Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Костная ткань и современные возможности возмещения дефектов с использованием имплантации (обзор литературы)
1.1. Строение и функциональные особенности костной системы
1.2. Имплантационные материалы
Глава II. Материалы и методы исследования
2.1. Экспериментальные материалы и объекты исследования
2.2. Методы исследования
Глава III. Способы получения и состав разработанных имплантационных материалов
3.1. Технологии получения композиционных имплантационных материалов на основе кальций фосфатных соединений
3.2. Состав разработанных кальцийфосфатных соединений
Глава IV. Результаты апробации разработанных имплантационных материалов
4.1. Замещение костных дефектов при использовании имплантационных материалов
4.2. Морфологические исследования
4.3. Биохимические исследования сыворотки крови экспериментальных животных
4.4. Гематологические исследования крови экспериментальных животных
Заключение
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы
- Строение и функциональные особенности костной системы
- Экспериментальные материалы и объекты исследования
- Технологии получения композиционных имплантационных материалов на основе кальций фосфатных соединений
- Замещение костных дефектов при использовании имплантационных материалов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди проблем здравоохранения одной из актуальных является проблема восстановления и замены поврежденных минерализованных тканей. В хирургической практике необходимость замещения костных дефектов и полостей возникает при лечении целого ряда заболеваний, связанных с патологией костной ткани. Сюда можно отнести переломы, замедленную консолидацию, опухоли, ложные суставы, инфекционные и постинфекционные изменения. Восстановление подобных дефектов представляют собой существенную медицинскую, социальную и немалую экономическую проблему.
В новом тысячелетии увеличение продолжительности жизни должно стать характерной чертой современного общества. В связи с этим возникает необходимость в решении ряда медико-материаловедческих проблем, в частности, создания материалов для искусственных органов и тканей. В настоящее время рынок биоматериалов оценивается суммой ~3 млрд. $, прогнозируемый годовой прирост составляет 10%, а объемы требуемых материалов оцениваются на уровне десятков тонн (Hench L., 1991, 1998; Suchanek W., 1998; Вересов А.Г., 2000).
Создание материалов для замены поврежденной костной ткани -перспективная, бурно развивающаяся область исследований. Использование для возмещения костных дефектов ауто-, а затем аллотрансплататов стало этапным событием в ортопедии и травматологии. Появилась возможность осуществлять различные варианты костнопластических и сберегательных операций. Однако целый ряд существенных недостатков этого направления, а именно: проблемы совместимости, сложность заготовки и хранения аллокости, нагноения, переломы и рассасывание крупных трансплантатов, необходимость длительной иммобилизации и т.д., создали предпосылки к параллельному поиску искусственных материалов, максимально отвечающих высоким требованиям пластической хирургии. Были предложены многочисленные
5 материалы, полученные с использованием полимеров, металлов, стекла и т.д. (Thomsen Р., 1997; IkedaN., 1999).
Одна из проблем, которые необходимо решить в настоящее время, состоит в том, что сроки лечения больных с дефектами костной ткани достаточно велики и существует необходимость в их сокращении. Известно, что патологические изменения в костной ткани часто требуют для их ликвидации заполнения дефекта кости веществом, которое способно стимулировать репаративные процессы (Bruijn J.D., 1993; Li Y., 1994). Усилия исследователей направлены на решение актуального вопроса - выбора такого пластического материала, который по прочностным характеристикам и составу максимально приближался бы к костной ткани, которая представляет собой композиционный материал на основе ультрадисперсного карбонатсодержащего гидроксиапатита (ГА) и белка коллагена с многоуровневой структурной организацией компонентов (Mehlisch D. R., 1987, 1988; Островский А. В., 1999).
В настоящее время не существует идеального материала, полностью совместимого с организмом, соответствующего всем анатомо-физиологическим и биомеханическим свойствам костной ткани. До сих пор остается нерешенной проблема выбора того или иного имплантата при лечении заболеваний костно-мышечной системы. Стратегия и тактика решения технологических и биомедицинских вопросов в каждом конкретном случае представляет собой сложную интеллектуальную задачу. Очевидно, что для возмещения дефектов костей наилучшим образом подойдет материал, свойства которого наиболее близки к свойствам костной ткани, т.е. химический состав и кристаллическое строение материала должны быть схожими с составом и строением кости (Elliot J. С, 1994; Щепеткин И. А., 1995). В современной медицине при операциях по восстановлению целостности поврежденной кости находят широкое применение материалы на основе фосфатов кальция в силу сходства их химического состава с составом костной ткани - это так называемые биологически активные кальцийфосфатные материалы (КФМ) на основе
6 гидроксиапатита и трикальцийфосфата (Lri Y., 1993; Klein С. et aL, 1994; Леонтьев В. К., 1996; Yang Z. et al., 1996).
Кальцийфосфатные материалы имеют хорошие биосовместимые свойства по тестам проверки биоматериалов на токсичность, гиперчувствительность и канцерогенность. В значительной степени это обусловлено тем, что элементный состав КФМ является естественным для организма (Щепеткин И. А., 1995). Совокупность свойств делает КФМ перспективным классом материалов для использования в травматологии и ортопедии, реконструктивной хирургии и стоматологии (Bruijn J. D., 1993; Li Y., 1994).
