Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Подходы к изучению микроорганизмов в их естественных местах обитания.. 8
1.2. Требования к методам изучения микроорганизмов в их естественных местах обитания 10
1.3. Проблема оценки жизнеспособности клеток микроорганизмов в исследованиях 11
1.4. Применение методов световой микроскопии в изучении микроорганизмов in situ 12
1.5. Применение методов люминесцентной микроскопии в изучении микроорганизмов ex situ и in situ 14
1.6. Применение методов электронной микроскопии в изучении микроорганизмов ex situ и in situ 17
1.7. Применение молекулярно-биологических методов в изучении микроорганизмов in situ 19
1.8. Культуральные методы оценки микробной компоненты экосистем 20
1.9. Аналитические методы оценки микробной составляющей экосистем 22
1.10. Заключение обзора литературы 23
Экспериментальная часть 25
Глава 2. Материалы и методы 25
2.1. Объекты исследований 25
2.1.1. Керны льда из ледового щита Антарктиды над озером Восток 25
2.1.2. Осадочные многолетнемёрзлые породы 27
2.1.3. Нефтешламы Нижнекамского нефтехимического комбината 28
2.1.4. Гидротермальные источники Камчатки 29
2.2. Питательные среды, использованные для культивирования микроорганизмов 30
2.3. Микроорганизмы и условия их культивирования 32
2.4. Определение динамики роста культуры Bacillus subtilis : 32
2.5. Методы световой микроскопии 33
2.6. Методы электронной микроскопии 34
2.6.1. Методы препарирования и контрастирования материала 34
2.6.2. Определение элементного состава 35
2.6.3. Приготовление ультратонких срезов 37
2.6.4. Электронно-микроскопическая криофрактография 38
2.7. Молекулярно - биологические методы 39
2.7.1. Выделение хромосомной ДНК 39
2.7.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) гена 16S рДНК 41
2.7.3. Электрофорез в агарозном геле 41
2.7.4. Очистка продукта ПЦР и определение количества ДНК 42
2.7.5. Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рДНК 42
2.7.6. Создание библиотек клонов 42
2.7.7. Филогенетический анализ 43
2.8. Измерение интенсивностей процессов хемо- и фото-синтеза 43
2.9. Измерение физико-химических параметров 45
2.9.1. Определение окислительно-восстановительного потенциала 45
2.9.2. Определение газового состава гидротерм 45
2.9.3. Определение катионно-анионного состава гидротерм 45
Глава 3. CLASS Результаты и обсуждение CLASS 46
3.1. Разработка и применение метода экспресс-дифференциации биогенных/абиогенных микрообъектов 47
3.1.1. Обобщение литературных данных по элементному составу бактерий и расчёт области «биогенного» 47
3.1.2. Определение диапазонов содержания элементов в клетках с различным физиологическим состоянием 50
3.1.2.1 Изменение ультраструктуры и элементного состава в клетках Bacillus subtilis в цикле со спорообразованием 51
3.1.2.2. Изменение ультраструктуры и элементного состава в клетках Bacillus subtilis в цикле с формированием цистоподобных клеток 58
3.1.3. Анализ кернов атмосферного льда с ледникового щита Антарктиды над озером Восток на присутствие микробной компоненты 64
3.2. Модификация и применение метода низкотемпературного фракционирование микроорганизмов из образцов с большим содержанием минеральной компоненты 69
3.2.1. Модельное низкотемпературное фракционирование 70
3.2.2. Низкотемпературное фракционирование микроорганизмов из грунтов криолитозоны 71
3.2.2.1. Анализ ультратонких срезов и криосколов фракций клеток, полученных методом низкотемпературного фракционирования микроорганизмов 74
3.3. Разработка и применение метода субстратных агаровых каналов 79
3.4. Модификация и применение метода «микромонолитов» 96
3.4.1. Изучение структурно-функционального состояния бактерий в нефтешламовых «микромонолитах» 97
3.4.1.1. Выявление и исследование бактерии Kaistia adipata из нефтешламов 103
3.4.2. Изучение структурно-функционального состояния бактерий в циано-бактериальных обрастаниях и матах термальных источников ПО
3.4.2.1. Изучение структурно-функционального состояния бактерий в циано-бактериальном мате подножия гейзера Великан 111
3.4.2.2. Цитологическая и таксономическая характеристика циано-бактериальных сообществ гидротерм Восточного термального поля (Узон) 118
3.4.2.2.1. Характеристика микробной компоненты из источника О... 121
3.4.2.2.2. Характеристика микробной компоненты из источника Р... 129
3.4.2.2.3. Характеристика микробной компоненты из источника X... 132
3.4.2.2.4. Характеристика микробной компоненты из источника Л... 137
3.4.2.2.5. Характеристика микробной компоненты из источника П... 140
Заключение 144
Выводы 145
Библиографический список 146
Список условных сокращений 162
- Применение методов люминесцентной микроскопии в изучении микроорганизмов ex situ и in situ
- Методы световой микроскопии
- Обобщение литературных данных по элементному составу бактерий и расчёт области «биогенного»
- Анализ ультратонких срезов и криосколов фракций клеток, полученных методом низкотемпературного фракционирования микроорганизмов
Введение к работе
До конца ХХ-го столетия основные усилия микробиологов были направлены на изучение ультраструктурной организации микроорганизмов ex situ, т.е., при культивировании микроорганизмов в лабораторных условиях.
