Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Почва как биотоп для выживания патогенных бактерий
1.1. Роль почвы в возникновении эпидемий 10-14
1.2. Патогенные бактерии, обнаруживаемые в почвах 15-18
1.3. Факторы, определяющие выживаемость патогенных микроорганизмов в почвах 18
1.4. Coxiella burnetii и Q-лихорадка 25-31
1.5. Свободноживущие амебы и потенциально патогенные микроорганизмы 31
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 36-53
2.1. Структура исследования (модель экспериментов) 36-39
2.1.1. Определение выживаемости Coxiella burnetii в почвах 36-38
2.1.2. Обнаружение амебо-резистентных бактерий (АРБ) в почвах 38
2.2. Объекты исследования 40-42
2.2.1. Почвы, используемые для определения выживаемости Coxiella burnetii 40
2.2.2. Почвы, используемые для обнаружения АРБ 41 -42
2.3. Методы исследования 42-53
2.3.1. Методика почвенных исследований 42-44
2.3.2. Иммунофлуоресцентный анализ 44
2.3.3. Co-культура амеб 45-53
2.3.3.1. Подготовка образцов. «Российская» и «французская» методики 45
2.3.3.2. Инокуляция образцов в культуру амеб 46-47
2.3.3.3. Наблюдение за со-культурой 48
2.3.3.4. Выделение и морфологическая идентификация штаммов
2.3.3.5. Цитопатогенный эффект 49-50
2.3.3.6. Клонирование 50-52
2.3.3.7. Молекулярная идентификация изолятов 52-53
ГЛАВА 3. Выживаемость coxiella burnetii почвах
3.1. Выживаемость С. burnetii в почвах различных типов 54-55
3.2. Влияние свойств почв на выживаемость С. burnetii 56-58
ГЛАВА 4. Использование амеб для обнаружения потенциально патогенных бактерий в почвах
4.1. Разнообразие амебо-резистентных бактерий (АРБ) в почвах 59
4.2. Лизис амеб и цитопатогенные свойства изолятов 60-61
4.3. Идентификация изолятов 61 -63
4.4. Выделение нового вида 63-64
4.5. Удельная поверхность почвы и адгезия бактерий (сравнение методик) 65
ГЛАВА 5. Особенности выживания патогенных бактерий в почвах (обсуждение результатов) 72
Заключение 83-85
Выводы 86-87
Список литературы 88-102
- Патогенные бактерии, обнаруживаемые в почвах
- Структура исследования (модель экспериментов)
- Влияние свойств почв на выживаемость С. burnetii
- Удельная поверхность почвы и адгезия бактерий (сравнение методик)
Введение к работе
Актуальность темы
Теоретическая предпосылка настоящей работы - проблема сохранения в разных почвах патогенных микроорганизмов. Естественные почвы обычно обладают самоочищающей способностью (Мишустин и др., 1979). Она определяется комплексом почвенных свойств, препятствующих сохранению в почвах большинства возбудителей болезней. Однако современное техногенное воздействие на почву приводит к быстрому расширению спектра патогенных агентов человека, выживающих в объектах окружающей среды. Создание таких условий заложено в самом техническом прогрессе, когда появляются многочисленные разнообразные новые местообитания и экологические ниши, весьма благоприятные для потенциально патогенных микроорганизмов на фоне неуклонного снижения иммунных барьеров человека (Литвин и др., 1997).
Для оценки патогенной опасности почвенных объектов важно, чтобы используемый метод позволял провести быстрый и точный скрининг почвы на наличие потенциально патогенных микроорганизмов. Когда речь идет об уменьшении риска заболевания человека, именно быстрота обнаружения и точность определения патогена выходят на первый план.
Поэтому в рамках настоящей работы представлялось важным оценить почву как биотоп, где возможно сохранение патогенных микроорганизмов,
и попытаться, с одной стороны, вскрыть механизм взаимодействия конкретного патогена со сложной системой - почвой, а с другой, - провести скрининг почвенных объектов, расположенных в местах частого и массового пребывания людей, для оценки риска заражения.
