Введение к работе
Актуальность проблемы. Мёрзлые подпочвенные отложения и погребённые подкурганные почвы, которые рассматриваются как закрытые, а ранее активно функционирующие системы, являются природными резервуарами длительно (тыс. -млн. лет) законсервированных сообществ микроорганизмов, хранилищами древних генов и биомолекул [Gilichinsky et al., 2008; Margesin, 2009; Демкина с соавт., 2010]. Хотя в последнее время наблюдается концентрация внимания микробиологов и специалистов смежных дисциплин на изучении выживания микроорганизмов в этих уникальных местообитаниях [Vorobyova et al., 1997; Willerslev et al., 2004; Vishnivetskaya et al., 2006; Марфенина с соавт., 2009; Zhang et al., 2013], способы длительного сохранения жизнеспособности бактерий в неростовых условиях изучены недостаточно. Вечная мерзлота и погребённые почвы отличаются как генезисом, так и условиями хранения микробных сообществ [Демкин, 1997; Gilichinsky et al., 2008], что может сказываться на механизмах и формах выживания, а также на свойствах выживших организмов. Эти механизмы должны быть связаны со стрессоустойчивостью клеток; образованием метаболически неактивных (анабиотических) покоящихся форм; способностью к лабильному изменению диссоциативного спектра популяции, аккумулирующему ее адаптационный потенциал [Loewen et al., 1994; Storz et al., 2000; Бухарин с соавт., 2005; Rondo et al., 2007; Zgur-Bertok et al., 2007]. Способность микроорганизмов переходить в неростовых условиях в покоящееся состояние реализована полиморфизмом покоящихся форм (ПФ), в том числе дормантных некультивируемых клеток (НК) [Элъ-Регистан с соавт., 1988; 2006; Kaprelyants et al., 1996; Мулюкин с соавт., 2009]. Для природных субстратов это подтверждается расчетами соотношений активной и суммарной микробной биомассы в палео- и современных почвах [Хомутова с соавт., 2004], а также данными прямого электронно-микроскопического анализа образцов вечной мерзлоты, показавшими, что подавляющая часть бактерий находится в виде цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) [Soina et al., 2004; Suzina et al., 2006; Дмитриев с соавт., 2008]. При этом популяции покоящихся клеток гетерогенны по сохранению ими пролиферативного потенциала и скорости реверсии к росту, что частично объясняет наличие образцов мерзлоты, где не выявляются колониеобразующие единицы, КОЕ=0. Поэтому для реактивации труднопрорастающих покоящихся форм и некультивируемых клеток требуются специально подобранные условия. Изучение возможных путей реактивации и свойств клеток покоящихся микробных сообществ перспективно для: 1) выявления форм и механизмов покоя; 2) теории стресса; 3) поиска новых стрессопротекторов, адаптагенов, биорегуляторов; 4) выделения новых микроорганизмов, в том числе продуцентов биологически активных веществ; 5) повышения эффективности мониторинговых исследований. Кроме того, большой интерес представляет перспектива ответить на вопрос о существовании временного предела сохранения жизнеспособности организмов. Вышеизложенное мотивирует актуальность изучения древних микробных сообществ вечной мерзлоты и подкурганных палеопочв.
Цель работы: изучить условия реактивации покоящихся микробных сообществ (на примере гетеротрофных бактерий) мёрзлых подпочвенных отложений и погребённых почв и свойства реактивированных микроорганизмов для выяснения форм и механизмов их длительного выживания в законсервированных экосистемах.
Задачи исследования.
-
Разработать приемы реактивации бактерий почвенных микробных сообществ на примере гетеротрофных мезофильных аэробных бактерий.
-
Провести сравнительный анализ результативности реактивации микробных сообществ мёрзлых подпочвенных отложений, погребённых почв, а также современных фоновых почв.
-
Определить в образцах мёрзлых отложений, погребённых и современных фоновых почв активность почвенных ферментов (на примере амилаз) как компоненты, влияющей на развитие микробиоты. Изучить возможность регуляции почвенной ферментативной активности низкомолекулярными соединениями органического вещества почвы: алкилоксибензолами (АОБ), аминокислотами (АК), гуминовыми кислотами (ГК).
