
2.2.2 Микроорганизмы 34
Экспериментальная часть
3 Идентификация состава микроорганизмов плодов сырья республики адыгея и оценка ее физико-химических свойств 36
3.1 Идентификация состава микроорганизмов 36
3.2 Исследование морфологических и физиологических свойств выделенных культур микроорганизмов 42
3.2.1 Морфологические свойства микроорганизмов 42
3.2.2 Физиологические свойства микроорганизмов 46
3.3 Исследование химического состава виноматериалов 52
3.3.1 Органические кислоты 52
3.3.2 Химический состав и органолептические свойства сброженной среды 60
3.4 Исследование химического состава виноматер налов, полученных с применением исследуемых рас дрожжей 60
3.4.1 Определение основных компонентов химического состава виноматериалов 60
3.4.2 Влияние расы дрожжей на концентрацию аминокислот 63
3.4.3 Влияние аминокислот на образовании ароматических компонентов 66
3.5 Исследование ферментных систем экспериментальных
рас дрожжей А/3 и А/5 71
3.6 Исследование химического состава осадков 73
4 Исследование технологических показателей экспериментальных рас дрожжей 76
4.1 Исследование спиртоустойчивости 76
4.2 Изменение активности р-фру кто фуранози дазы 80
4.3 Исследование бродильных свойств 82
4.4 Исследование влияния консервантов на физиологическое состояние дрожжей 84
4.5 Исследование термостойкости дрожжей рас А/3 и А/5 90
4.6 Исследование устойчивости экспериментальных рас к высоким концентрациям органических кислот 93
4.7 Исследование агрегативной устойчивости экспериментальных рас дрожжей 96
4.8 Разработка способа производства разводок экспериментальных рас дрожжей 98
5 Совершенствование технологии виноградных и плодовых вин с применением экспериментальных рас дрожжей 104
5.1 Технология виноградных вин 104
5.2 Технология плодовых вин 107
Выводы 115
Список литературы 117
Приложения 130
- Исследование спонтанной микрофлоры винограда и вина
- Природные климатические условия произрастания исследуемых культур
- Исследование морфологических и физиологических свойств выделенных культур микроорганизмов
- Изменение активности р-фру кто фуранози дазы
Введение к работе
Производство вина - сложный биохимический процесс превращения химических компонентов плодов и ягод в виноградное или плодовое вино, обусловленный жизнедеятельностью микроорганизмов. При брожении виноградного сусла протекают разнообразные биохимические и микробиологические превращения, связанные с обменом веществ дрожжей и бактерий.
Важнейшими факторами, определяющими качество вина, являются сорта винограда, плодов и ягод, район их произрастания, а также состав и свойства микрофлоры сбраживаемого сусла. Известно, что виноградное сусло или плодовый сок перед брожением не стерилизуются, поэтому в протекании процесса брожения участвуют дрожжи, попадающие в сусло с плодов и ягод, а также с оборудования винодельческих заводов. При внесении в нестерильное сусло разводки определенной расы дрожжей нет уверенности в том, что брожение происходит на ней, а не на дрожжах сусла. До сих пор нет надежных быстрых способов, позволяющих отличить потомство внесенной расы от дрожжей сусла того же вида.
Классическая схема спонтанного брожения сусла, согласно которой дрожжи-апикулятусы начинают брожение, а эллиптические дрожжи его завершают, дополняется в последнее время новыми сведениями благодаря усовершенствованиям классификации дрожжей и подробному изучению дрожжевой флоры во многих винодельческих районах различных стран. В частности, доказано, что из самопроизвольно сбраживаемого виноградного сусла можно выделить дрожжи, принадлежащие к различным семействам, родам и видам, обеспечивающие получение высококачественных натуральных сухих виноматериалов.
Международная организация по виноградарству и виноделию (МОВВ) предложила в 1973 г. участникам девятой сессии группы «Микробиология вина» представить сведения о фактическом применении
5 чистых культур дрожжей в виноделии своей страны и сообщить о перспективах на будущее /17/. Материалы сессии МОВВ, полученные в 1990 г. /17/, показали, что в таких винодельческих странах, как Франция, Италия, Мексика, Португалия, Греция, Испания, нет регулярного применения чистых культур дрожжей при сбраживании виноградных сусел. Брожение сусла в большинстве случаев проходит на спонтанной микрофлоре, а некоторые из превосходных вин мира, в том числе получаемые во французской провинции Бордо, получают до сих пор путем спонтанного брожения.