Были выявлены общие диагностические критерии, позволяющие характеризовать на уровне ультраструктуры физиологическое состояние исследуемого микроорганизма. Однако, ряд исследователей указывал на закономерную связь физиологии, клеточной ультраструктуры и экологии изучаемых микроорганизмов (Холодный, 1935; Новогрудский, 1949; Перфильев с соавт., 1961). Только во второй половине двадцатого века начали появляться единичные работы по изучению зависимости ультраструктурной организации клеток микроорганизмов и форм их обитания in situ, то есть, исследование микроорганизмов непосредственно извлечённых из их естественной среды обитания (Никитин с соавт., 1962; Аристовская, 1962; Звягинцев, 1962, 1987; Bae et al., 1973; Balkwill et al., 1975; Amelio et al., 1987). Применённый Никитиным с соавт. метод прямой электронной микроскопии для изучения водных микроорганизмов, без предварительного культивирования, позволил открыть новые морфологические формы микроорганизмов и, как оказалось впоследствии, и новые таксоны (Никитин с соавт., 1962). Бае с соавт. применили метод фракционирования для отделения клеток микроорганизмов от почвенных частиц, затем полученную фракцию клеток изучили на ультратонких срезах в электронном микроскопе. Эти исследования показали наличие серьёзных отличий в ультраструктуре клеток, непосредственно извлечённых из грунта, по сравнению с бактериями из лабораторных культур (Bae et al., 1973). Подробное изучение структурно-функционального статуса микроорганизмов в их естественных местах обитания начали проводить сравнительно недавно (Дмитриев с соавт., 1997, 2001, 2004; Вишневецкая, 2002; Розанов, 2002; Wierzchos et al., 2004; Lacap et al, 2005; Дуда с соавт., 2007). Дмитриевым с соавт. было показано, что - в криогрунтах Восточной Сибири, находящихся в зоне вечной мерзлоты, присутствуют жизнеспособные про- и эукариотные микроорганизмы, для которых основной формой покоя являются цистоподобные клетки (Дмитриев с соавт., 1997, 2001, 2004). Современные работы, посвященные исследованию микроорганизмов in situ, с помощью подходов электронной микроскопии показывают, что определяющим и являются методы подготовки проб из исследуемых образцов.
Проведение электронно-микроскопических исследований микроорганизмов и их сообществ в образцах окружающей среды связано с рядом проблем методического плана: 1) некоторые природные среды, такие как криогрунты или вода олиготрофных водоёмов, содержат относительно мало клеток, что делает их прямую визуализацию затруднительной; наличие минеральных образований, морфологически сходных с микробными клетками, затрудняет интерпретацию изображений; 2) минеральная компонента многих образцов не
позволяет получать ультратонкие срезы и «маскирует» микробные клетки, 3) для корректной характеристики микробных сообществ с высокой численностью клеток, таких, как бактериальные маты, требуется получить информацию не только о типах входящих в них клеток и их физиологическом состоянии, но и об их естественной пространственной организации.
Таким образом, различное соотношение содержания в образцах микроорганизмов и минеральной компоненты делают невозможной стандартизацию подготовки проб для электронно-микроскопического анализа. Поэтому совершенствование известных и разработка новых методических приёмов для исследования структурно-функционального состояния бактерий в микробных сообществах является актуальным.