В медицинской практике наиболее широко используются крупнокристаллические керамические материалы на основе кальцийфосфатных соединений в форме плотных и пористых блоков и гранул. Для применения в качестве имплантата керамика привлекательна в силу своей химической инертности и высокой прочности (Kim H.D., 1998; Шимон В. М., 2000; Головченко В.В., 2001). Однако эти достоинства керамических имплантатов в определенный момент становятся негативными свойствами этих материалов. Так, новообразующаяся костная ткань не может врасти в имплантат в силу устойчивости керамики в плане своей структуры, и, как результат, место контакта кости и материала заполняется волокнистой соединительной тканью, которая механически охватывает инородное тело. Очевидно, что такой контакт не будет прочным. Керамическим материалам, кроме того, свойственна повышенная хрупкость, т.е. эти материалы не в состоянии выдерживать заметные нагрузки и деформации без разрушения. Таким образом, и зона контакта керамика-кость, и сам керамический имплантат являются предметами пристального наблюдения специалистов во избежание патологических переломов и других видов травмы.
Успех костно-пластической операции во многом определяется качеством используемых для пластики материалов. Особое значение при этом уделяется ксеноимплантатам - материалам, полученным из биологических тканей, или биоматериалам. Биоматериалы должны соответствовать специальным
7 требованиям в зависимости от их применения. Одно требование, однако, является критическим для всех биоматериалов — они должны быть совместимы с физиологическим окружением, то есть не вызывать воспалительных, аллергических реакций и не отторгаться организмом (Fernandez Е., 1999; Puleo D. А., 1999; Kokubo Т., 2003).
Одним из примеров использования биоматериалов, в частности, является применение деминерализованного костного матрикса (ДКМ) для костной пластики (Болтрукевич С. И., 1993; Верзен Р., 1993; Кулик В. И., 1993; Савельев В. И., 1993). Как один из видов биологических тканей, он имеет ряд положительных свойств, которые повышаются за счет воздействия на него деминерализующими растворами, консервантами, лекарственными препаратами. Однако ДКМ, как имплантационный материал, не может привнести с собой все вещества, необходимые для скорейшего возмещения костного дефекта.
В качестве ксеноимплантата используют также естественный гидроксиапатит - неорганический костный матрикс, полученный из животного материала. Для использования в клинике предлагаются коммерчески выпускаемые ксеноимплантаты - материалы, полученные в результате обработки костей крупного рогатого скота ("Endobon" (Германия), "Bio-Oss" (Швейцария), "OsteoGraf N" (США)) и выпускаемые в виде гранул и губчатых блоков разных размеров. Эти материалы применяются в хирургической стоматологии и дентальной имплантации, а также предлагаются для использования в травматологии и ортопедии для замещения дефектов длинных костей и в хирургии позвоночника (Островский А. В., 1999).
В клинической практике также используются композиционные материалы на основе ГА и бычьего коллагена первого типа как в России («Колаост», «Гапкол», «Колапол») (Абоянц Р. К., 1999), так и за рубежом ("Biostite", "Collagraft") (Katthagen В. D., 1986; Mehlisch D. R., 1987, 1988; Chapman M. W., 1997). В качестве недостатков этих материалов отмечается возникающая в некоторых случаях аллергическая реакция (Muschler G. F., 1996; Белозёров М. Н. и др. 1998; Абоянц Р. К., 1999).
Современное развитие оперативной техники обусловливает создание материалов, обладающих высокой остеогенной потенцией, способностью к биодеградации и замещению новообразованной костной тканью. В создаваемых остеоиндуктивных материалах должны быть заложены такие свойства как биосовместимость, простота получения и, как следствие, постоянная доступность, а также удобная для клинического применения форма, что позволяло бы хирургу заполнять зоны дефектов различной конфигурации.
Исходя из вышеизложенного, были определены цель и задачи исследования.
Цель исследования. Разработать способы получения биосовместимых имплантационных биологически активных материалов, композиционный состав которых соответствует составу внеклеточного матрикса костной ткани, и обладающих остеокондуктивными и остеоиндуктивными свойствами.
Для достижения сформулированной цели были поставлены следующие задачи.
Задачи исследования:
Получить из костной ткани сельскохозяйственных животных минеральные составляющие имплантационных биокомпозитов, варьируя приемы выделения и очистки минеральной фазы костной ткани.
Сравнить состав и физико-химические свойства полученных из костной ткани кальций фосфатных соединений в зависимости от способа их выделения и очистки.
Изучить влияние комплекса сывороточных неколлагеновых белков, введенного в состав имплантационных биокомпозитов и обладающего стимулирующими свойствами в отношении остеогенеза, на течение репаративных процессов при возмещении костных дефектов.
Исследовать репаративные процессы при возмещении дефектов костной ткани с использованием в качестве имплантационных материалов
9 биокомпозитов, имеющих в своем составе компоненты органического костного матрикса. 5. Определить реакцию организма экспериментальных животных на имплантацию разработанных биокомпозиционных материалов.