Во всех странах мира и регионах, занимающихся виноградарством и виноделием, проводилась работа по выделению штаммов винных дрожжей из спонтанно бродящего виноградного сусла и изучению их свойств с целью отбора для использования в производстве местных рас дрожжей, наиболее приспособленных к условиям виноделия данного района. Оказалось возможным отобрать такие местные расы винных дрожжей, с применением которых были получены полностью выброженные, хорошо осветленные виноматериалы с гармоничным вкусом /16/. В тоже время особая приспособленность местных рас дрожжей к сбраживанию виноградного сусла именно данного района все еще доказана не достаточно.
Так, изучение Л.В, Тюриной свойств местных рас винных дрожжей, выделенных в винсовхозах Закарпатской области /121/ из дрожжевых осадков виноматерналов, сброженных без внесения чистых культур дрожжей, показало, что в данном районе отселекционировались дрожжи-сахаромицеты, обладающие высокой бродильной и спиртообразующей способностью, кислотовынос-ливостью и сульфитостойкостью, способные обеспечить полное сбраживание Сахаров в сусле, идущем на приготовление столовых вин и шампанских виноматериалов. Однако особых преимуществ применения местных рас дрожжей установить не удалось, так как одновременное сбраживание такого сусла на активной расе дрожжей Феодосия 1-19, выделенной в Крыму, обеспечивало получение виноматериалов такого же качества /121/.
В противоположность исследования И.В.Костина /64/ позволили выделить местную расу дрожжей в Ставропольском крае, обеспечивающую получение высококачественных коньячных виноматерналов.
В изучение спонтанной микрофлоры большой вклад внесли работы Ж.Риберо-Гайона, П.Сюдро, С.Лафон-Лафуркад, П.Шандерль, С.Домерк, Т.Кастелли, Л.В.Тюриной, Н.И.Бурьян, Б.П.Авакяна, Е.Н.Одинцова, Н.М.Трофименко и других ученых. Наиболее полные сведения о микрофлоре винограда Краснодарского края получены в результате исследований Н.М.Агеевой и Э.М.Соболева /17/. Микрофлора плодовых культур изучена значительно меньше. Наибольший вклад в ее изучение внесли Н.К.Могилянский, А.Л.Панасюк и др.
Работами вышеперечисленных ученых доказано, что состав и свойства спонтанной микрофлоры во многом определяются местом произрастания плодов и ягод. Так, предгорные районы Грузии или Армении существенно отличались по составу и свойствам микрофлоры от равнинных территорий.
Важным фактором для характеристики местных рас дрожжей является не только место их выделения, но и такие свойства, как бродильная способность, спирто- и сульфитовыносливость, спиртообразующая способность, холодо- и термостойкость.
В последнее десятилетие в Республике Адыгея значительно возрос выпуск виноградных и плодовых вин. При этом в технологии их производства применяются в основном дорогостоящие импортные активные сухие дрожжи. Между тем выгодное географическое положение республики, наличие предгорных и горных зон, обладающих своеобразной микрофлорой, диктует необходимость выделения и селекции собственных рас дрожжей, которые обеспечили бы возможность виноделию республики полностью использовать преимущества местности.
В связи с этим, особую актуальность и практическую значимость приобретают исследования, направленные на выделение и изучение новых рас
7 дрожжей из плодов и ягод предгорной зоны республики, обеспечивающих
получение высококачественных виноградных и плодовых вин.
Современные представления о местных расах дрожжей и технологии их применения, базируются на исследованиях итальянских и французских ученых, согласно которым местные расы активнее реагирует на изменение погод но-климатических факторов и приспосабливаются к изменению химического состава плодов и ягод значительно быстрее, чем чистые культуры дрожжей. В связи с этим рациональным приемом технологии виноделия является выбор и селекционирование таких рас дрожжей, которые бы активно реагировали на изменение химического состава плодов и ягод под влиянием внешних факторов.
Работа выполнялась в соответствии с планом НИС Госкомитета по науке Министерства образования №01200309344 по тематике: «Региональный потребительский рынок: качество, мониторинг, сертификация товаров и услуг».