Цели и задачи исследования. Усовершенствовать известные и разработать новые методы для изучения структурно-функционального состояния бактерий, в микробных сообществах. Для выполнения этой цели поставлены следующие задачи:
разработать метод экспресс-дифференциации биогенных/абиогенных
микрообъектов;
усовершенствовать метод низкотемпературного фракционирования и концентрирования микроорганизмов, разработанный ранее для дрожжей, и адаптировать его для бактерий;
разработать метод, позволяющий наблюдать за изменениями в структурно-функциональном состоянии «замаскированных» бактерий из уникальных природных образцов;
усовершенствовать метод «микромонолитов» для максимального сохранения нативной ультраструктуры микроорганизмов в сообществах.
определить эффективность совместного применения микроскопических и молекулярно-биологических методов при исследовании микробных сообществ в различных экосистемах.
Научная новизна. Разработан метод экспресс-дифференциации на основе рентгеновского микроанализа, позволяющий обнаруживать биогенные микрообъекты и определять их вероятное физиологическое состояние в различных природных образцах.
Разработан метод субстратных агаровых каналов. Этот метод позволил в динамике, на ультраструктурном уровне, наблюдать за развитием «замаскированных» ультратонкими минеральными компонентами бактерий из криогрунтов Восточной Сибири.
Усовершенствован метод низкотемпературного фракционирования клеток, что позволило увеличить численность и морфологическое разнообразие клеток, извлекаемых из криогрунтов Восточной Сибири.
Модифицирован метод «микромонолитов». Данная модификация позволяет минимизировать влияние механических воздействий на пространственную организацию микроорганизмов в биоплёнках, бактериальных обрастаниях, циано-бактериальных матах в отобранных и подготовленных для ультратонких срезов образцах. Благодаря использованию этого метода была обнаружена, а затем выделена в чистую культуру бактерия, формирующая наноклетки. С помощью этого метода была описана ультраструктура и пространственная организация клеток данной бактерии в естественных условиях обитания.
Практическая значимость. Предложенные методы позволяют проводить изучение структурно-функционального состояния микроорганизмов в природных микробных сообществах без выделения в чистые культуры.
Используемые в данной работе подходы к электронно-микроскопическому изучению микроорганизмов можно использовать для проведения экологического мониторинга состояния экосистем независимо от их геологической (минеральной) матрицы и количественного содержания в них микроорганизмов.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - Наука XXI века» (Пущино, 2003), Всероссийской молодёжной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), И-ой международной молодёжной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006), Международной научной конференции «Современные экологические проблемы севера» (Апатиты, 2006), 17th Evergreen International Phage Biology Meeting (Olympia, 2007), 2-ой Байкальский микробиологический симпозиум с международным участием (Иркутск, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статей и 6 тезисов.
Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнялась в лаборатории классификации и хранения уникальных форм микроорганизмов ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, в отделе Всероссийской коллекции микроорганизмов и лаборатории структурно-функциональной адаптации микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН, Пущино.
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 165 страницах машинописного текста и включает 97 рисунков и 12 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей описание материалов и методов, результатов и обсуждения исследования, выводов и библиографического списка, который содержит 195 наименований.
Применение методов люминесцентной микроскопии в изучении микроорганизмов ex situ и in situ
Применению люминесцентной микроскопии для изучения микроорганизмов in situ предшествовал достаточно длительный этап экспериментов, проводимых ex situ (Звягинцев, с соавт. 1978; Kepner et al., 1994). Это связано с изучением свойств флуорохромов и специфики их взаимодействия с клеточными компонентами микроорганизмов.
В 1911 г. Карл Райхерт сконструировал модель биологического флуоресцентного микроскопа. Следующей важной вехой в развитии люминесцентной микроскопии явились работы М. Хайтингера (1933 — 1935 гг.). Он показал возможность и пути применения в микроскопии флуоресцирующих красителей - флуорохромов (Мейсель, 1971). Таким образом, благодаря флуорохромам появилась возможность контрастировать клетки. Однако, в первой половине XX века большее внимание исследователей было уделено изучению типов взаимодействий красителей с различными компонентами клеток. В частности, акридиновый оранжевый является интеркалятором нуклеиновых кислот. Как показали в своей работе М.Н. Мейсель и В.Б. Корчагин, экстрагированная ДНК, связываясь с акридиновым оранжевым, светится ярко зелёным цветом, а комплекс молекул РНК с пептидами - красным цветом (Мейсель с соавт. 1952, 1959). С помощью акридинового оранжевого проводили наблюдение динамики распределения нуклеоидов в дочерних клетках (Bisset et al., 1978). Помимо широко распространенного акридинового оранжевого стали применять и другие флуорохромы, избирательно связывавшиеся с определёнными клеточными компонентами (табл. 1). По наличию и состоянию клеточных компонентов определяли функциональный статус микроорганизмов. Например, используя комплексную окраску примулином и акридином оранжевым, определяли количество живых и мёртвых микроорганизмов (Мейсель, 1953, с соавт., 1961; Зубжицкий, 1964). Иванов В.Б. и Барский В.Е. предложили использовать проционовые красители для цитохимических исследований белков (Барский с соавт., 1968, Иванов, 1976). Одним из первых, эффективно применяемых красителей проционового ряда, был дихлортриазиниламинофлуоресцеин, хромофорной группой которого является флуоресцеин.
