Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 10
1. Микроорганизмы молочнокислого брожения - биологические и молекулярно-генетические свойства 10
1.1. Таксономическое положение и филогенетические связи лактобацилл 10
1.2. Фенотипические свойства бактерий рода Lactobacillus 13
1.2.1. Биохимические свойства как основа видовой энзимоидентификации бактерий рода Lactobacillus 13
1.2.2 Некоторые биологические свойства бактерий рода Lactobacillus: адгезия, антагонизм по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам и межбактериальные взаи модействия 16
1.3. Проблемы раздельного и совместного культивирования лактобакте-рий 22
1.4. Особенности молекулярно-генетической структуры микроорганизмов рода Lactobacillus 27
1.5. Методы выделения геномной ДНК бактерий рода Lactobacillus 33
1.6. Методы индикации и идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием молекулярно-генетических технологий 35
2. Лактобациллы как основа пробиотических препаратов 44
2.1 .Классификация пробиотиков 44
2.2.Механизмы действия пробиотических препаратов 48
III. Материалы и методы 52
1. Исследуемые объекты 52
2. Культивирование лактобактерий и биохимическая идентификация 53
3. Полимеразная цепная реакция 55
4. Секвенирование ДНК 58
5. Определение биосовместимости лактобацилл 58
6. Исследование динамики роста популяции бактерий Lactobacillus plantarum
8 RA-3 и Lactobacillus fermentum 39 в условиях раздельного и совместно го культивирования 60
7. Статистическая обработка 62
IV. Результаты исследований и их обсуждение 63
1. Изучение биохимических свойств вновь выделенных штаммов рода Lactoba-cillus 63
2. Разработка метода индикации бактерий рода Lactobacillus на основе специфической амплификации нуклеиновых кислот 65
2.1 Разработка методики индикации бактерий рода Lactobacillus на основе ПНР гена 16SpPHK 67
2.2 Оценка эффективности методов выделения геномной ДНК из бактерий рода Lactobacillus 79
3'. Разработка унифицированной схемы видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus на основе ПНР гена 16S рРНК и ее апробация 84
3.1 Разработка методики видовой идентификации лактобацилл с использованием гнездового варианта ПНР 85
3.2 Оценка видовой специфичности ПНР лактобацилл в сравнении с классическим биохимическим методом их идентификации 93
4. Применение ПНР в характеристике популяционно-ростовых свойств микро организмов рода Lactobacillus 97
4.1. Изучение межштаммовых взаимодействий производственно значимых видов лактобацилл 97
4.2. Оценка метода ПНР при изучении динамики роста культур L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 в условиях совместного культивирования 107
V. Заключение 114
Вьіводьі 127
Список литературы 128
- Таксономическое положение и филогенетические связи лактобацилл
- Методы выделения геномной ДНК бактерий рода Lactobacillus
- Исследуемые объекты
- Изучение биохимических свойств вновь выделенных штаммов рода Lactoba-cillus
Введение к работе
Актуальность проблемы Микроорганизмы рода Lactobacillus широко распространены в природе, а некоторые виды являются важнейшими представителями микробиоты организма человека [Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В., 2003]. Лактобациллы длительное время привлекают внимание ученых — биохимиков, микробиологов, медиков, экологов, ввиду их потенциального значения для поддержания гомеостаза системы «человек-окружающая среда», сохранения здоровья населения, профилактики и лечения многих заболеваний различной этиологии.