Цель настоящей работы заключается в биохимической характеристике спонтанной микрофлоры, выделении и селекции местных рас и обосновании их применения в технологии виноградных и плодово-ягодных вин республики Адыгея.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:
- исследовать качественный состав микрофлоры плодов и ягод,
произрастающих в предгорных зонах Республики Адыгея;
выделить дрожжи, обеспечивающие получение высококачественных виноградных и плодово-ягодных вин;
исследовать морфологические и физиологические свойства выделенных рас дрожжей;
установить активность основных ферментных систем выделенных рас дрожжей;
оценить технологические свойства;
изучить влияние новых рас дрожжей на химический состав виноградных и плодовых вин;
8 - разработать технологию виноградных и плодовых вин с применением выделенных рас дрожжей.
Научная новизна работы. На основании впервые проведенных ^ исследований состава спонтанной микрофлоры плодов и ягод предгорной зоны Республики Адыгея выделены и селекционированы расы А/3 и А/5, относящиеся к семейству Saccharomycetaceae, род Saccharomyces . Установлена их высокая бродильная активность, сульфито-. термо и спиртоустойчивость. Научно обоснована технология производства виноградных и плодовых вин с применением рас А/3 и А/5 соответственно.
На основании исследования физиологических и флокулирующих свойств
рас А/3 и А/5 теоретически обоснован и разработан состав субстрата жидкости
f для культивирования дрожжей. Подана заявка на изобретение.
Практическое значение. Селекционированы новые расы чистой культуры дрожжей, переданные для хранения в музейную коллекцию Майкопского государственного технологического университета. Разработан состав субстрата для выращивания дрожжевых клеток и накопления их биомассы.. Разработана технология натуральных сухих виноградных (Лесная нимфа) и плодовых (Предгорное) вин с применением местных рас дрожжей. Проведено производственное испытание и внедрение технологии на винзаводе ЗАО ^ «Санэ», Республика Адыгея, г.Майкоп.
'/'
Исследование спонтанной микрофлоры винограда и вина
Многовековая история виноделия свидетельствует о том, что качество и химический состав вин обусловливается биохимическими процессами, протекающими при спиртовом брожении.
Сбраживание Сахаров виноградного сусла может протекать на спонтанной микрофлоре или специально селекционированных дрожжах. Однако применение чистых культур в виноделии до сих пор не стало повсеместным и обязательным, поскольку нет надежного способа контроля, проходит ли брожение на популяции клеток дрожжей внесенной расы или на спонтанной микрофлоре /50, 100/.
Главная проблема при использовании чистых культур дрожжей в виноделии - это вытеснение вносимого инокулята дрожжей в ходе брожения спонтанной микрофлорой виноградного сусла, в результате чего весь процесс брожения осуществляется ею же. Несколько улучшило положение применение сернистого ангидрида: обработка им виноградного сусла позволила резко снизить количество посторонних микроорганизмов и дать возможность вносимым отселекционированным дрожжам с желательными свойствами завоевать весь субстрат. Однако на практике поддерживать дрожжевую разводку селекционного штамма приходится путем добавлений в нее свежего нестерилизованного сусла. В результате этого местная дрожжевая флора начинает активно расти и преобладать над популяцией производственной чистой культуры /50/.
Большую часть спонтанной микрофлоры составляют мицелиальные грибы (76—90%), дрожжи (9—22%) и значительно меньшую -— неспоровые и споровые бактерии, актиномицеты и микобактерии /16Д 00/.
Высокая кислотность виноградного сока (рН 2,7—3,8) создает неблагоприятные условия для жизнедеятельности большинства групп микроорганизмов, поэтому в сусле они обычно не размножаются. Наиболее кислотовыносливыми являются дрожжи и мицелиальные грибы. Дрожжи, обладая способностью быстрее размножаться во всей массе жидкости, накопив определенную биомассу, вызывают забраживание сусла. Обедненное кислородом сусло и накопленный спирт неблагоприятны для развития мицелиальных грибов, поэтому создаются элективные условия для жизнедеятельности дрожжей /16,100/.