Микробные липиды, содержащие насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, также могут быть окрашены флуорохромами. Наилучший результат в дифференциации насыщенных и ненасыщенных жирных кислот проявляет нильский синий (Мейсель, 1971).
По характеру взаимодействия красителя с соответствующими структурами клетки, флуорохромы могут быть разделены на две группы. Красители первой группы флуоресцируют, специфически связываясь с соответствующими компонентами клетки. Чаще всего это белки, нуклеиновые кислоты. В этом случае не важно, метаболически активна клетка или нет. К первой группе относятся такие красители, как акридин оранжевый, (4 , 6-диамидино-2-фенил индол) DAPI, (флуоресцеин изотиоцианат) FITC, (5-(4, 6- дихлортриазин-2-ил), амино-флуоресцеин) DATF (Мейсель, 1959; Coleman, 1989; Vanelsas et al., 1991; Kepner et al., 1994; Нетрусов, 2004). Красители второй группы начинают флуоресцировать только после их метаболической модификации внутри клетки. Таким образом, с помощью красителей этой группы выявляются физиологически активные микробные клетки. Ко второй группе — относятся такие красители, как (флуоресцеин диацетат) FDA, (5-(и 6-) сульфофлуоресцеиндиацетат) SFDA (Lundgren, 1981; Нетрусов, 2004).
Разновидностью люминесцентно-микроскопических методов являются иммунофлуоресцентные методы. В этом подходе используют антитела, несущие флуоресцентную метку, которые связываются с клетками из образца имеющими компетентные антигены. С помощью этого метода можно учесть только те микроорганизмы, к которым были приготовлены антитела, то есть микроорганизмы, выделенные в чистую культуру (Schmidt et al., 1965, 1968, 1974; Pugsley et al., 1975; Гальченко, 2001). Благодаря этим работам была показана локализационно-топографическая картина клеток микроорганизмов в естественных местах обитания, выявлены закономерности роста клеточных стенок у разных видов микробов (Bisset et al., 1978; Гальченко, 2001). В современных исследованиях люминесцентную микроскопию используют для выявления и количественного учёта микроорганизмов в естественных субстратах (Kepner et al., 1994). Наиболее популярными в исследованиях микроорганизмов из окружающей среды являются красители DAPI, связывающийся с ДНК клеток и Live/Dead, состоящий из двух компонентов - пропидиум йодида и SYTO 9, которые связываются с ДНК в зависимости от физиологического состояния клетки (Berney et al., 2007). Если -клетка жива и физиологически активна, то она окрашивается компонентом красителя SYTO 9 (зелёным), а если клетка погибшая, то оставшаяся ДНК связывается с пропидиумом йодидом и клетка светится красным цветом (Berney et al., 2007).
Своеобразной революцией в области развития люминесцентной микроскопии было создание олиго- и полинуклеотидных зондов с «пришитыми» к ним люминесцентными метками (Amann et al., 1995) - FISH (флуоресцентная in situ гибридизация). Таким образом, одновременно используя олигонуклеотидный зонд, меченый флуорохромом, исследователи получили возможность отслеживать определенные таксоны микроорганизмов в различных эконишах. Несмотря на наличие пока серьёзных ограничений, этот метод является важнейшим мостиком между зачастую безликой макроструктурой (палочка, кокк, спирилла) и таксономическим статусом микроорганизмов. Существенным ограничением данного метода является прохождение реакции между зондом и комплементарной нуклеотидной последовательностью в вегетативных клетках, имеющих большое количество копий целевых генов. Остальные же компоненты сообщества, находящиеся в ином физиологическом состоянии, то есть с меньшим числом копий комплементарных последовательностей, или относящиеся к другим таксонам, остаются невыявленными (Amann et al., 1995).