Положения, выносимые на защиту:
Качественный состав и структура кальцийфосфатных соединений, выделенных из костной ткани сельскохозяйственных животных, зависит от концентрации соляной кислоты, применяемой для деминерализации костной ткани, качественного состава реагента, используемого для осаждения минеральной фазы, и дополнительной обработки полученного вещества раствором карбамида.
Наиболее благоприятно сказывается на течении репаративных процессов в месте смоделированного костного дефекта имплантация биокомпозиционных материалов на основе кальцийфосфатных соединений, полученных из костной ткани по наиболее щадящей для их выделения технологии, и имеющих в своем составе органические компоненты в виде сывороточных белков и органического костного матрикса.
Применение биокомпозиционных имплантационных материалов для возмещения костных дефектов на основе кальцийфосфатных соединений, выделенных из костной ткани, не оказывает значимого влияния на систему гомеостаза и гематологические показатели экспериментальных животных.
Научная новизна работы. Впервые дано обоснование способов получения имплантационных биокомпозиционных материалов на основе кальцийфосфатных соединений, выделенных из костной ткани сельскохозяйственных животных, и имеющих в своем составе остеоиндуцирующие компоненты. Изучено влияние состава разработанных материалов на течение репаративных процессов в условиях их имплантации в костные дефекты и функциональное состояние организма экспериментальных животных.
Практическая значимость работы. Впервые показано, что при использовании для выделения кальцийфосфатных соединений из костной ткани сельскохозяйственных животных концентрированных растворов соляной кислоты и раствора карбамида для очистки полученного вещества от костных белков происходит потеря таких остеотропных элементов как сера, магний и фосфор.
Установлено, что оптимальными по составу и свойствам биосовместимости, биодеградации и остеокондукции являются имплантационные материалы, представляющие собой биокомпозиты, в состав которых входит минеральная составляющая, полученная из костной ткани сельскохозяйственных животных с использованием наиболее щадящей технологии для ее выделения, а также органические компоненты в виде органического матрикса костной ткани и сывороточных белков, выделенных из крови животных с активным остеогенезом.
Показано, что введение в состав биокомпозитов органического матрикса, выделенного из костной ткани крупного рогатого скота, приводит к более выраженной воспалительной реакции организма экспериментальных животных на оперативное вмешательство по поводу имплантации кальцийфосфатных соединений по сравнению с группами, в которых в состав биокомпозитов входили лишь минеральная составляющая и сывороточные белки.
Внедрение результатов исследования. В ходе выполнения исследования были разработаны способы получения имплантационных материалов на основе кальцийфосфатных соединений, выделенных из костной ткани сельскохозяйственных животных, представленные в заявках на изобретение - заявка № 2003134131 036658 РФ, МПК7 А 61 К 9/36, 31/70, 31/715 Способ выделения коллагена из минерализированной соединительной ткани и косметическое средство на его основе / Лунева С. Н., Ковинька М. А., Матвеева Е. Л., Талашова И. А., Накоскин А. Н. (РФ). — Заявл. 24.11.2003.; заявка № 2005200254 000267 РФ, МПК7 А 61 К 6/033; 35/32; 37/00 Биоимплантат для возмещения дефектов минерализованных тканей и способ его получения / Шевцов В. И., Талашова И. А., Лунева С. Н., Ковинька М. А. (РФ). -Заявл. 11.01.2005., в отчете по научно-исследовательской работе № гос. регистрации 01.2.00 1 06303 «Разработка способов и материалов для возмещения дефектов трубчатых костей и препарата, ускоряющего созревание дистракционного регенерата», выполненной по договору, заключенному с Министерством здравоохранения РФ.
Апробация работы и публикация результатов исследования. Материалы диссертации доложены на Международной научно-практической конференции «Новые технологии в медицине», Курган, 2000; на симпозиуме «Способы контроля процессов остеогенеза и перестройки в очагах костеобразования», Курган, 2000; на 3-м Российском симпозиуме по остеопорозу, Санкт Петербург, 2000; на 1-м Всероссийском симпозиуме «Возрастные изменения минеральной плотности костей скелета и проблемы профилактики переломов», Курган, 2002; на заседании общества ортопедов травматологов, Курган, 2005.
По теме диссертации опубликовано 22 научные работы в республиканских и областных изданиях.
Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 169 страницах машинописного текста (без списка литературы), включает 44 рисунка и 21 таблицу. Список литературы включает 212 работ, в том числе 92 — отечественные.
Диссертационная работа выполнена по плану НИР ФГУН «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова» Министерства здравоохранения РФ (№ государственной регистрации 01.20.02 06222).
Строение и функциональные особенности костной системы
Среди проблем здравоохранения одной из актуальных является проблема восстановления и замены поврежденных минерализованных тканей. В хирургической практике необходимость замещения костных дефектов и полостей возникает при лечении целого ряда заболеваний, связанных с патологией костной ткани. Сюда можно отнести переломы, замедленную консолидацию, опухоли, ложные суставы, инфекционные и постинфекционные изменения. Восстановление подобных дефектов представляют собой существенную медицинскую, социальную и немалую экономическую проблему.