-
Провести сравнительное исследование адаптационных механизмов бактерий, выделенных из мёрзлых отложений, и их коллекционных аналогов по: а) физиолого-биохимическим характеристикам и устойчивости к стрессорным воздействиям; б) интенсивности образования покоящихся форм; в) внутрипопуляционной диссоциативной активности.
-
Оценить применимость протеомного анализа бактерий методом MALDI-TOF MS для детекции диссоциантов.
Научная новизна. 1. Разработаны способы реактивации клеток из длительно законсервированных микробных сообществ мёрзлых отложений и погребённых палеопочв, учитывающие механизмы и формы метаболического покоя (анабиоза) как основного способа выживания микроорганизмов в неростовых условиях. Приемы реактивации включают: необходимость пробоподготовки образцов, отмывки от (ауто)ингибиторов роста; потребность в регуляторах физиологической активности, стрессопротекторах и факторах межклеточной коммуникации; варьирование условий культивирования. 2. Обнаружены отличия в чувствительности к процедурам реактивации бактерий покоящихся сообществ мёрзлых отложений и погребённых почв, что можно объяснить их разными генезисом и условиями природной консервации. Выявлены различия в отклике покоящихся форм на процедуры реактивации по показателям реверсии к метаболической активности (FISH) и росту (КОЕ). 3. Из образцов реактивированных микробных сообществ мёрзлых отложений выделены 16 бактериальных изолятов родов: Acinetobacter, Arthrobacter, Brevundimonas, Exiquobacterium, Paenibacillus, Promicromonospora, Pseudomonas, Rhodococcus, Sphingomonas; 8 из них определены до вида. Сравнительный анализ свойств бактерий пар сравнения - Arthrobacter oxydans шт. К14 и Acinetobacter Iwoffii шт. ЕКЗОА, выделенных из мёрзлых отложений, и их коллекционных аналогов - шт. Ас-1114 и шт. BSW-27, соответственно, выявил у изолятов из мерзлоты более
выраженный адаптационный потенциал: повышенную устойчивость к действию физических и биологических стрессоров; более интенсивное образование и полиморфизм покоящихся клеток (ЦПК, НК, ультрамелкие клетки с d<0,22 мкм); более выраженную фенотипическую вариабельность. 4. Предложен алгоритм анализа методом MALDI-TOF MS белковых спектров клеток бактерий, позволяющий выявлять диагностические различия на уровне внутрипопуляционных фенотипических диссоциантов, что может быть использовано для их детекции. 5. Выявлен эффект регуляции ферментативной активности (на примере амилаз) мёрзлых отложений, погребённых и современных почв низкомолекулярными соединениями органического вещества почвы (алкилоксибензолами, аминокислотами и гуминовыми кислотами), обеспечивающий достижение в расконсервированных почвах уровня ферментативной активности, характерного для нативного уровня в фоновых почвах, что может играть существенную роль на этапе восстановления биологической активности палеопочв.
Практическая ценность работы: 1. Разработанные способы реактивации древних микробных сообществ погребённых почв и мёрзлых отложений, обусловливающие увеличение (на 1-7 порядков) численности культивируемых на агаризованных и в жидких средах бактерий, могут быть рекомендованы для повышения результативности экологического и санитарного мониторинга, а также для поиска продуцентов биологически активных веществ, в том числе среди групп микроорганизмов, трудно изолируемых из природных субстратов. 2. Доказательства более выраженного у мерзлотных изолятов адаптационного потенциала являются основанием для скрининга среди них продуцентов метаболитов с адаптогенной и стрессопротекторной активностью. 3. Выявленные различия в белковых спектрах диссоциантов бактерий позволяют рекомендовать протеомный анализ MALDI-TOF MS для разработки методов индикации и отбора внутрипопуляционных вариантов бактерий в целях биотехнологии и медицины. 4. Обнаруженная возможность регуляции ферментативной почвенной активности может быть востребована в агротехнике.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); 10-ой Юбилейной Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» (Москва, 2009); 11th Student Conference on Conservation Science (Cambridge, UK, 2010); 10-ой международной конференции «European Workshop on Astrobiology EANA'10» (Пушино, 2010); Всероссийской конференции «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010); VI Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010); III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012). По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 статьи и 7 тезисов.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 220 страницах и состоит из введения, обзора литературы (ГЛАВА 1), экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 395 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 25 таблицами и 19 рисунками.