Методы световой микроскопии
Метод фазово-контрастной микроскопии использовали: 1) для контроля наличия клеток в промежуточных и конечных супернатантах и осадках, полученных методом низкотемпературного фракционирования; 2) при описании колоний и характеристике составляющих их микроорганизмов; 3) при определении наличия клеток в нефтешламах и вечномёрзлых грунтах; 4) при поиске и выделении культуры Kaistia adipata штамм NF1; 5) при контроле модельных культур в период построения кривой роста и отбора точек для электронной микроскопии.
Использовали микроскопы марок: OPTON ICM 405, МЛ-2 (ЛОМО), Jenaval interphako (CarlZeiss, Jena), Axiolmager Dl (Carl Zeiss, Jena). Препараты просматривали при общем увеличении ХІ000.
Метод люминесцентной микроскопии использовали: 1) при контроле физиологического состояния клеток в модельных культурах при построении кривой роста и отбора точек для электронной микроскопии и рентгеновского микроанализа; 2) при изучении культур и микроорганизмов в образцах.
В качестве красителей использовали: акридиновый оранжевый; комплексный краситель Live/Dead (BacLigth Bacterial Viability Kit) и DAPI. Приготовление подложек для сеток. Для изучения бактерий в электронном микроскопе использовали медные сеточки (тип А4), покрытые укреплённой углеродом формваровой подложкой. Нанесение формваровой подложки осуществляли следующим образом. В узкий стакан с 0,025% формваром в дихлорэтане погружали полоску стекла толщиной 6 мм и длинной 15 см на глубину 3 см. Затем стекло извлекали и осушали уголком на фильтровальной бумаге. После этого, плёнку, образовавшуюся на стекле, слегка подсушивали (1-2 минуты, при комнатной температуре). Готовую плёнку, покрывающую стекло прорезали острым лезвием по периметру. Затем стекло с плёнкой под углом примерно «25-30 медленно и аккуратно погружали в широкую ёмкость с деионизованной водой. При постепенном погружении в воду, срезанная по периметру плёнка, сползает на поверхность воды. Таким образом, получатся плотик из формаровой плёнки одинаковой толщины. Далее на этот плотик укладывали медные сеточки. После полного заполнения плотика сеточками, его вылавливали фильтровальной бумагой. Сеточки с подложкой сушили в течение 12 часов. После полного высыхания сеточки с подложкой напыляли в вакуумном посте JEE-4B (JEOL, Япония) углеродом (рис. 5). После напыления сеточки деионизовали в той же установке для снятия статического заряда.
После этого на сеточку наносили каплю красителя и выдерживали от 30 секунд до 1 минуты. Избыток жидкости оттягивали фильтровальной бумагой. После высушивания в течение 15-30 минут образец просматривали в электронный микроскоп. В качестве красителей использовали: фосфорновольфрамовую кислоту (ФВК) с концентрацией 0,1 -0,01%; уранил ацетат водный (УА) с концентрацией 0,02 - 0,1%.
Приготовление тотального препарата для сканирующего режима. Клетки перед нанесением на сеточку трижды промывали, путём ресуспендирования в деионизованнои воде с дальнейшим центрифугированием 5-10 мин при скорости 5-8 тыс. Микроорганизмы из природных образцов наносили на сетки без дополнительного промывания. После нанесения материала на сетки их подсушивали и просматривали в электронный микроскоп JEM 100CXII (JEOL, Япония) со сканирующей приставкой EM-ASID4D в сканирующем режиме при ускоряющем напряжении 60 кВ.
Для определения элементного состава клеток микроорганизмов и минеральных частиц используется рентгеновский микроанализатор LINK-860 с детектором Е5423 (Link-System, Великобритания), подключённый к электронному микроскопу JEM 100СХІІ (JEOL, Япония).
Обсчёт данных по элементному составу. Расчёт относительного содержания биогенных элементов проводили по значениям площадей пиков, спектров элементов получаемых с помощью детектора Е5423. Обсчёт проводили по спектрам примерно бактериальных клеток. 1 Данная часть работы была выполнена совместно с Сорокиным В.В., за что автор выражает глубокую благодарность. Для анализа использовали клетки модельной культуры Bacillus subtilis в различном физиологическом состоянии: вегетативные, клетки с проспорами, споры, цистоподобные клетки, лизированные клетки, мёртвые клетки с белковыми кристаллами. Полученные данные обрабатывали в программе Excel, Windows ХР Professional. Алгоритм обсчёта полученных данных следующий.
1. Из 30 значений спектров по каждому элементу рассчитывали среднее арифметическое значение по формуле: у = ——, где х; - значение площади пика детектируемого элемента (например, натрия), пзо - количество набранных спектров (пзо=30).