В новом тысячелетии увеличение продолжительности жизни должно стать характерной чертой современного общества. В связи с этим возникает необходимость в решении ряда медико-материаловедческих проблем, в частности, создания материалов для искусственных органов и тканей. В настоящее время рынок биоматериалов оценивается суммой 3 млрд. $, прогнозируемый годовой прирост составляет 10%, а объемы требуемых материалов оцениваются на уровне десятков тонн (Hench L., 1991, 1998; Suchanek W., 1998; Вересов А.Г., 2000).
Создание материалов для замены поврежденной костной ткани -перспективная, бурно развивающаяся область исследований. Использование для возмещения костных дефектов ауто-, а затем аллотрансплататов стало этапным событием в ортопедии и травматологии. Появилась возможность осуществлять различные варианты костнопластических и сберегательных операций. Однако целый ряд существенных недостатков этого направления, а именно: проблемы совместимости, сложность заготовки и хранения аллокости, нагноения, переломы и рассасывание крупных трансплантатов, необходимость длительной иммобилизации и т.д., создали предпосылки к параллельному поиску искусственных материалов, максимально отвечающих высоким требованиям пластической хирургии. Были предложены многочисленные материалы, полученные с использованием полимеров, металлов, стекла и т.д. (Thomsen Р., 1997; IkedaN., 1999).
Одна из проблем, которые необходимо решить в настоящее время, состоит в том, что сроки лечения больных с дефектами костной ткани достаточно велики и существует необходимость в их сокращении. Известно, что патологические изменения в костной ткани часто требуют для их ликвидации заполнения дефекта кости веществом, которое способно стимулировать репаративные процессы (Bruijn J.D., 1993; Li Y., 1994). Усилия исследователей направлены на решение актуального вопроса - выбора такого пластического материала, который по прочностным характеристикам и составу максимально приближался бы к костной ткани, которая представляет собой композиционный материал на основе ультрадисперсного карбонатсодержащего гидроксиапатита (ГА) и белка коллагена с многоуровневой структурной организацией компонентов (Mehlisch D. R., 1987, 1988; Островский А. В., 1999).
В настоящее время не существует идеального материала, полностью совместимого с организмом, соответствующего всем анатомо-физиологическим и биомеханическим свойствам костной ткани. До сих пор остается нерешенной проблема выбора того или иного имплантата при лечении заболеваний костно-мышечной системы. Стратегия и тактика решения технологических и биомедицинских вопросов в каждом конкретном случае представляет собой сложную интеллектуальную задачу. Очевидно, что для возмещения дефектов костей наилучшим образом подойдет материал, свойства которого наиболее близки к свойствам костной ткани, т.е. химический состав и кристаллическое строение материала должны быть схожими с составом и строением кости (Elliot J. С, 1994; Щепеткин И. А., 1995). В современной медицине при операциях по восстановлению целостности поврежденной кости находят широкое применение материалы на основе фосфатов кальция в силу сходства их химического состава с составом костной ткани - это так называемые биологически активные кальцийфосфатные материалы (КФМ) на основе гидроксиапатита и трикальцийфосфата (Lri Y., 1993; Klein С. et aL, 1994; Леонтьев В. К., 1996; Yang Z. et al., 1996).
Кальцийфосфатные материалы имеют хорошие биосовместимые свойства по тестам проверки биоматериалов на токсичность, гиперчувствительность и канцерогенность. В значительной степени это обусловлено тем, что элементный состав КФМ является естественным для организма (Щепеткин И. А., 1995). Совокупность свойств делает КФМ перспективным классом материалов для использования в травматологии и ортопедии, реконструктивной хирургии и стоматологии (Bruijn J. D., 1993; Li Y., 1994).
В медицинской практике наиболее широко используются крупнокристаллические керамические материалы на основе кальцийфосфатных соединений в форме плотных и пористых блоков и гранул. Для применения в качестве имплантата керамика привлекательна в силу своей химической инертности и высокой прочности (Kim H.D., 1998; Шимон В. М., 2000; Головченко В.В., 2001). Однако эти достоинства керамических имплантатов в определенный момент становятся негативными свойствами этих материалов. Так, новообразующаяся костная ткань не может врасти в имплантат в силу устойчивости керамики в плане своей структуры, и, как результат, место контакта кости и материала заполняется волокнистой соединительной тканью, которая механически охватывает инородное тело. Очевидно, что такой контакт не будет прочным. Керамическим материалам, кроме того, свойственна повышенная хрупкость, т.е. эти материалы не в состоянии выдерживать заметные нагрузки и деформации без разрушения. Таким образом, и зона контакта керамика-кость, и сам керамический имплантат являются предметами пристального наблюдения специалистов во избежание патологических переломов и других видов травмы.