Актуальным вопросом является получение новых знаний о биологических свойствах и молекулярно-генетической структуре лактобацилл; создание новых пробиотических препаратов на их основе с помош;ью разных методических подходов к культивированию. Главным конечным продуктом метаболизма лактобацилл является D- и L-молочная кислота. У гомоферментативных лактобацилл лактат составляет 90% всех продуктов брожения. У представителей гетероферментативных видов в качестве конечных продуктов также образуется молочная кислота и углекислый газ [Шлегель Г., 1987]. Благодаря продукции органических кислот, перекисей и бактериоцинов многие штаммы лактобацилл проявляют выраженную антагонистическую активность в отношении патогенных и оппортунистических микроорганизмов [Quadri L.E., 2002; Kleerebezem, 2004]. Бактерии рода Lactobacillus усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы, омыляют жиры, препятствуют микробному декарбоксилированию пищевого гистидина и повышению количества гистамина [Воробьёв А.А., Лыкова Е.А., 1999]. Биохимические и морфологические свойства лактобацилл являются в настоящее время основным и единственным критерием межродовой и видовой идентификации этих микроорганизмов. Альтернативой классической биохимической идентификации может стать метод генотипирования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Разработка новых и оптимизация известных молекулярно-генетических методик "индикации и точной видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus является актуальной, практически значимой и своевременной задачей, которой уделяется большое внимание как отечественными, так и зарубежными исследователями. Однако^.несмотря- на углубленное изучение этого вопроса на настояш,ий момент еш,е отсутствует оптимальная, лабораторная методика на основе ПЦР; позволяющ,ая проводить индикацию и идентификацию видов рода Lactobacillus.
Цель исследования На,основе изучения биохимических свойств иструктуры генома разработать унифицированный метод на основеТПОР для индикации и видовой идеитификациибактерий рода,Lactobacillus; И'исследовать их межштаммовые взаимоотношения. , Задачи исследования:
1. Изучить биохимические свойства новых штаммов лактобацилл: (сахаролитические; свойства).
2. На: основе'анализа?нуклеотидных; последовательностей гена 16S рРНК бактерий" молочнокислого брожения^ представленных в GenBank, подобрать композицию универсальных праймеров для;индикации бактерий рода Lactobacillus.
3. Провести оценку сравнительной эффективности различных методов выделения ДНК из клеток бактерий рода Lactobacillus - ферментативного лизиса, кипячения и нуклеосорбции^ для последуюш;его проведения ПЦР.
4. Установить нуклеотидную последовательность фрагмента гена 16S рРНК следующих штаммов пробиотических лактобацилл: L.plantarumi 8 RA-3, L.femientum 39 и L.casei 583.
5. Разработать схему видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием «гнездовой» ПЦР специфического фрагмента индикации.
6. Провести сравнение метода видовой идентификации бактерий рода; Lactobacillus с использованием ПЦР и классического биохимического метода.
7. На основе изучения биологических (межштаммовых взаимодействий) и популяционно-ростовых свойств микроорганизмов' рода Lactobacillus определить КОМПОЗИЦИЮ'биосовместимых штаммов для осуществления процесса совместного культивирования при создании нового многокомпонентного пробиотика и отработать методологию контроля динамики роста с использованием ПЦР. Научная новизна и практическая значимость работы Разработана новая методика ПЦР для индикации бактерий рода Lactobacillus, основанная на оригинальных (авторских) родоспецифичных праймерах FLg, RLgl и RLgll, составивших предмет патентования.
Впервые установлены нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК штаммов L. plantarum 8 RA-3, L. casei 583, L. fermentum 39, которые депонированы в GenBank под номерами FJ210723, FJ210724, FJ210725, что расширило международную базу нуклеотидных последовательностей генома лактобацилл.
Создана унифицированная схема видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием гнездового варианта ПЦР, включающая авторский праймер для идентификации L. delbrueckii.
При изучении межштаммовых взаимоотношений 10 штаммов лактобацилл впервые показана биосовместимость бактерий L. plantarum 8- RA-3 и L.fermentum 39. Эффективность совместного выращивания, установленная нами, обосновала создание симбиотика на основе этих лактобацилл с использованием принципа совместного культивирования (Патент №2280465, приоритет от
25.10.2004).
С помощью разработанной методики определены параметры контроля динамики роста новой композиции биосовместимых штаммов вида L. plantarum 8 RA-3 и L.fermentum 39 при совместном культивировании.