2. Рассеяние случайной величины относительно среднего значения, характеризуют дисперсией, которую рассчитывали по формуле: т2 = — . п — \
отклонение: а = 4. Определяем стандартное отклонение среднего результата: а — —= .
3. Вычисляем среднеквадратичную ошибку или выборочное стандартное
5. Проводим проверку выпадающих результатов измерений Fmax =
6. Определяем точность среднего результата (вероятная абсолютная погрешность), при значении а=0,95. Тогда єа= а,к- усреднее5 где а - надёжность, к=п-1.
7. Устанавливаем с той же надёжностью интервальные значения среднего результата: у±га.
8. Вероятность содержания системной ошибки в методе будет меньше, если ц не будет выходить за пределы установленного интервала. Единичное отклонение — отклонение отдельного измерения от среднего арифметического: хгу. Допустим, что все измерения проводили с одинаковой точностью и тщательностью, тогда они называются равноточными. Тогда ц у, где JJ. -истинное относительное содержание определяемого элемента.
9. Относительная погрешность среднего результата с установленным а определяется как єа-100%/а (Бейли, 1970).
Обобщение литературных данных по элементному составу бактерий и расчёт области «биогенного»
Известно, что клетки состоят из определённого набора элементов. Эти элементы делят на две основные группы: макроэлементы и микроэлементы. К макроэлементам относят: водород, кислород, углерод, азот, натрий, фосфор, серу, калий и кальций, которые принято считать биогенными. К микроэлементам относят: кобальт, железо и другие металлы, являющиеся кофакторами многих ферментов (Элиот, 2002). Чаще всего при изучении элементного состава клеток микроорганизмов, изучают относительное количество и соотношения, биогенных элементов, которые характеризуют конкретное физиологическое состояние клетки.
С помощью рентгеновского микроанализа был исследован элементный состав клеток следующих культур: Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Hyphomicrobium vulgare, Caulobacter bacteroides, Flectobacillus major, Escherichia coli, Arthrobacter globiformis и др. (Screrrer et al., 1987; Norland et al., 1995; Мулюкин с соавт., 2002; Никитин с соавт., 1998).
В проанализированной литературе была выявлена некоторая мозаичность в проводимых исследованиях. В опубликованных работах, приведён элементный состав клеток в каком-то одном физиологическом состоянии (например, споры) и совсем не упоминается о клетках того же организма в других физиологических статусах (например, лизированных, вегетативных в экспоненциальной фазе, в стационарной фазе, формирующих споры). Кроме этого, в разных работах данные по элементному составу приводятся в различных условных единицах (Screrrer et al., 1987; Norland et al., 1995; Никитин с соавт., 1998).
Лишь в недавней работе Мулюкина с соавт. рассматривался элементный состав микробных клеток в различных физиологических состояниях с одновременно подробным анализом ультраструктуры исследованных микроорганизмов (Мулюкин с соавт., 2002). В этой работе были определены: элементный состав и ультраструктурные особенности, характеризующие физиологический статус микроорганизмов. Для вегетативных клеток, характерны: гранулярная цитоплазма, деконденсированный нуклеоид, утончённая клеточная стенка; высокие показатели соотношения пик/фон для кальция и меньшее для калия и серы, характерно высокое содержание фосфора. Для спор - наличие всех необходимых споровых структур; соотношение пика кальция к фону максимальное по сравнению со всеми другими измерениями, уровень фосфора гораздо ниже, чем у вегетативных клеток, содержание калия приближается к минимуму. Для цистоподобных клеток - крупногранулярная плотная цитоплазма, утолщённые и уплотнённые клеточные оболочки, конденсированный нуклеоид, увеличенное периплазматическое пространство; содержание элементов по соотношению величин пика к фону по кальцию достоверно выше, чем у вегетативных клеток, а уровни калия и фосфора ниже. Для лизированных клеток - отсутствие цитоплазмы и цитоплазматической мембраны, рыхлая клеточная стенка; элементный состав не учитывали. Для нежизнеспособных «микромумий» - отсутствие мембранных структур (утрата барьерных функций) на фоне сохранения целостности остальных клеточных компонентов; по элементному составу наблюдали в целом пониженный уровень содержания элементов (крайне низкий уровень калия, снижение уровня фосфора, как у покоящихся клеток), лишь уровень кальция был выше, чем у вегетативных клеток (Мулюкин с соавт., 2002).