Успех костно-пластической операции во многом определяется качеством используемых для пластики материалов. Особое значение при этом уделяется ксеноимплантатам - материалам, полученным из биологических тканей, или биоматериалам. Биоматериалы должны соответствовать специальным требованиям в зависимости от их применения. Одно требование, однако, является критическим для всех биоматериалов — они должны быть совместимы с физиологическим окружением, то есть не вызывать воспалительных, аллергических реакций и не отторгаться организмом (Fernandez Е., 1999; Puleo D. А., 1999; Kokubo Т., 2003).
Одним из примеров использования биоматериалов, в частности, является применение деминерализованного костного матрикса (ДКМ) для костной пластики (Болтрукевич С. И., 1993; Верзен Р., 1993; Кулик В. И., 1993; Савельев В. И., 1993). Как один из видов биологических тканей, он имеет ряд положительных свойств, которые повышаются за счет воздействия на него деминерализующими растворами, консервантами, лекарственными препаратами. Однако ДКМ, как имплантационный материал, не может привнести с собой все вещества, необходимые для скорейшего возмещения костного дефекта.
В качестве ксеноимплантата используют также естественный гидроксиапатит - неорганический костный матрикс, полученный из животного материала. Для использования в клинике предлагаются коммерчески выпускаемые ксеноимплантаты - материалы, полученные в результате обработки костей крупного рогатого скота ("Endobon" (Германия), "Bio-Oss" (Швейцария), "OsteoGraf N" (США)) и выпускаемые в виде гранул и губчатых блоков разных размеров. Эти материалы применяются в хирургической стоматологии и дентальной имплантации, а также предлагаются для использования в травматологии и ортопедии для замещения дефектов длинных костей и в хирургии позвоночника (Островский А. В., 1999).
Экспериментальные материалы и объекты исследования
Здоровая костная ткань непрерывно подвергается ремоделированию — происходит тесно взаимосвязанные и четко скоординированные процессы резорбции и образования кости. Известно, что регенерация имеет две формы: физиологическую и репаративную (Северин М. В. С соавт., 1993).
Необходимо отметить, что нарушение целостности костных органов приводит к глубокой перестройке структуры костной ткани не только поврежденных (репаративная регенерация), но и интактных костей, причем изменение обменных процессов, протекающих в них в этот период, является вариантом фи 24 зиологической регенерации. Другими словами в травмированном органе и в организме в целом одновременно протекают процессы как репаративной, так и физиологической регенерации (Гололобов В. Г., 1997).
По определению, физиологическая регенерация - это реализуемая в ходе постоянного ремоделирования замена старых, несовершенных структур новыми (Северин М. В. и соавт., 1993). Frost Н. (1964) показал, что последнее является результирующей разнонаправленных процессов (формообразовательного и резорбтивного) и протекает попеременно в различных участках. Он выделяет поверхностное ремоделирование (в надкостнице, эндосте) и внутреннее (в кортикальном слое и больших трабекулах губчатой кости) (Mullender М., Huiskes БЦ 1995).
Ремоделирование костной ткани, приводящее к изменению ее структуры и формы, связано с остеокластно-остеобластным типом перестройки. В то же время существует и остеоцитарный тип, при котором меняется только структура костной ткани в прелакунарной зоне. Иначе говоря, остеоциты способны как резорбировать, так и формировать костный матрикс. В настоящее время ряд авторов считает, что правомерно выделить два взаимосвязанных механизма физиологической регенерации костной ткани: остеоцитарное и остеокластно-остеобластное ремоделирование (Vittali Р., 1968; Baud С. et al., 1971; Baylink D. etal., 1971).
Как отмечают P. Prendergast и R. Huiskes (1996), одна из гипотез регуляции ремоделирования кости основана на том, что при изменении воздействующих на нее механических напряжений остеоцит модулирует функциональную активность остеобластов и остеокластов. Остеоцитарный тип ремоделирования изучен недостаточно и до недавнего времени не рассматривался как отдельный тип ремоделирования. Однако на основании того, что в прелакунарной зоне происходит не только резорбция костного матрикса (Baud С, Aulk Е., 1971), но и его формирование, этот процесс правильнее называть остеоцитарный ремоделированием. А. Хэм и Д. Кормак (1983) расценивают его как механизм поддержания уровня Са+2 в крови. Ряд исследователей выделяют следующие основные звенья остеоцитар-ного ремоделирования: 1) - резорбция минерального матрикса; 2) - резорбция органического матрикса; 3) - формирование органического матрикса; 4) - формирование минерального матрикса.
Остеокластно-остеобластный тип ремоделирования обеспечивает изменение не только структуры костного органа, но также его размеров и формы. На основании анализа литературы в нем можно выделить следующие этапы: 1) -появление участков активного ремоделирования; 2) - резорбция костного матрикса; 3) - формирование органического матрикса; 4) - формирование минерального матрикса.
Считается, что зона активного ремоделирования возникает в области гибели остеоцитов (Хэм А., Кормак Д., 1983), поэтому именно она служит отправной точкой для начала процесса перестройки.
Очевидно, можно предположить, что филогенетически в организме выработаны два основных механизма, гарантирующих высокую степень устойчивости воспроизведения костного матрикса и предотвращения значительных сдвигов в его структуре даже в незначительной по размером зоне ремоделирования. Это достигается многоконтурностью и дублированием механизмов регуляции метаболизма.