Полученные результаты позволили обосновать новые области применения ПЦР при подборе штаммов-продуцентов на этапе идентификации и для контроля штаммового состава на всех этапах производства пробиотических препаратов. Разработанная методология родовой и видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus позволит усовершенствовать контроль технологического процесса на предприятиях по производству фармакопейных препаратов, БАД к пище и продуктов питания на основе молочнокислых микроорганизмов и поставить на новый методический уровень контроль, мультиштаммовых пробиотических продуктов на соответствие НТД в органах Роспотребнадзора и Центрах сертификации.
Положения, выносимые на защиту
1. Разработанные методики на основе специфической-амплификации фрагмента гена 16S рРНК позволяют проводить индикацию и видовую идентификацию пробиотических штаммов лактобацилл, сопоставимую с их классической биохимической идентификацией.
2. Штаммы L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39^ относящиеся к двум разным подгруппам гетероферментативных лактобацилл обладают синергидными взаимоотношениями, что обосновало их использование в качестве штаммов-продуцентов пробиотиков в условиях технологии совместного культивирования.
3. Разработанный метод полимеразной цепной реакции- с использованием «контрольных разведений» бактериальных культур является адекватным для оценки динамики роста Ь. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 в условиях совместного культивирования.
Апробация работы Основные положения и результаты работы были доложены на конкурсе молодых ученых, проводимом в рамках IV съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Пущино, 2007 г.), на заседаниях Ученого Совета и проблемных научно-практических семинарах Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (2005-2008 гг.).
Структура и объем диссертации Материалы диссертации изложены на 148 страницах машинописного текста, иллюстрированы 17 рисунками и 15 таблицами. Работа состоит из-введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 185 источников, из которых 108 иностранных.
Таксономическое положение и филогенетические связи лактобацилл
Грамположительные неподвижные бактерии, факультативные анаэробы, способные расти в присутствии незначительного количества кислорода и при сбраживании углеводов (глюкозы, лактозы), продуцирующие органические кислоты, в основном, молочную кислоту, объединяют под общим названием -бактерии молочнокислого брожения. Эти микроорганизмы не образуют спор (кроме Sporolactobacillus inulinus), имеют бродильный тип метаболизма, требовательны к ростовым веществам.
Условная группа молочнокислых бактерий включает в себя микроорганизмы филогенетически близких родов: Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Oenococcus, Carnobacterium, Weissella, Alloicoccus, Dolosigranulum, Melissicoccus, Tetragenococcus, Vagococcus, Lacosphaera, Aerococcus [162; 116]. В группу молочнокислых бактерий включают и филогенетически неродственные, строго анаэробные виды рода Bifidobacterium, также продуцирующие молочную кислоту. Бифидобактерии имеют высокий процент содержания ГЦ-оснований (55-67%), а так называемые «истинные» молочнокислые бактерии - имеют процент ГЦ-оснований 55% [162]. Другие авторы обозначают бифидобактерии как молочнокислые микроорганизмы, относящиеся к подотделу Actinomycetes грампозитивных бактерий, тогда как остальные молочнокислые бактерии относятся к подотделу Clostridium-Bacillus [160].
Одной из наиболее ранних классификаций лактобацилл является классификация Orla-Jensen, созданная по физиологическим признакам (табл.1). Но эта классификация не отражает филогенетические связи внутри группы молочнокислых бактерий [160]. Таблица 1 Группы молочнокислых бактерий по S. Orla-Jensen и данным совре менной таксономии Род по данным S. Orla-Jensen (1919) Форма Ката-лаза Редук ция нитратов Тип брожения Род по данным Stiles М.Е., Hol-zapfelW.H.(1997) Betabacterium палочки Гетероферментатив-ный LactobacillusBifidobacteriumWeissella Thermobacterium (температурный оптимум 40С, при 15С не растут) палочки Гомоферментативный Lactobacillus Streptobacterium (температурный оптимум 30 С -37С,при15С растут) палочки Гомоферментативный иГетероферментатив-ный Lactobacillus Carnobacterium Streptococcus кокки Гомоферментативный Streptococcus Enterococcus Lactococcus Vagococcus Род Lactobacillus относится к порядку Firmicutes- грамположительные бактерии, семейство Lactobacillaceae. Представители рода Lactobacillus характеризуются разнообразной морфологией - грамположительные короткие палочки, длинные палочки, коккобациллы. Морфология микроорганизмов зависит от условий роста, состава питательной среды, температурного режима, возраста культуры.