В этой и других работах, данные об изменениях элементного состава (содержание отдельных биогенных элементов и их соотношениям кальций/калий, фосфор/сера) предполагалось использовать в качестве дифференцирующих признаков при оценке происхождения микрообъекта: биогенный или абиогенный. В случае же его биогенного происхождения определять его возможный физиологический статус. Осуществление такого способа дифференциации микрообъектов из природных источников был бы сопряжён с рядом трудоёмких и длительных задач.
1. Создание достаточного массива данных по элементному составу микроорганизмов лабораторных культур.
2. Трудности в сопоставлении с данными, полученными другими авторами.
3. Проблемы в использовании массива данных представленного в виде соотношений элементов.
Кроме этого, предлагаемый ими алгоритм был достаточно сложным в применении и не позволял использовать уже существующие данные по элементному составу бактерий. Для эффективного использования метода рентгеновского микроанализа, применительно к скринингу микрообъектов в природных образцах необходимо было переработать имеющуюся информацию, то есть создать единый массив данных по элементному составу бактерий из имеющихся в литературе. Для этого площади пиков биогенных элементов нормировали к сумме площадей пиков всех элементов. Впервые такой тип нормировки к содержанию элементов в клетке предложил Никитин Д.И. с соавторами (Никитин, с соавт., 1993). Таким образом, литературные данные по элементному составу бактерий представляем в виде процентов к сумме содержания биогенных элементов (табл. 6).
Таблица 6. Содержание биогенных элементов в бактериях, представленное в литературе. На основании этих данных был построен общий график, на котором были определены минимальные и максимальные значения содержания биогенных элементов (рис. 10).
Рисунок 10. Суммарные значения содержания биогенных элементов в бактериальных клетках по литературным данным. 1 - максимальные значения, 2 - минимальные значения.
Было установлено, что если элементный состав природного микрообъекта попадает в обозначенную область между кривыми 1 и 2, то данный микрообъект можно считать объектом биогенного природы. Если элементный состав микрообъекта выходит за пределы коридора между кривыми 1 и 2, то данный микрообъект можно считать абиогенным. 3.1.2. Определение диапазонов содержания элементов в клетках с различным физиологическим состоянием
В развитие метода было проведено исследование около 180 клеток бактерии Bacillus subtilis в различных стадиях развития, в том числе со спорообразованием и формированием цистоподобных клеток.
В качестве модели была выбрана культура Bacillus subtilis штамм ВКМ В-720. Выбор данной культуры обоснован следующими причинами:
1) высокая степень изученности;
2) культура способна осуществлять два типа жизненных циклов (со спорообразованием и с формированием цистоподобных рефрактерных клеток) (Дорошенко с соавт., 2001; Цыганкова с соавт., 2004).
3) по бактериям из этого рода уже проводили исследования элементного состава;
4) является широко распространенным микроорганизмом.
Были исследованы клетки в следующих физиологических состояниях: вегетативные, вегетативные стационарные с проспорами, споры, покоящиеся цистоподобные, лизированные, мёртвые с кристаллами. Условия инокулирования и культивирования указаны в Разделе 2 Материалы и методы. В ходе проведения модельных экспериментов бактериальные культуры выращивали в периодической культуре от фазы инициации до фазы отмирания (рис. 11 а, б).
Анализ ультратонких срезов и криосколов фракций клеток, полученных методом низкотемпературного фракционирования микроорганизмов
Электронно-микроскопический анализ ультратонких срезов и криосколов фракций клеток нативных микроорганизмов извлечённых из образца 11/89 показал следующую картину.
В образце найдены целостные бактериальные клетки (рис. 23). Судя по сохранности клеточных структур: ненарушенной цитоплазматической мембраны, внешней мембраны (у грамотрицательных бактерий); цитоплазмы; нуклеоида, а также в некоторых случаях по наличию делящихся клеток можно предположить, что они являются жизнеспособными.
Многие целостные клетки обладали толстыми слоистыми клеточными стенками и дополнительными капсулярными оболочками, различающимися по электронной плотности. Толщина таких клеточных покровов варьировала от 0,15 до 0,2 мкм (рис. 23). Наружные оболочки разделены на две зоны. Первая зона являющаяся электроно-прозрачной сходна с бактериальными слизями, которые плотно прилегают к клеточной стенке бактерий. Вторая зона обладает большей электронной плотностью и в ней просматривается фибриллярная структура материала капсулы. На внешней поверхности капсулы сорбированы или включены внутрь электронно-плотные гранулы и кристалловидные частицы, а так же пластинки, вероятно, глинистых минералов. Эти минеральные компоненты очень прочно связаны с капсулой, так как не удаляются после многократных обработок клеток ультразвуком. Таким образом, эти клетки заключены в органо-минеральный «саркофаг» (рис. 23).