Таким образом, резорбция и формирование костного матрикса - это сложный каскадный процесс. Любые изменения внешних условий, возникшие в ходе его развития, приводили бы к серьезным нарушениям костной структуры, если бы не многоконтурность и дублирование всех элементов.
По определению (Северин М. В. с соавт., 1993), репаративная регенерация - процесс воссоздания утраченных в результате действия патогенного фактора структур. По мнению В. Г. Гололобова (1996), в основе восстановления целости костей после травмы лежит взаимодействие остеобластического и ос-теокластического клеточных дифферонов при взаимосвязи их с кровеносными капиллярами. При слабой васкуляризации и, следовательно, недостаточном парциальном давлении кислорода преобладает образование хрящевой ткани (Чаклин В. Д., 1936; Фишкин В. И. с соавт., 1981).
Репаративный остеогенез изучен на органном (Stein Н. et al., 1983; Smith, 1987; Spencer R., 1987), клеточно-тканевом (Grogaard В. et al., 1990; Goransson H. et al., 1992; Postachini F. et al., 1995), молекулярном (Dekel S. et al., 1981; Ashurst D., 1990), а также генетическом (Hirakawa К. et al., 1994; Nakase Т., 1994) уровнях. Результаты этих исследований подтверждают мнение Najjar Т. и Kahn D. (1977) об отсутствии принципиальных различий репаративнои регенерации в разных костных органах (Brighton С, Hant R., 1991; Goransson Н. et al., 1992).
Последовательность событий, разворачивающихся в процессе развития репаративного остеогенеза, следует рассматривать как местное проявление каскада адаптационных реакций, который имеет характерные (свойственные только ему) особенности структуры пространственно-временной организации функций. Так, согласно экспериментальным данным Nakase Т. с соавторами (1994), через 12 ч после перелома признаки экспрессии костного морфогенного белка проявляются в пролиферирующей надкостнице, на 2-е сут - в фибробла-стах и клетках мышечной ткани, обладающих мезенхимальными потенциями и расположенных рядом с областью травмы, с 3-х сут - в клетках надкостницы на значительном протяжении вдоль отломков, а также примыкающих к зоне перелома участках костного мозга.
В отличие от физиологической регенерации репаративный остеогенез возникает после экстремального воздействия и сопряжен со значительными сдвигами обмена в организме. При физиологической регенерации происходит "запоминание" окружающих условий в структуре костного матрикса, при этом сама область ремоделирования оказывает на метаболизм крайне незначительное влияние, которое можно не учитывать. При репаративнои регенерации этот процесс протекает аналогично, то есть окружающие условия оставляют след в структуре формирующегося регенерата, однако для его превращения в функционально зрелую костную ткань необходимо их постоянное изменение, что и по 27 зволяет развиваться репаративному ответу. Область регенерации (в отличие от области ремоделирования) оказывает на обменные процессы в организме существенное влияние и в определенной степени определяет характер развития общей реакции (Nakase Т. et al., 1994).
Очевидно, что для повышения эффективности лечения костных патологий необходимо глубокое изучение механизмов процессов костного ремоделирования.
Анализ литературы показывает, что накоплен значительный объем данных о составе, строении и функциях костной ткани, а современные знания в области биотехнологии позволяют приступить к разработке различных способов замещения костных дефектов. Одним из них является имплантация материалов, применение которых приводит к сокращению сроков лечения больных ортопе-до-травматологического профиля.
Технологии получения композиционных имплантационных материалов на основе кальций фосфатных соединений
Экспериментальными материалами исследования являлись разработанные имплантационные материалы на основе кальцийфосфатных соединений, выделенных из костной ткани КРС: 1) материалы, представляющие собой кальцийфосфатные соединения, выделенные из костной ткани КРС по трем различным технологиям, подробно описанным в гл. III «Результаты исследований состава и свойств разработанных имплантационных материалов»: КФС I, КФС II, КФС III; 2) имплантационные материалы, в состав которых входят кальцийфосфатные соединения и сывороточные белки: КФС І+СБ, КФС П+СБ, КФС Ш+СБ; 3) имплантационные материалы, в состав которых входят кальцийфосфатные соединения и органический матрикс - КФС I +ОМ, КФС II +ОМ, КФС III +ОМ; 4) имплантационные материалы, в состав которых входят кальцийфосфатные соединения, сывороточные белки и органический матрикс - КФС 1+ СБ+ОМ, КФС 11+ СБ+ОМ, КФС III+ СБ+ОМ. В основу работы положен анализ результатов исследований, полученных при имплантации экспериментальным животным материалов на основе кальцийфосфатных соединений, выделенных из костной ткани крупного рогатого скота. Объектами исследования являлись 32 беспородные собаки обоего пола в возрасте от одного года до трех лет с массой тела 9,9±1,0 кг. Эксперименты по имплантации проводили, руководствуясь требованиями и соблюдая условия, изложенные в Хельсинской Декларации Всемирной Медицинской Ассоциации (2000 г) с соблюдением этических норм и гуманного отношения к объектам изучения. Уход и содержание животных осуществлялись в соответствии с требованиями инструкции № 12/313 Министерства здравоохранения РФ «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальных биологических клиник» от 06. 