Род Lactobacillus объединяет 80 видов, из которых 7 подразделяют на два и более подвидов. Филогенетические связи между «истинными» молочнокислыми бактериями отражены на рисунке 1. Oenococcus В составе семейства выделяют три нуклеотидные группы: 1 (31-39% GC), 2 (40-46 % GC), 3 (47-53% GC). В соответствии с нуклеотидными группами бактерии подразделяются на три группы: первая с типовым видом L. acidophilus (32-37% GC), вторая с типовым видом L. casei (45-47% GC), третья с типовым видом L. delbrueckii (49-53% GC) [6; 51]. По биохимическим признакам род также подразделяется на три группы: I - облигатно гомоферментативные (L. delbrueckii, L. acidophilus, L. helveticus) II 13 факультативно гетероферментативные (L. casei; L.plantarum), III - облигатно ге-терофёрментативные (L. fermentum, L. brevis). Согласно классификации, в которой учитывались как филогенетические связи, так и биохимические признаки-род Lactobacillus разделяли на три группы: группа L. delbrueckii, группа L. casei — Pediococcus, группа Leuconostoc [116; ИЗ].
По последним данным, в результате сравнительного анализа1 генетических детерминант 16 и 23 S рРНК, биохимических свойств и данных о строении пептидогликана клеточных стенок, микроорганизмы, входящие в группу Leuconostoc реклассифицированы как представители» рода Leuconostoc и.рода-Weis-sella, а группа L. casei — Pediococcus разделена на- род Pediococcus и 6 групп: группа L. casei, группа L. salivarius, группа L. reuteri, группа-L. buchneri, группа L. plantarum и группа L. sakei. Группы-разнородны и включают представителей; отличающихся, по соотношению гуаниновых и цитозиновых оснований; с разным типом брожения, различным строением пептидогликана клеточной стенка [122; 113].
Микроорганизмы молочнокислого брожения широко распространены в природе, чаще всего встречаются на растениях неразлагающихся растительных остатках, в молоке и местах его переработки, в кишечнике и на слизистых человека и животных. Некоторые из них - род Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus sp. thermophilus - являются- важнейшими представителями микробиоценоза биотопов человека [6; 10; 46; 21; 13; 102; 148]. Эти же микроорганизмы являются- основой для большинства пробиотических препаратов и функциональных продуктов питания.
Методы выделения геномной ДНК бактерий рода Lactobacillus
Для выделения, ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из препарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки ГЩР.
При работе с чистыми культурами бактерий молочнокислого брожения, бактериальными заквасками и продуктами питания исследователи применяют «простые» методы выделения геномной ДНК, предполагающие проведение од-ной-трех стадий и отсутствие фенольной обработки.
Имеется опыт применения метода кипячения для выделения геномной ДНК лактобацилл, используемых в мясной промышленности. При этом 50 мкл культуры в жидкой среде центрифугировали, осадок растворяли в 100 мкл стерильной дистиллированной воды и кипятили в течение 5 минут. Клеточный дебрис осаждали центифугированием в течение 3 мин при 14 тыс. оборотов в минуту, 10 мкл супернатанта использовали для постановки ПЦР [182].
Для решения- задач по субтипированию бактерий вида L. delbrueckii для выделения геномной ДНК пробу обрабатывали детергентами - додецилсульфа-том натрияг (SDS) и перхлоратом натрия, ДНК, вышедшая, в раствор преципи-тировалась 96% этанолом. Для удаления примесей, осадок ДНК однократно промывался 70% этанолом, а1 затем растворялся в буфере ТЕ. EDTA (этилен-диаминацетат), содержащийся в буфере, инактивирует бактериальные нуклеазы и способствует сохранению ДНК [170].