Среди дрожжей различных семейств, родов и видов существуют сложные конкурентные взаимоотношения, и в связи с этим наблюдается изменение состава дрожжевой флоры в процессе спонтанного брожения виноградного сусла /56/. В анаэробных условиях прекращается размножение пленчатых дрожжей. Слабобродящие дрожжи постепенно уступают место дрожжам с более высокой спиртообразующей способностью. С повышением концентрации спирта значительное количество конкурентов гибнет, и к концу брожения жизнедеятельными остаются только спиртовыносливые виды дрожжей. Однако продукты обмена всех дрожжей, участвовавших в брожении сусла, оказывают влияние на качество вина /56/.
До недавнего времени считалось /16,100/, что в процессе спонтанного спиртового брожения виноградного сусла в начале брожения преобладают апикулятусы, составляющие 90—95% всей микрофлоры. После накопления в бродящем сусле 2—4% объемной доли спирта состав дрожжевой флоры меняется. Винные дрожжи — сахаромицеты продолжают размножаться, а апикулятусы прекращают свою жизнедеятельность и постепенно отмирают. Основное брожение и дображивание проходит на дрожжах-сахаромицетах.
Установлено /16, 100/, что смена видов обусловлена не только различной способностью дрожжей накапливать спирт и переносить его различные концентрации, но и температурой брожения. При низкой температуре увеличивается устойчивость несахаромицетов к спирту, и показательным для выживания явился факт необязательного совпадения максимума спиртообразующей способности дрожжей с максимумом его концентрации в сбраживаемой среде.
В Италии под руководством Т. Кастелли /116/ изучена дрожжевая флора виноградников южных и северных районов страны, расположенных у моря и на высоте 700 м. Обследовано более 600 виноградарских местностей Италии, Сардинии и Сицилии. Было исследовано 500 проб различных соков и выделено около 6000 штаммов дрожжей. Показано, что в пробах бродящего сусла из винограда различных местностей Италии наряду с Kloeckera apiculata и Saccharomyces ellipsoideus находятся дрожжи других родов и видов в различных количественных соотношениях /116/.
Многие виды дрожжей, такие, как Saccharomyces rosei, Saccharomyces Bayanus, Saccharomyces uvarum, Kloeckera magna, настолько часто встречаются, что нельзя отрицать их участие в процессе спонтанного брожения /117/.
Сравнение результатов изучения дрожжевой флоры северных и южных районов Италии показало, что чем жарче климат, тем более распространены спорогенные формы, более устойчивые к колебаниям температуры и влажности воздуха. Климат оказывает влияние на качественный состав микрофлоры и на распространение определенных видов дрожжей. Кроме того, в южных районах происходит селекция дрожжей разных видов с более высоким содержанием сахара в сусле. Труды итальянских исследователей расширили наше представление о составе дрожжевой флоры спонтанно бродящего виноградного сусла/117/.
Природные климатические условия произрастания исследуемых культур
Для лучшего извлечения сока из мезги плодов и ягод предусматривается применение различных биохимических методов, в частности использование ферментных препаратов, которые вводятся после сульфитации в виде суспензий /80/. Плодовые и ягодные соки как правило содержат больше пектина, чем виноградное сусло, и осветляются крайне плохо. Для проведения качественных технологических обработок отстаивание совмещают с внесением осветляющих веществ. Для лучшей флокуляции частиц бентонита и ускорения осаждения рекомендовались флокулянты, например, полиэтиленолксид, полиакриламид /7, 22/. Практикуется обработка соков желатином в сочетании с танином, или кизельзолем, или производными диоксида кремния /7, 22/.
Для получения наилучших результатов по осветлению плодовых и ягодных соков были рекомендованы ферментные препараты (пектоваморин ШОх и ПОк, пектофоетидин ШОх), обладающие высокой пектиназной и полигалактуроновой активностью /79/. Обычно для повышения эффективности обработку ферментных препаратов совмещают с незначительным (до 40-45С) нагреванием. В результате такой обработки клетки кожицы погибают, происходит их плазмолиз, нарушается структура стенок клетки. Вследствие этого обеспечивается достаточно быстрая диффузия антоцианов, дубильных веществ из кожицы в сусло.