01.73 г. и на основании приказа МЗ СССР № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организованных форм работы с использованием экспериментальных животных» от 12.08.77 г. Все животные до начала эксперимента в течение 30 дней содержались в карантинном отделении. Стандартный рацион включал воду в неограниченном количестве и сбалансированные сухие корма в расчете на массу тела животного. В ходе исследования у экспериментальных животных в стерильных условиях под внутривенным барбитуровым наркозом создавали дырчатые дефекты в виде усеченных конусов диаметром 5 мм и высотой 7 мм в проксимальном метафизе большеберцовой кости и плеча и заполняли их разработанными композиционными материалами или место созданного дефекта ушивалось без его заполнения . Исходя из поставленной цели и задач исследования, экспериментальные животные были распределены на четыре серии. В первой серии (8 собак) изучали возмещение смоделированных костных дефектов при внесении в них материалов на основе кальцийфосфатного соединения І (КФС I) - серия I. Серия I была разделена на две группы: Оперативные вмешательства и послеоперационное ведение животных выполнены д.м.11. С.А. Ерофеевым и к.в.н. Н.А. Кононович. группа la (4 собаки) — в качестве имплантационных материалов применяли КФС I и биокомпозит, в состав которого входит кальцийфосфатное соединение I и сывороточные белки — (КФС І+СБ); группа 16 (4 собаки) — в качестве имплантационных материалов применяли биокомпозит (КФС I+OM) и биокомпозит, в состав которого входит кальцийфосфатное соединение I, сывороточные белки и органический матрикс — (КФС 1+ СБ+ОМ). Во второй серии (8 собак) изучали возмещение смоделированных костных дефектов при внесении в них материалов на основе кальцийфосфатного соединения II (КФС II) - серия II. Серия II была разделена на две группы: группа Па (4 собаки) — в качестве им плантационного материала применяли КФС II и биокомпозит, в состав которого входит кальцийфосфатное соединение II и сывороточные белки — (КФС ІІ+СБ); группа Пб (4 собаки) - в качестве имплантационного материала применяли биокомпозит (КФС П+ОМ) и биокомпозит, в состав которого входит кальцийфосфатное соединение II, сывороточные белки и органический матрикс (ОМ) - (КФС 11+ СБ+ОМ). В третьей серии (8 собак) изучали возмещение смоделированных костных дефектов при внесении в них материалов на основе кальцийфосфатного соединения III (КФС III) - серия III. Серия III была разделена на две группы: группа Ша (4 собаки) — в качестве имплантационного материала применяли КФС III и биокомпозит, в состав которого входит кальцийфосфатное соединение III и сывороточные белки - (КФС Ш+СБ); группа Шб (4 собаки) — в качестве имплантационного материала применяли биокомпозит (КФС Ш+ОМ) и биокомпозит, в состав которого входит кальцийфосфатное соединение III, сывороточные белки и органический матрикс - (КФС III+ СБ+ОМ). В четвертой серии (8 собак) изучали возмещение смоделированных костных дефектов без внесения в них имплантационных материалов - серия IV. Для оценки полученных результатов в качестве нормы использовали до-операционные значения показателей крови и данные рентгенографии экспериментальных животных. С целью контроля течения репаративного процесса в области дефекта рентгенологические исследования проводили через 21 и 42 суток после операции. Материал морфологических исследования составили метафизы больше-берцовых и плечевых костей экспериментальных животных. Материалом биохимических и гематологических исследований являлась кровь экспериментальных животных, взятая венепункцией. Забор крови осуществляли до операции и каждую неделю после операции. Экспериментальных животных эвтаназировали через 21 и 42 суток после операции. Эвтаназию собак проводили внутривенным введением 5%-го раствора тиопентала натрия в летальных дозах. 2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучение химического состава и структуры имплантационных материалов, а также изменений, происходящих в крови животных в ходе эксперимента, осуществлялось на основе комплексного исследования, включающего биохимические, физические, электронно-микроскопические, морфологические, статистические методы. Минеральную составляющую изучаемых имплантационных материалов получали из предварительно очищенной и измельченной костной ткани КРС Для деминерализации костной ткани использовали соляную кислоту, для последующего осаждения из полученных растворов фосфатов кальция применяли растворы щелочей. Более подробно методика получения описана в гл. III «Результаты исследований состава и свойств разработанных имплантационных материалов».
