Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Метаболиты бактерий рода Pseudomonas — агенты биологи
ческого контроля фитопатогенных грибов 9
1.1.1. Продукция сидерофоров 9
Сидерофоры пиовердинового типа 10
Другие сидерофоры 12
1.1.2. Синтез антибиотиков 15
Условия культивирования, питательные среды для бактерий рода Pseudomonas — продуцентов веществ с фунгицидной активностью 23
Выделение и свойства метаболитов бактерий рода Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью 25
Способы выделения метаболитов бактерий рода Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью 25
Количественная оценка антигрибной
активности метаболитов бактерий рода Pseudomonas 31
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 34
Объекты исследований 34
Условия хранения и культивирования псевдомонад 35
Условия хранения и культивирования фитопатогенных грибов 35
Изучение условий культивирования, влияющих на биосинтез
метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной
активностью 36
2.5. Определение фитогормональной активности метаболитов
Pseudomonas 36
2.6. Выделение метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной
активностью 36
2.7. Определение рН - стабильности и термостабильности
низкомолекулярных фракций метаболитов Pseudomonas 38
2.8. Методы изучения состава и структуры метаболитов Pseudomonas,
обладающих фунгицидной активностью 38
2.9. Определение антигрибной активности метаболитов Pseudomonas,
обладающих фунгицидной активностью 39
2.10. Комплексообразование метаболитов Pseudomonas с углеводами,
определение стехиометрии комплексов 39
2.11. Статистическая обработка результатов 40
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА БИОСИНТЕЗ
НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ШТАММАМИ
БАКТЕРИЙ Pseudomonas 41
3.1. Влияние углеродного и азотного питания на фунгицидную
активность штаммов Pseudomonas 41
Природа источника углерода 41
Природа источника азота 42
3.2. Влияние температуры культивирования на фунгицидную
активность штаммов Pseudomonas 44
3.3. Динамика процессов периодического роста и образования
антибиотических веществ штаммами Pseudomonas 44
ХАРАКТЕРИСТИКА НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ФРАКЦИЙ
МЕТАБОЛИТОВ Pseudomonas И ВЫДЕЛЕНИЕ ИЗ НИХ
МЕТАБОЛИТОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ФУНГИЦИДНОЙ
АКТИВНОСТЬЮ 49
4.1. Определение состава низкомолекулярных фракций
метаболитов штаммов Pseudomonas 49
4.2. Характеристика физико-химических свойств низкомолекулярных
'* фракций метаболитов штаммов Pseudomonas 52
4.3. Выделение метаболитов штаммов Pseudomonas, обладающих
фунгицидной активностью, оценка их чистоты и
гомогенности 54
5. СТРУКТУРА И СВОЙСТВА МЕТАБОЛИТОВ Pseudomonas,
ОБЛАДАЮЩИХ ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 58
5.1. Определение молекулярной массы метаболитов штаммов
Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью 58
5.2. Аминокислотный и элементный составы метаболитов штаммов
'*' Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью 59
5.3. ИК— и ЯМР 13С— спектроскопия метаболитов штаммов
Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью 61
Антигрибная активность триглицеридпептидов Pseudomonas 63
Комплексообразующая способность триглицеридпептидов
Pseudomonas 66
ВЫВОДЫ 70
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 71
список сокращен
*
кДа — килоДальтон
НМ — низкомолекулярные
КЖ - культуральная жидкость
Mr - молекулярный вес
МИК - минимальная ингибирующая концентрация
ВКМ - всероссийская коллекция микроорганизмов
ТСХ - тонкослойная хроматография
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ДЭ - дрожжевой экстракт
АСВ — абсолютно сухие вещества
ИФА - иммуноферментный анализ
-С
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бактерии рода Pseudomonas — одна из наиболее изученных групп микроорганизмов с точки зрения объектов биологического контроля почвенных фитопатогенов (Рубан, 1986; Weller, 1988; Смирнов, Киприанова, 1990; Dowling & O'Gara, 1994; Воронин, 1998; Логинов и др., 2001; Bloemberg & Lugtenberg , 2001; Whipps, 2001) и обладающих совокупностью полезных для растений свойств. В настоящее время такие бактерии принято обозначать PGPR — Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (ризобактерии, способствующие росту растений).
Следует также отметить, что PGPR Pseudomonas являются потенциальными объектами агробиотехнологий для разработки на их основе биологических средств защиты растений от фитопатогенов.
Одним из факторов, позволяющих воздействовать на фитопатогеные микроорганизмы, заселяющие ризосферу растений, является продукция псевдомонадами различных НМ веществ, таких как сидерофоры и антибиотики. За последнее десятилетие учеными обнаружены и выделены новые метаболиты бактерий рода Pseudomonas, обладающие фунгицидной активностью, такие как фураноны, аеругин, меркапто-4-формилкарбостирил и др. (Shoji et al., 1990; Sokol et al., 1992; Lee et al., 1994; Jiao et al., 1996; Moon et al., 1996; Gamard et al., 1997; Suzumura et al., 1997; Thrane et al., 1999Nielsen et al., 1999; Nielsen et al., 2000; Paulitz et al., 2000; Kim et al., 2000; Fakhouri et al., 2001; Sorensen et al., 2001; Quail et al., 2002; Lee et al., 2003), что в какой-то мере можно связать с привлечением новых физико-химических методов анализа (Shanahan et al., 1992, 1993).
Цель исследования. Целью исследований являлось изучение состава и физико-химических свойств метаболитов, продуцируемых бактериями Pseudomonas putida ИБ 17 (Патент РФ № 2213774), Pseudomonas chlororaphis
7 ИБ 6 и Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 (Патент РФ № 2203945) - основы биопрепарата "Елена", и определение биологической роли данных метаболитов в проявлении фунгицидной активности исследуемых штаммов по отношению к фитопатогенным грибам. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. изучить влияние условий культивирования и отдельных компонентов
питательной среды на продукцию метаболитов штаммами Pseudomonas;
2. отработать схему выделения и очистки метаболитов штаммов
Pseudomonas; выделить и охарактеризовать гомогенность очищенных
метаболитов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии;
исследовать основные физико-химические свойства метаболитов;
определить состав и предполагаемую структуру метаболитов. Научная новизна. Выделена и охарактеризована новая группа
метаболитов псевдомонад, по химической структуре представляющих собой трипептиды глицерина, и обладающих фунгицидной активностью.
Установлена способность комплексообразования триглицеридпептидов псевдомонад с углеводами.
Практическая значимость. Изучены условия максимальной продукции и активности метаболитов фунгицидной природы Pseudomonas, что может быть использовано при производстве биопрепарата "Елена" для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на XV Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2002), I и II Международных конгрессах «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва,
8 2003), семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов
«Биотехнология - 2003» (Пущино, 2003).
Публикации. По материалам работы опубликовано 9 научных работ, в том числе три статьи в рецензируемых журналах.
Благодарности
Автор выражает огромную признательность всем сотрудникам лаборатории биологически активных веществ Института биологии Уфимского научного центра РАН за постоянную поддержку при выполнении данной работы. Автор благодарит заведующего контрольно - аналитической лаборатории Института биологии Уфимского научного центра РАН к.х.н. Гусакова В.Н. за помощь в обсуждении результатов и консультации.