Цель работы
Определить выживаемость патогенных бактерий в почвах различных типов (на примере Coxiella burnetii и амебо-резистентных бактерий) и изучить влияние свойств почв на выживаемость патогенных микроорганизмов.
Задачи исследования
Определить выживаемость С. burnetii в исследуемых почвах после инокуляции в эксперименте.
Оценить динамику количества С. burnetii в различных почвах при разных температурах.
Выделить амебо-резистентные бактерии (АРБ) из почвенных и песчаных объектов, расположенных в местах частого и массового пребывания людей.
Дать характеристику выделенным АРБ методом построения филогенетического дерева.
Выявить почвенные свойства, влияющие на выживаемость патогенных бактерий в почве.
7 6) Провести оценку применимости метода амебного со-культивирования для скрининга почв на наличие амебо-резистентных бактерий. Защищаемые положения
Патогенные бактерии (С. burnetii, АРБ) выживают (сохраняют жизнеспособность) в почвенной среде, в почвах разных типов в течение длительного времени.
Выживаемость патогенных бактерий (С. burnetii, АРБ) в почвах связана обратной зависимостью с активностью органо-минеральной матрицы: при уменьшении содержания органического вещества (черноземы, +20С) и удельной поверхности почв (городские почвы) выживаемость увеличивается.
Метод амебного со-культивирования позволяет выявлять наличие в почвах потенциально патогенных бактерий и обнаруживать новые виды.
Научная новизна
Проведенное исследование позволило выделить из почвенных и песчаных объектов, расположенных в местах частого и массового пребывания людей, 33 вида потенциально патогенных бактерий, многие из которых ранее не выделяли из почвенной среды.
Обнаружены 4 потенциальных представителя новых видов/родов (типирование по гену rrs, сходство <97%), а также новый вид рода Acinetobacter (секвенирование всего гена гроВ, сходство 94.9%),
8 идентифицированные последовательности генов которых помещены в GenBank.
Впервые определена выживаемость патогенной у-протеобактерии С. burnetii в разных почвах (дерново-подзолистой, серой лесной, черноземе, каштановой и болотной почве высокогорья), которая составляет не менее 20 дней.
Установлено, что из всех почвенных свойств наибольшее ингибирующее влияние на выживаемость С. burnetii в черноземе оказывает содержание органического углерода: выживаемость С. burnetii в черноземе при +20С уменьшается при увеличении содержания органического углерода.
Показано, что у коксиеллы существует широкий диапазон экологической толерантности по отношению к температуре почвы (от -20 до +20С), при этом количество сохранившихся в почве коксиелл увеличивается с уменьшением температуры независимо от типа почвы, а при температуре исследуемых почв -20С имеет место консервация С. burnetii в жизнеспособном состоянии.
Впервые для скрининга почв на наличие потенциально патогенных бактерий использован метод амебного со-культивирования, который, как показало данное исследование, также позволяет каталогизировать почвенные микроорганизмы и выявлять новые виды/роды бактерий в почвенной среде.
Научно-практическая ценность и реализация результатов работы
Полученные данные свидетельствуют о том, что почвы и пески в местах частого и массового пребывания людей содержат потенциально патогенные для человека бактерии.
Организациям практического здравоохранения рекомендуется включить обследование территории на наличие амебо-резистентных бактерий в комплекс необходимых мер по оценке эпидемиологической опасности мест проживания людей.
Метод амебного со-культивирования позволяет с достаточной быстротой и точностью проводить скрининг почв на наличие потенциальных патогенов человека и обнаруживать новые виды микроорганизмов.
Увеличение содержания органического углерода в черноземах
способствует снижению выживаемости С. burnetii, возбудителя Q-
лихорадки.
Автор выражает большую благодарность ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи в лице его директора академика РАМН А.Л. Гинцбурга и руководителя лаборатории экологии риккетсий академика РАМН И.В. Тарасевич за предоставленную возможность выполнения данной работы и ценные научные консультации, а также руководителю Центра ВОЗ Средиземноморского Университета, профессору Д. Раулю и профессору Б. Ла Скола за содействие в проведении эксперимента.