При работе с бактериями рода Bifidobacterium, исследователи применяли механическую обработку пробы, с помощью, микроскопических стеклянных шариков, затем пробу центрифугировали при 12 тыс. об. в минуту. Полученный, супернатант использовали для постановкиТТЦРі Исследователи отмечают, что чувствительность ПЦР при таком методе- предобработки значительно ниже аналитической засчет ингибированияфеакции [174].
Чаще при работе с молочнокислыми бактериями- используют многоэтапные методики с применением детергентов - SDS, EDTA, цетил-триметил-аммоний бромида (STAB) и ферментов, для экстрагирования ДНК из раствора применяют смесь фенол-хлороформ-изоамиловый спирт.
Так, для выделения геномной ДНК молочнокислых бактерий рода Lactobacillus, Leuconostoc и Weissella из фекальных проб, применяли многоэтапную методику, включающую этап лизиса клеток буфером, содержащим EDTA, ли-зоцим и мутанолизин. После инкубации при 37 С в течение 1 часа, что необходимо для эффективной работы ферментов, проводилось разрушение нуклео-протеидных комплексов с помощью протеиназы К и SDS. Экстракция ДНК проводилась дважды смесью фенол - хлороформ - изоамиловый спирт, затем ДНК преципитировалась этанолом [178; 184].
Многие исследователи вводят в методики выделения этап механической обработки проб в сочетании с традиционной ферментативной обработкой. Такие методики применяются при работе с гастроинтестинальными молочнокис 35
лыми бактериями [185]. В работе по изучению микробиоценоза кишечника человека для выделения ДНК грамположительных бактерий применялся метод, согласно которому проба обрабатывалась фенолом и циркониевыми кристаллами, а затем гомогенизировалась в шейкере. Последующая экстракция смесью хлороформ-изоамиловый спирт и преципитация этанолом и ацетатом натрия гарантировала высокое качество полученной ДНК [185; 178]. Перспективным методом для работы с грамположительными бактериями является выделение геномной ДНК с помощью СТАВ (цетил-триметил-аммония-бромида). Метод не предусматривает этапа фенольной обработки и дает хорошие результаты при работе с лактобациллами [36].
Одним из наиболее удобных в настоящее время- является метод выделения ДНК, предложенный R. Boom с соавторами. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента - гуанидина тиоциона-та (GuSGN), и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко» и.т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощьюг элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации [85].
Исследуемые объекты
В!работе использовали 16 штаммов1 бактерий рода Lactobacillus, Bifidobacterium и Streptococcus, полученных в ходе совместной научной работы Нижегородского НИИЭМ с Тартуским государственным университетом, Институтом медико-биологических проблем РАН, МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, а также выделенных ранее в лаборатории микробиоценозов и конструирования пробиотиков ННИИЭМ - L. plantarum 8RA-3; L. plantarum 30; L. fermentum 39; L. acidophulus 1660; L. delbrueckii 76; L. casei 577; L. casei 583; L. rhamnosus 1790; L. acidophulus АЩГ3; L. plantarum 1862; L. paracasei spp. paracasei 6; L. rhamnosus 7; L. rhamnosus 526; B. bifidum 1; S. thermophilus 17 T; E. coli Ml7.
Также использовали коммерческие лиофильно высушенные препараты: «Линекс», фирма «Lek», «Бифидумбактерин» и «Бификол», фирма «Микроген» и коммерческие кисломолочные продукты: «Активия» и «Актимель», Danon; «Иммунеле», Вимм-Билль-Данн. Нуклеотидные последовательности Нуклеотидные последовательности бактерий рода Lactobacillus и других бактерий молочнокислого брожения были собраны в базах данных GenBank/ EMBL/DDBJ.