Замещение костных дефектов при использовании имплантационных материалов
При заполнении дырчатого дефекта имплантационным материалом, включающим минеральный компонент КФС III и сывороточный белок, так же, как и в случае использования одного компонента КФС III, на 21 сутки после операции отмечено два варианта заживления. В первом случае в области повреждения располагается преимущественно рыхлая неоформленная волокнистая соединительная ткань, васкуляризированная расширенными сину-соидными капиллярами. Сосуды гиперемированы, выражен диапедез эритроцитов. Дно и стенки дефекта выстланы новообразованной губчатой костной тканью с плотной сетью ретикулофиброзных трабекул и фиброзным костным мозгом. В составе матрикса тканей регенерата отмечены единичные гранулы экспериментального материала диаметром менее 0,5 мм. Трабекулы новообразованной губчатой кости регенерата и губчатой кости метафиза подвергаются перестройке. Костный мозг неповрежденной части метафиза кроветворно-жировой, кровеносные сосуды гиперемированы либо заполнены плазмой, наружная и средняя оболочки артерий утолщены. Периостальные наслоения губчатой кости отмечены на всей поверхности корковой пластинки. Во втором случае дефект заполнен ретикулофиброзной губчатой костной тканью с рыхлыми, оксифильно окрашенными гранулами КФС III. На поверхности трабекул и гранул экспериментального материала располагаются многочисленные остеокласты. В губчатой кости неповрежденных участков метафиза отмечена гиперемия синусоидов и артерий костного мозга. Перио-стальный остеогенез незначительно выражен (рис. 41,42).
В одном случае дефект заполнен губчатой костной тканью с разреженной сетью трабекул смешанного строения и фрагментами рыхлой неоформленной волокнистой соединительной ткани. Костный мозг новообразованного участка кости фиброзный и кроветворно-жировой. В матриксе тканей регенерата располагаются остатки базофильно окрашенных гранул экспериментального материала. Отдельные гранулы включены в состав трабекул, отмечены контакты синусоидов волокнистой соединительной и костной тканей с поверхностью гранул. В губчатой костной ткани регенерата отмечено формирование корковой пластинки. Фиброзный слой надкостницы в области дефекта утолщен. В губчатой кости отломков неповрежденной части метафиза наблюдается уплотнение трабекулярной сети, костный мозг кроветворно-жировой. На периостальной поверхности корковой пластинки метафиза вблизи от зоны повреждения располагаются небольшие по протяженности наслоения компактизирующейся губчатой кости (рис. 42).
В другом случае область повреждения заполнена плотной неоформленной волокнистой соединительной тканью, слабо васкуляризированной сосудами малого калибра. Гранулы экспериментального материала в составе мат-рикса ткани не отмечены. На границе с костной тканью метафиза формируется компактная замыкательная пластинка. Трабекулярная сеть губчатой кости метафиза разрежена. Костный мозг кроветворно-жировой, синусоиды частично заполнены плазмой, наружная и средняя оболочки артерий утолщены. Периостальные наслоения костной ткани отсутствуют.
В третьем случае в области повреждения располагается преимущественно рыхлая неоформленной волокнистая соединительная ткань, васкуляри-зированная расширенными синусоидными капиллярами. Дно и стенки дефекта выстланы зрелой губчатой костной тканью с разреженной сетью пластинчатых трабекул и кроветворно-жировым костным мозгом. Гранулы экспериментального материала отсутствуют (рис. 43). При заполнении дырчатого дефекта имплантационным материалом, включающим минеральный компонент КФС III, сывороточный белок и органический компонент костного матрикса, гистологическая картина в области повреждения полностью совпадет с результатами исследования, полученными без внесения органического компонента.
Исследование гистологического строения новообразованного участка метафиза в серии без имплантации показало, что к 21 суткам после выполнения оперативного вмешательства область дефекта заполнена преимущественно незрелой губчатой костной тканью с фрагментами неоформленной рыхлой волокнистой соединительной ткани. На поверхности ретикулофиб-розных трабекул располагаются активные остеобласты. Костный мозг фиброзный либо кроветворно-жировой, с расширенными полнокровными синусоидами. В области повреждения губчатой кости метафиза сохраняется углубление, заполненное плотной неоформленной волокнистой соединительной тканью. Эндостальная реакция в неповрежденных участках губчатой кости не выражена. Трабекулы имеют пластинчатое строение, костный мозг кроветворно-жировой, явления отека и гиперемии не выражены. Отмечено утолщение и разрыхление волокнистого слоя надкостницы регенерата и прилежащих к нему неповрежденных участков кости. Периостальный остеогенез не наблюдается (рис. 44а).
На 42 сутки после операции на гистотопографических препаратах наблюдается заполнение области дефекта новообразованной губчатой костью с разреженной трабекулярной сетью. На уровне корковой пластинки метафиза, в большинстве случаев, располагается углубление, выстланное плотной неоформленной волокнистой соединительной тканью. Трабекулы по периферии дефекта образованы пластинчатой, в центре - ретикулофиброзной костной тканью. Наблюдается компактизация губчатой кости с формированием корковой пластинки новообразованного участка метафиза. Костный мозг регенерата кроветворно-жировой, синусоиды расширены, заполнены эритроцитами. В неповрежденной губчатой кости метафиза трабекулы имеют пластинчатое строение, костный мозг жировой или кроветворно-жировой, у сосудов артериального русла утолщены средняя и адвентициальная оболочки, просвет заполнен эритроцитами. Периостальные наслоения на поверхности корковой пластинки метафиза отсутствуют (рис. 446).