В последние годы промышленностью западных стран разработаны и широко внедрены в производство ферментные препараты нового поколения, обладающие комплексной активностью полигалактуроназной, пектиназной, ксиланазной, протеолитической, амилотической и цитолитической 111. Наиболее распространены препараты фирм «Новозаймс» и «Ербсле Гайзенхайм» (Германия), «Реш» (Дания) а также фирм Франции и др. После ферментации повышается выход сусла и содержание в нем ароматических веществ, улучшается стабильность вин. Наибольший мацерационный эффект растительных клеток достигается за счет применения мультэнзимных препаратов, включающих ферменты гидролитического, пектолитического, целлюлолитического действия /71.
Сбраживание плодово-ягодных соков проводится на чистых культурах дрожжей Saccharomyces vini, Saccharomyces oviform is, приспособленных к обитанию в средах со значительной кислотностью и спиртуозностью. Оптимальная температура брожения плодовых соков -22-2 8С /80/. Раса дрожжей оказывает большое влияние на качество и органолептические свойства плодовых вин. Известно /81/, что винные дрожжи, предназначенные для сбраживания виноградного сусла, не позволяют получить плодовые вина высокого качества. Поэтому для переработки плодов и ягод следует использовать специально селекционированные штаммы, приспособленные к специфическим условиям - высокой концентрации пектиновых и фенольных веществ, низкой сахаристости, высокой кислотности. Для этой цели предложены расы Сидровая, Вишневая и др. /80Л Однако в последние 15-20 лет работы по селекции рас дрожжей для плодового виноделия практически не проводятся.
На предприятиях плодового виноделия широко внедрен способ сбраживания соков в аппаратах с насадкой в условиях сверхвысокой концентрации дрожжей /81/. Использование этого метода позволяет интенсифицировать процесс сбраживания плодово-ягодных сусел, предотвратить биологическое снижение кислотности, значительно сократить технологические потери виноматериалов и повысить их качество, благодаря улучшению контакта сбраживаемого сусла с большим количеством дрожжевых клеток, находящихся в различном физиологическом состоянии /81/.
Главной опасностью при сбраживании яблочного сока, особенно на спонтанной микрофлоре, является кислотопонижение, которое может наступить в начальной стадии брожения, если сброженный сок долгое время держали на дрожжах /80/. Основной причиной кислотопонижения в плодово-ягодном виноделии считается жизнедеятельность дрожжей Shizosacchoromyces acidodeboratus, которые одновременно со сбраживанием сахара способны вызывать разрушения яблочной кислоты до СО2 и НгО. Понижение кислотности наблюдается в момент бурного брожения, и может длиться в течение продолжительного периода. Если в виноградном виноделии яблочно-молочное брожение приводящее к кислотопонижению, в ряде случаев явление желательное, то при спиртовом брожении яблочного и некоторых других плодовых соков, в которых основную долю кислот составляет яблочная, кислотопонижение может привести к порче продукта.
Однако по-прежнему в производстве сброженно-спиртованных соков широко используют спонтанную микрофлору, так как плоды, как правило, поступают на техническую переработку поврежденными и содержат большое количество микроорганизмов, в том числе дрожжей. Между тем, далеко ни каждое предприятие имеет соответствующее технологическое оборудование, обеспечивающее полную инактивацию микрофлоры.
Исследование морфологических и физиологических свойств выделенных культур микроорганизмов
Клетки культуры расы А/3 на виноградном соке после 3 дней брожения при 25С имели эллиптическую форму размером (5 - 9) х (4 - 8) мкм. Они расположены отдельно или парами, почки на некоторое время остаются связанными с материнской клеткой (рис. 3.1). Бродящая жидкость мутная и покрыта тонкой пеной. Характер осадка варьирует от рыхлого до плотного в зависимости от стадии развития дрожжей. На более взрослой культуре никогда не заметна пленка, но на стекле пробирки может остаться кольцо, образованное дрожжами, поднятыми пеной во время бурного брожения.
На твердой питательной среде (рис. 3.2) колонии расы А/3 матовые, зернистые, изрезанные. Спорообразование протекает легко с образованием асков преимущественно с 2-мя, реже - с 4-мя овальными спорами.
Клетки культуры расы А/5 на виноградном соке (рис.3.3) были округлыми, единичные клетки имели эллиптическую форму.