Последовательности гена 16S рибосомной РНК молочнокислых бактерий: Lactobacillus fermentum SFCB2-10c (DQ399355), L. fermentum 39, L. fermentum SFCB2-3 (DQ399352), L. fermentum SFCB2-1 (DQ399350), L. fermentum YB5 (DQ208931), L. fermentum (AF182720), L. fermentum SFCB2-8c (DQ399356), L. fermentum BFE 6625 (AY929283), L. fermentum PL9005 (AF477498), L. fermentum (AJ617543), L. fermentum MD-9 (AY373589), L. plantarum 8 RA-3, L. plantarum SFCB2-2 (DQ399351), L. plantarum PFK2 (DQ295035), L. plantarum (AMI57432) L. plantarumX6 (DQ239699) L. plantarum L5 (DQ239698), L. plantarum subsp. argentoratensis (AJ640078), L. delbrueckii subsp. bulgaricus JSQ2 (DQ295039), L. delbrueckii CCC 95G3L (AF429615), L. acidophilus ATCC 521 (AF429581), L. acidophilus BCRC10695 (AY773947), L. acidophilus CCC В1209 (AF429578), L. acidophilus (M58802), L. casei Ru2-2i (DQ413240), L. casei (AB239468), L . casei AK16 (DQ103575), L. casei BCRC10697 (AY773945), L. casei LC3 (AY675252), L. casei MCRF-284 (AY299487), L. rhamnosus TCELL-1 (DQ010418), Bifidobacterium bifidum DSM 20456T (S83624), B. bifidum M203049 (DQ338568), B. longum NCC2705 (AE014295), Streptococcus thermophilus (DQ176426), S. thermophilus (AB200871), Leuconostoc lactis (AJ937759), Leuc. (DQ297412), Lactococcus lactis (AMI 57445), Lactococcus lactis subsp. lactis (AM088020), Carnobacterium sp. (AJ427446), Carnobacterium sp. (Z73313), Propionibacterium jensenii (AJ937773), P. propionicus (PPR315953), P. acnes (AM157438). Всего 43 последовательности.
Компьютерные программы Для-сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей геномных ДНК молочнокислых бактерий, подбора и оценки праймеров-для специфической амплификации ДНК лактобактершг были использованы программы «Oligo4,0» 1989-91 (США); «Mega3», «Mega 4.0» (www.megasoftware.net) [124; 164]. Для идентификации штаммов лактобацилл использовали программу BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov\ BLAST).
Для выращивания культур бактерий рода Lactobacillus использовали модифицированные питательные среды МРС (среда J. С. De Man, М. Rogosa и Е. Sharpe): полужидкую, содержащую 0,15% агара (МРС-2) и плотную, содержащую 2% агара (МРС-4). Штаммы для молекулярно-генетических исследований высевали на полужидкую среду МРС-2 и инкубировали в течение 12 часов при 37С. Полученные культуры бактерий стандартизировали спектрофотометриче-ски (Ббоо=1) и использовали для выделения геномной ДНК. В ходе опыта по подбору среды для определения межштаммовых взаимодействий были использованы плотные среды МРС-4, ГМС-3 (гидролизатно-молочная среда), МДС-4 (молочно-дрожжевая среда) и МДС-м (основа среды МДС с добавлением саха-ра (сорбита) и индикатора).
Для разделения»L. plantarum 8RA-3 и L. fermentum 39 в смешанной популяции в лаборатории микробиоценозов и конструирования пробиотиков Нижегородского НИИЭМ сконструирована среда МДС-м. В среду МДС-м введены сахар, позволяющий дифференцировать эти два микроорганизма, и индикатор, фиксирующий изменение кислотности среды вследствие усвоения сахара в диапазоне рН 5,2-6,8.
Биохимическая идентификация бактерий рода Lactobacillus Определение принадлежности выделенных бактерий к роду Lactobacillus проводили по ГОСТ 10444.11-89 «Продукты пищевые. Методы обнаружения молочнокислых микроорганизмов»: по отношению к окраске по Граму, подвижности, наличию каталазы. К бактериям рода Lactobacillus относили микро-аэрофильные, грамположительные, палочковидные, неподвижные, неспорооб-разующие, не обладающие каталазой микроорганизмы. Определение видовой принадлежности лактобацгиш. Определение ферментации углеводов проводили с использованием дисков с углеводами и бульона с бромкрезоловым пурпурным производства «HiMedia Laboratories Pvt. Limited», Индия. Бульон с бромкрезоловым пурпурным разливали по 5 мл в пробирки с поплавками и стерилизовали автоклавиро-ванием при 1, 1 атм в течение 10 мин. Лиофильно высушенные штаммы разводили в 1 мл стерильного физиологического раствора и 0,1-0,15 мл высевали на жидкую среду МРС-2. Инкуба О 1 St цию проводили 2 суток при 37 С. Затем выполняли разведения от 10" до 10" в стерильном физиологическом растворе и высевали на чашки с плотной средой МРС-4. Рассев выполняли с каждого разведения. Инкубировали в течение 2-3 суток при 37С в анаэробных условиях с использованием анаэростатов и газо-генерирующих пакетов GasPack (BD BBL, США). Изолированные колонии, типичные для лактобацилл, пересевали на полужидкую среду МРС-2. Через 2 суток инкубации из всех пробирок выполняли контрольные мазки, после чего культуры использовали для постановки пестрого ряда.