Патогенные бактерии, обнаруживаемые в почвах
До сегодняшнего дня сведения по экологии патогенных бактерий во внешней среде немногочисленны и разрозненны, часто не поддаются однозначной трактовке. Из огромного числа работ, констатирующих факты обнаружения тех или иных патогенных бактерий в объектах внешней среды, трудно сделать определенные выводы о закономерностях их сапрофитического образа жизни. Во многих работах содержатся прямые (инфицированность почвы, воды) или косвенные (заболеваемость людей и животных) данные, свидетельствующие о длительном существовании возбудителей во внешней среде при отсутствии экспериментальных доказательств. В иных случаях, напротив, этому вопросу посвящены специальные лабораторные эксперименты, однако их адекватность естественным условиям нередко весьма сомнительна (цит. по Сомов, Литвин, 1988).
Обобщенный литературный обзор о закономерностях обитания некоторых патогенных бактерий во внешней среде представлен в монографии Г.П. Сомова и В.Ю. Литвина «Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий» (1988) и впоследствии расширен и углублен в книге В.Ю. Литвина с соавторами «Эпидемиологические аспекты экологии бактерий» (1997). Здесь мы лишь перечислим эти патогенные бактерии (оперируя данными двух вышеприведенных литературных источников) с указанием степени жизнедеятельности их в почве. Неоднократно установлено естественное инфицирование почвы кишечными иерсиниями. При этом Yersinia pseudotuberculosis - возбудитель псевдотуберкулеза - активно размножается в почве.
Лептоспиры ряда серогрупп обнаруживались в почве до 152 суток. Лептоспиры серогруппы Grippotyphosa в почвах природного очага котловины оз. Неро существовали свыше 9 мес. после внесения, благополучно перезимовывая и сохраняя патогенность. Более того, некоторые лептоспиры способны переходить к сапрофитическому существованию в почве.
Сроки выживания листерий в почве также велики и составляют 6-12 месяцев. Доказаны высокие темпы размножения листерий в почве: при 18-20С за 6 суток их концентрация возрастала в 1500-3000 раз.
Имеются экспериментальные данные о возрастании концентрации Erisipelothrix russiopathiae - возбудителя эризипелоида - во влажной, богатой органическом веществом почве при 20С на 30-е сутки в 700-1000 раз.
Различные клостридии регулярно выделяют из почвы в высоком проценте проб. Clostridium botulinum - возбудитель ботулизма - встречается в почвах разных ландшафтных зон и имеет зональное распространение. Спонтанная зараженность почвы столбнячной палочкой {Clostridium tetani) была отмечена еще в конце XIX века. Clostridium perfringens - возбудитель газовой гангрены - при экспериментальном внесении сохранялся в почве 3 года (срок наблюдения). В экспериментально зараженной почве пастбищ эти клостридии регистрировались на протяжении 6 мес. на глубине не менее 10см.
Bacillus anthracis - возбудитель сибирской язвы - способен вегетировать в почве, при этом сама возможность вегетации и ее скорость напрямую коррелируют с почвенными свойствами, о чем речь пойдет в следующей подглаве.
В последние десятилетия был проведен целенаправленный анализ микробных ассоциаций почв и диких грызунов в природных экосистемах, практически не затронутых деятельностью человека (Дубровский и др., 1990; Шустрова, Дубровский, 1991). Этот прицельный поиск выявил убиквитарность (повсеместное распространение) широкого круга энтеробактерий и неферментирующих бактерий, условно-патогенных для человека: эшерихии, энтеробактеры, клебсиеллы, протеи, цитробактеры, гафнии, серрации, ацинетобактеры, а также псевдомонады и сальмонеллы обнаружены в различных почвах (включая почвы глухих районов Якутии и Камчатки), субстрате нор и кишечном тракте диких грызунов естественных экосистем. При этом в почвах псевдомонады и ацинетобактеры регистрировались вдвое чаще, чем у млекопитающих (Литвин и др., 1997).