На твердой среде колонии расы А/5 белые или с серым оттенком, влажные, более или менее гладкие или зернистые, часто выпуклые, складчатые, мало /, изрезанные (рис.3.4), Спорообразование идет легко, и через месяц наблюдаются аски с 2 - 4 спорами, круглыми или слегка овальными. Слияние перед образованием асков наблюдается редко. Гигантские колонии имеют различный вид в зависимости от штамма (рис. 3.5 и 3.6).
Известно, что наиболее характерным признаком, используемым при классификации дрожжей, является сбраживание растворов различных Сахаров. Такая способность клеток зависит от присутствия в них различных ферментов, свойственных только данному конкретному виду клеток. Большинство видов винных дрожжей сбраживают глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, галактозу, раффинозу используют частично, а лактозу, мелибиозу, пектозы, декстрины, крахмал совсем не сбраживают из-за отсутствия фермента.
Согласно /50/ по интенсивности использования глюкозы или фруктозы (к моменту, когда сброжено около 50% фруктозы) дрожжи делятся на 3 группы:
1) глюкозофильные дрожжи, наиболее многочисленные - сбраживают к этому моменту от 80 — 85% глюкозы (в этой группе встречаются большинство видов рода Saccharomyces, а так же виды родов Saccharomycodes и Brettanomyces).
2) фруктозофильные дрожжи - в этот период используют от 5% до 10% глюкозы (Saccharomyces bailli, Saccharomyces. rauxii, Torula stellata).
3) дрожжи, использующие оба сахара почти с одинаковой скоростью: к моменту, когда утилизируют половину фруктозы исчезают 40 - 60% глюкозы (Pichia, Saccharomyces rosei).
Проведенные эксперименты и обработка полученных данных (табл. 3.3) показали, что выделенные штаммы дрожжей относятся к глюкозофильным дрожжам рода Saccharomyces, сбраживающих наиболее значительную долю сахара в виноградных соках. Именно эти дрожжи заканчивают брожение, и многие из них участвуют в образовании аромата молодых вин. Такие сахара, как лактоза, арабиноза и раффиноза практически не сброжены и остаются в среде практически в исходной концентрации.
Аналогичные результаты получены при исследовании расы А/5.
Таким образом, полученные данные позволяют считать, что исследуемые расы дрожжей А/3 и А/5 являются глюкозофильными и способны сбродить большую часть Сахаров виноградных и плодовых сусел.
Важнейшими характеристиками физиологических свойств микроорганизмов являются бродильная и дыхательная активности.
Для изучения бродильной активности был проведен следующий эксперимент. Использовали стерильную среду - виноградное сусло — с концентрацией Сахаров 135 и 200 г/дм . Микроорганизмы (все шесть вариантов по п. 2.2.1) вносили в одинаковом количестве. Контрольный штамм - раса активных сухих дрожжей Каберне-Мерло По окончании брожения в полученном виноматериале определяли концентрацию несброженных Сахаров, объемную долю этилового спирта, полученного в результате естественного наброда, и органолептические свойства сбродившей жидкости.
Исследования динамики брожения (табл. 3.4) показали, что в серии опытов с сахаристостью 135 г/дм наилучшими образцами являются контроль, 1 и 2. Наибольшее количество несброженных Сахаров осталось в образце 6. Средние результаты по скорости сбраживания Сахаров показали образцы 3, 4 и 5.
Наибольшая объемная доля этилового спирта естественного наброда была характерна для контроля и образцов 1 и 2, далее следовали варианты 3, 4 и 5. Наименьшее значение этого показателя наблюдалось для образцов 1 и 2.
Установлено (табл. 3.5), что в образце 3 наблюдался яркий винный аромат с цветочными тонами и медовым оттенком, вкус чистый полный без посторонних привкусов.
В образцах 5 и 6 прослеживался сухофруктовый и легкий травянистый оттенок. Цвет у этих образцов соломенный.
В образцах 1 и 2 винные тона были выражены слабо, наблюдалась сильная опалесценция. В образце 2 развился мышиный тон.
Образец 4 характеризовался темным цветом, сильной опалесценцией, наличием тона уксусноэтилового эфира, хотя объемная доля этилового спирта в этом образце достаточно высока.