В состав пестрого ряда входили 14 субстратов (сахаров и многоатомных спиртов): арабиноза, целлобиоза, галактоза, лактоза, мальтоза, маннит, манноза, мелибиоза, раффиноза, салицин, сахароза, трегалоза, ксилоза, сорбит. Бульон с бромкрезоловым пурпурным засевали 2 каплями 48-часовой культуры со среды МРС-2 с: последующим; встряхиванием пробирки для лучшего размешивания.
После посева испытуемого микроорганизма в каждую пробирку асептически помещали по 1 диску с соответствующим углеводом. Посевы инкубир-рвали в течение 18-48 часов при 35-37G. Результаты учитывали через 18 и 48 часов. При выращивании- на бульоне с бромкрезоловым пурпурным образующаяся кислота способствует окрашиванию среды в желтый цвет, а газ скапливается в поплавке: Интерпретацию результатов проводили по схеме, (Приложение, таблица,2).
Изучение биохимических свойств вновь выделенных штаммов рода Lactoba-cillus
Изучение биохимических свойств лактобацилл, в частности способности ферментировать углеводы, является основой для видовой идентификации этих бактерий. В этом разделе работы-представлены данные об изучении биохимических свойств 10 штаммов 7 видов бактерий рода Lactobacillus (148 культур), выделенных в лаборатории микробиоценозов и- конструирования пробиотиков из фекалий здоровых детей первого года жизни:-L. casei 577, L. plantarum 30, L. delbrueckii 76, L. rhamnosus 1790, L.acidophilus 1660, L. casei 583, L. plantarum 1862, L. paracasei spp. paracasei 6, L. rhamnosus 7, L. rhamnosus 526. Необходимо отметить, что первичное установление способности ферментировать сахара, многоатомные спирты и гидролизовать глюкозиды и видовая идентификация этих микроорганизмов была проведена в 1990 году при их выделении с использованием доступных и актуальных на тот момент тест-систем и питательных основ: Нашей задачей являетсяг расширенное изучение биохимических свойств этих штаммов с использованием коммерческих стандартизированных тест-систем фирмы «HiMedia».
Изученные микроорганизмы относятся к двум разным биохимическим группам: виды L. delbrueckii, L.acidophilus относятся к группе гомофермента-тивных лактобацилл, а виды L. casei, L. plantarum, L. paracasei, L. rhamnosus - к группе факультативно-гетероферментативных лактобацилл. Метаболизм Сахаров у представителей этих групп принципиально отличается: в первом случае генетически детерминирован гликолитический путь, во втором — пентозофос-фатный. Гомоферментативные лактобациллы, как правило, неспособны сбраживать пентозы, что подтверждено нашими исследованиями (табл. 4).
Классическая микробиологическая схема идентификации этих видов-основана на изучении метаболизма Сахаров и представляет собой «пестрый ряд», состоящий из 16 субстратов. В результате работы нами был изучен спектр утилизируемых субстратов: углеводов, в том числе олигосахарид раффиноза, метаболизм которого вновь выделенными штаммами не был изучен ранее, многоатомных спиртов (сорбит, маннит) и глюкозидов (салицин, эскулин).