Подобные формы клеток были описаны ранее Бае и Касида (Bae et al., 1972, 1973), во фракциях клеток из современных почв США. Авторы предположили, что эти образования являются цистами азотобактера. Однако, без проведения соответствующей таксономической характеристики обнаруженных микроорганизмов нельзя относить их к какому-либо таксону. Позднее Зекман и Касида показали, что псевдомонады обитающие в почве, способны формировать цистоподобные формы (Zechman et al., 1982).
В работе В.В. Дмитриева с соавт. были описаны клетки с подобными клеточными оболочками. На основе определённых характеристик: 1)отсутствие признаков деления; 2) наличие крупных капсулярных слоев; 3) структурное состояние мембран и цитоплазмы, обнаруженные клетки авторы отнесли к цистоподобным формам бактерий (Дмитриев с соавт., 2001).
Опираясь на-критерии, перечисленные Дмитриевым В.В. с соавт. был проведён дополнительный анализ фракций клеток методом криоскалывания. Одним из показателей жизнеспособности микробных клеток является ультраструктура цитоплазматической мембраны, в частности размер, распределение и количество внутримембранных частиц (ВМЧ) (рис. 29 а, б).
Изучение криосколов позволило выявить внутримембранные частицы на PF - и EF поверхностях сколов цитоплазматической мембраны нативных клеток. Внутримембранные частицы - это протеиновые и липопротеиновые комплексы, включённые в цитоплазматическую мембрану и выполняющие различные жизненно важные функции. В клетках лабораторных культур, находящихся на стадии экспоненциального роста многочисленные внутримембранные частицы равномерно распределены по PF - и EF - поверхностях цитоплазматической мембраны. Размеры внутримембранных частиц »150 .В процессе искусственного введения клеток в покоящееся или голодающее состояние, внутримембранные частицы укрупняются, а их количество уменьшается. Часто укрупнённые внутримембранные частицы сгруппированы в виде отдельных очагов или "островков". Это было показано при изучении Micrococcus luteus и Artbrobacter globiformis в модельных условиях (Ратнер с соавт., 1986; Сузииа с соавт., 2001; Мулюкин с соавт., 1996 а).
Для многих клеток, выделенных из грунтов криолитозоны, было характерно наличие укрупненных внутримембранных частиц (200-250 ) и их количество было небольшим (рис. 24). Сравнивая полученные результаты с литературными данными можно предположить, что в условиях криосферы большинство клеток находиться в состоянии покоя. Кроме того, цитоплазма исследуемых бактерий имела мелкозернистую структуру, что так же характерно для покоящихся клеток и согласуется с литературными данными (Дмитриев с соавт., 2001).
В исследуемых образцах крайне редко встречались споры бактерий. Это подтверждается литературными данными о том, что в северных районах наблюдается малое количество спорообразующих бактерий (Мишустин с соавт., 1974). Рисунок 24. Вид криосколов клеток бактерий, изолированных методом низкотемпературного фракционирования микроорганизмов. ВМЧ - внутримембранные частицы; PF - выпуклая поверхность скола; EF - вогнутая поверхность скола; ВС -внутренний слой; НС - наружный слой. Существенным фактом в результатах электронно-микроскопического исследования является то, что большинство нативных обнаруженных клеток имеют размеры 0,2-0,4 мкм. При этом бактерии, выращенные на питательных средах, приобретали обычные бактериальные размеры (0,5-2 мкм). Эти данные согласуются с точкой зрения Д.И. Никитина, Д.Г. Звягинцева и Новогрудского Д.М., что для почвенных бактерий характерна "карликовость" (Новогрудский, 1949; Никитин с соавт., 1964, 1966; Звягинцев, 1978).
Основные морфологические формы бактерий в исследуемом образце представлены кокками, палочками, реже коринеоподобными формами (неправильными палочками).
Нативные эукариотические организмы (дрожжи) встречаются во фракциях достаточно редко. Они обладали плеоморфной структурой, часто с нарушенными поверхностными оболочками. На рисунке 25 представлен ультратонкий срез дрожжевой клетки с прикреплёнными к её поверхности минеральными частицами. Митохондриальные мембраны не имеют классического вида, что, вероятно связано с особенностями длительного хранения этого микроорганизма в условиях мерзлоты. Определить, является ли эта клетка жизнеспособной, трудно.