Изменение активности р-фру кто фуранози дазы
Одной из важнейших характеристик производственных рас дрожжей является их устойчивость при спиртовом брожении к возрастающим концентрациям этилового спирта. Согласно современным представлениям /84, 85/, винные дрожжи способны развиваться и быть физиологически активными до объемной доли этилового спирта в среде 14% об., а жизнеспособность сохраняют даже при 17-18% об. этилового спирта. В связи с этим одной из задач исследования была оценка спиртоустойчивости выделенной расы дрожжей А/5.
Для оценки спиртоустойчивости были проведены опыты, сущность которых заключалась в следующем: в пастеризованное виноградное сусло вносили этиловый спирт до его концентрации в образцах 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14% об. Контролем служило виноградное сусло без этанола с массовой концентрацией Сахаров 168 г/дм3. В подготовленные образцы вносили дрожжи расы А/5 в количестве 2% .
Проведенные эксперименты показали (табл. 4.1, рис.4.1), что при исходном содержании спирта до 4% динамика сбраживания Сахаров не изменилась: брожение протекало равномерно с накоплением одинаковых количеств спирта естественного наброда. Повышение спирта в исходной среде до 6-8%, приводило к замедлению процесса забраживания и снижению интенсивности брожения, в том числе бурного. В результате на 5-6-е сутки исследования, содержание остаточных Сахаров в вариантах 4 и -5 было значительно выше, чем контроле и вариантах 2 и 4. Закономерным является снижение естественного наброда (табл.4.2), что объясняется ингибирующим действием этилового спирта и постоянно увеличивающейся его концентрации при брожении.
Оценка спиртоустойчивости исследуемой расы дрожжей А/5 и полученные данные показаны в таблице 4.2. При исходной концентрации 10% об. забраживание сусла началось на 2-ые сутки, при концентрации спирта 12% об. - на 3-й сутки. При исходной концентрации спирта 14% об. первые признаки забраживания обнаружены лишь на 4-е сутки. В вариантах с исходной концентрацией этилового спирта 16% об. забраживание сусла не наблюдалось в течение 7 суток наблюдений. Ингибирующее действие этанола на жизнеспособность клетки связывают с его влиянием на дрожжевую оболочку. Известны дрожжи /80,86/ оболочка которых устроена таким образом, что ее поры пропускают спирт внутрь клетки, тем самым ингибируются процессы метаболизма на ранних этапах брожения (забраживания). Оболочки других рас дрожжей способны полностью или частично препятствовать проникновению этанола внутрь клетки, такие дрожжи являются спиртоустойчивыми, или обладают повышенной устойчивостью к действиям этанола. Полученные результаты позволяют считать, что поры клеток расы А/5 пропускают этанол, тем самым снижая устойчивость.
Данные по накоплению спирта естественного наброда показали, что при малых концентрациях внесенного спирта в исходной среде (2-4%) накопление этанола естественного наброда было идентично контрольному образцу. Увеличение объемной доли этанола до 6% и выше приводило к снижению концентрации спирта естественного наброда вследствие ингибирования винных дрожжей и их гидролитических ферментов.
Оценка физиологического состояния клеток дрожжей показала, что при повышении концентрации спирта до 8%об. оболочка сохраняла обычную структуру. Увеличение же объемной доли этанола приводило к деформации оболочки. Кроме того, в клетках наблюдалось использование запасных веществ, что является ее реакцией на неблагоприятные условия среды.
На основании проведенных экспериментов можно заключить, что спиртоустойчивость выделенной расы аналогична спиртоустойчивым расам винных дрожжей и составляет 14% об.
Изменение активности Р-фруктофуранозидазы
Результаты предыдущего раздела свидетельствуют о снижении актив ,. V ности дрожжевых клеток под действием этилового спирта. Одним из важней ших ферментов, катализирующих процессы превращения Сахаров (инверсия сахарозы до глюкозы и фруктозы) при брожении, является Р-фруктофура-нозидаза (БФФ), находящаяся в наружном слое клеточной стенки. Как показано в предыдущем разделе, дрожжевые клетки активно реагируют на возрастание количества этилового спирта. В связи с этим представляет интерес установление закономерности изменения активности БФФ при возрастании концентрации этанола в среде.
Проведенные ранее эксперименты позволили предположить возможное снижение активности БФФ при увеличении концентрации этанола в исходном виноградном сусле. Для подтверждения этого явления при проведении предыдущего опыта (разд. 4.1) в ходе брожения определили активность р-фруктофуранозидазы (табл. 4.3).