Из таблицы 4 видно, что наибольшее количество субстратов утилизируют лактобациллы, принадлежащие к группе факультативно-гетероферментативных лактобацилл. Это связано с тем, что гомоферментативные лактобациллы неспособны сбраживать, пентозы, а гетероферментативные микроорганизмы обладают двумя путями метаболизма Сахаров, при этом сбраживание гексоз происходит по гликолитическому пути, а пентоз — по окислительному пентозофосфат-ному. При достаточном количестве гексоз их сбраживание идет по гликолитическому пути, а при снижении количества- гексоз наличие в питательной среде пентоз индуцирует синтез фосфокетолазы.
Таблица 4 Способность вновь выделенных штаммов лактобацилл к ферментации Сахаров, многоатомных спиртов и гидролизу глюкозидов; (Биохимические свойства вновь выделенных штаммов лактобацилл). Практический и научный интерес представляет изучение способности лактобацилл к утилизации раффинозы. Этот углевод относится к группе фос-фоолигосахаридов (ФОС), используется в составе пробиотических препаратов в качестве пребиотического компонента. Способность к утилизации этого олиго-сахарида зависит от наличия или отсутствия специфических гликозилгидролаз. Раффинозу утилизировали штаммы, относящиеся к виду L. plantarum и L.acidophilus, у видов L. casei, L. paracasei, L. delbrueckii утилизации этого оли-госахарида не наблюдалось.
При проведении видовой идентификации по спектру изученных свойств возникли трудности при дифференциации видов L. casei, L. paracasei spp. paracasei и L. rhamnosus, так как их биохимические свойства сходны, отличием является лишь способность к росту при 15 и 45 С. Подобные сложности при использовании биохимического метода обуславливают актуальность разработки альтернативных методов идентификации на основе молекулярно-генетических характеристик. Кроме того, использование этого метода идентификации при работе со смешанной популяцией микроороганизмов ограничено тем, что, после высева пробы жидкой культуры на плотную питательную среду, для уста-новеления соотношения бактерий двух разных видов необходимо выделить чистую культуру и исследовать все колонии; выросшие на поверхности среды, что существенно увеличивает экономические и трудовые затраты. Поэтому актуальным вопросом является поиск более эффективного метода для-решения поставленной задачи.
Полимеразная цепная реакция давно с успехом применяется для решения целого спектра теоретических и прикладных задач в генетике, микробиологии, эпидемиологии. При соблюдении всех необходимых мер по предупреждению контаминации, ПЦР обладает рядом неоспоримых преимуществ - высокой специфичностью, быстротой исполнения, возможностью полной автоматизации процесса. Удобен этот метод для работы с бактериями; культивирование которых in vitro представляет определенные трудности. Индикация, типирование и изучение определенных свойств таких микроорганизмов с помощью ПЦР является одним из альтернативных методов, применяемых в практическом здравоохранении и биотехнологическом производстве [68].
В последние годы подобные молекулярно-генетические- технологии активно применяются -не только для диагностики ряда инфекционных и соматических заболеваний. Разрабатываются методики на основе ПЦР и ее модификаций для уточнения таксономического положения и филогенетических связей, индикации, идентификации, промышл енно значимых микроорганизмов, в том-числе и-молочнокислых, использующихся в.биотехнологии [24; 31].
Индикация и идентификация молочнокислых бактерий классическими биохимическими методами затруднена, так как стандартизированные диски с углеводами и питательные среды, производимые фирмой «HIMEDIА» и биохимическая тест-система Арі 50 CHL, фирмы «BioMerieux», достаточно дороги. Экспериментально созданные- отечественные тест-системы для видовой идентификации» лактобацилл в виде систем индикаторных бумажных (СИБ) или планшетов биохимических дифференцирующих (ПБД) не получили распространения; и сейчас не производятся. Необходимо отметить, что классический, метод идентификации по биохимическим свойствам предусматривает выделение чистой культуры и, соответственно, занимает достаточно длительный отрезок времени (до 8 суток), вследствие этого не совсем удобен для практических лабораторий и, тем более, не удовлетворяет требованиям текущего оперативного контроля продуктов питания.