Особо актуален сегодня вопрос о так называемых «некультивируемых формах» бактерий, утративших способность расти на обычных питательных средах, но являющихся жизнеспособными в естественной среде обитания. Существование таких покоящихся форм у ряда патогенных бактерий, которые представляют собой аналог спор у спорообразующих бактерий, имеет прямое отношение к закономерностям резервации возбудителей и их адаптации к неблагоприятным условиям среды (Романова, 1997).
Итак, вполне очевидно, что в почвенных экосистемах наряду с факторами, лимитирующими популяции патогенных бактерий, действуют факторы, поддерживающие их устойчивое существование и обеспечивающие жизнеспособность возбудителей инфекций как полноправных обитателей почв. Таким образом, природный очаг инфекции следует рассматривать как экологическую систему, в которой происходит взаимодействие возбудителя не только с хозяином, но и с факторами внешней среды, непосредственно контролирующими циркуляцию возбудителя в экосистеме и определяющими заражение людей в очаге.
Структура исследования (модель экспериментов)
Свободноживущие амебы - важные хищники, контролирующие микробные сообщества. Они убиквитарны (способны жить в самых разных условиях), и были изолированы из различных естественных источников, таких как почва, пресная и соленая вода, пыль и даже воздух, а также и из антропогенных экосистем: водопроводной воды, установок для кондиционирования воздуха, башенных охладителей, где они питаются микробным биофильмом, присутствующим в этих системах. Однако некоторые бактерии развили механизмы противостояния фагоцитозу свободноживущих амеб и способны использовать их как хозяев (Molmeret et al., 2005).
Некоторые из этих бактерий являются патогенными для человека, и предполагается, что амебы представляют собой их природный резервуар, действуя как «Троянские кони» микробного мира (Barker, Brown, 1994). Как исполнители этой роли, амебы привлекли внимание медицинских микробиологов в течение последних десятилетий. В целом, современные представления о функциях амеб обобщаются в следующих положениях: как резервуары и Троянские кони, в трансмиссии, усилении вирулентности и адаптации микробов к макрофагам (Greub, Raoult, 2004).
Свободноживущие амебы могут быть использованы еще и как инструмент для выделения интрацеллюлярных микроорганизмов из почвенных сообществ, где существуют очень сложные экологические взаимосвязи между бактериями, вирусами, растениями, нематодами, членистоногими и простейшими (Brown, Barker, 1999). До недавних пор возможность исследовать структуру микробного сообщества была ограничена из-за отсутствия подходящей стратегии культивирования для определения видового разнообразия (Crawford, 2005). Метод амебной со-культуры уже позволил обнаружить большое количество ранее неизвестных микроорганизмов (Adekambi et al., 2004; Adeleke et al., 2001; Birtles et al., 2000; Greub & Raoult, 2003; La Scola et al., 2000, 2003(2), 2004(1), 2004(2)), a также выявить новые ниши для выживания патогенных микроорганизмов в окружающей среде (Abd et al., 2005; Greub, Raoult, 2002; La Scola & Raoult, 2001; Landers etal., 2000).
Подходы к изучению паразитов и симбионтов свободноживущих амеб широко освещены (Greub, Raoult, 2004). Введен термин «амебо-резистентные бактерии (микроорганизмы)» вместо существующего «эндосимбионты», так как многие бактерии, способные противостоять фагоцитозу свободноживущих амеб, не являются настоящими эндосимбионтами, а также ввиду того, что сами эндосимбионты могут проявлять и эндосимбиотические и литические свойства по отношению к амебам в зависимости от условий окружающей среды. Авторы также пишут о том, что само направление изучения паразитов и симбионтов свободноживущих амеб относительно ново. Несмотря на то, что термин «симбиоз» уже использовался в конце XVIII столетия, только в 1956 году Drozanski описал наличие внутриклеточного микроорганизма, лизирующего амебы. Затем в 1975 году Mara Proca-Ciobanu продемонстрировала наличие эндосимбионтов у Acanthamoeba. Серологическое подтверждение факта патогенности для человека некоторых эндосимбионтов свободноживущих амеб повысило интерес к изучению взаимосвязей между последними и амебо-резистентными микроорганизмами, при этом само изучение стало гораздо более доступным благодаря развитию молекулярных методов. Как считают авторы, анализ этих взаимосвязей должно помочь и в понимании того, почему некоторые микроорганизмы эволюционировали в направлении симбиоза, а другие - в направлении паразитизма.
В нашей стране изучение закономерностей и механизмов взаимодействия патогенных бактерий с простейшими проводится в основном на модели с инфузориями. В течение последних почти двадцати лет этим вплотную занимается В.И. Пушкарева, сотрудница НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (Пушкарева, 1994). Результаты этих исследований позволяют утверждать, что отношения простейших с патогенными бактериями различных семейств - как грамотрицательными, так и грамположительными - не сводятся к хищничеству, а имеют сложную симбиотическую (в широком смысле) природу, и исход этих взаимодействий неодназначен для бактериальной популяции. Инфузории поддерживают существование разных видов бактерий - иерсиний, псевдомонад, листерий, легионелл, холерных вибрионов, эризипелотриксов. Особенно ярко это проявляется в нестерильных субстратах (почве, воде), где в отсутствие простейших бактериальная популяция интенсивно подавляется микробным сообществом, тогда как в ассоциации с инфузориями наблюдается более высокая их численность и устойчивое существование в течение длительного времени (цит. по Литвин и др., 1997). Последние результаты экспериментальной оценки взаимодействия Yersinia pestis с почвенными инфузориями и возможности длительного сохранения бактерий в цистах простейших (Пушкарева, 2003) указывают на возможную связь двух стратегий сохранения возбудителя в почвах природных очагов чумы: внутриклеточный паразитизм в простейших, с одной стороны, и переход возбудителя чумы в покоящееся состояние - с другой.
Для возбудителя чумы (как и для возбудителя псевдотуберкулеза) экспериментально выявлено взаимодействие и с почвенными амебами, при этом фагоцитоз был незавершенным и заканчивался гибелью простейших с выходом бактериальных клеток, а предцисты амеб содержали интактные клетки Y. pestis (Никульшин и др., 1992).
Влияние свойств почв на выживаемость С. burnetii
Длительно господствовавшие представления о невозможности автономного существования инфекций в окружающей среде (вне организма человека или теплокровного животного) базировались на тезисе об однозначно губительном воздействии на паразитов факторов внешней среды - как абиотических (неблагоприятная температура, дефицит питательных веществ и пр.), так и биотических (микробная конкуренция, хищничество простейших и пр.). Это предубеждение уже давно развеяно многочисленными фактическими данными (Литвин и др., 1997). Возможно, что в какой-то мере это справедливо для многих естественных почв, хотя и они оказались убежищем для ряда патогенных микроорганизмов, тем более это справедливо для искусственных почв, для городских почвоподобных тел, почв, примыкающих к свалкам, рынкам и пр. учреждениям.
Проведенные исследования выявили, что почва - благоприятная среда для выживания в ней С. burnetii в течение не менее 20 дней. С точки зрения формы протекания инфекционного процесса, вызванного С. burnetii, можно отметить, что она в целом была характерной для лабораторных мышей (Rehacek, Tarasevich, 1988).
Различия в свойствах изучаемых почв (дерново-подзолистой, серой лесной, каштановой и болотной) не оказали существенного влияния на выживаемость патогенного микроорганизма при -20, +4, +20С (п=5, р=95%). Однако, полученные данные указывают на то, что выживаемость С. burnetii в черноземе при +20С связана обратно пропорциональной зависимостью с содержанием в нем органического вещества. При этом наиболее сильное влияние на выживаемость данного возбудителя в почве, по всей видимости, оказывает активная (легче разрушающаяся) часть гумуса, которая и обуславливает повышенную адсорбционную способность в отношении С. burnetii, приводящую к уменьшению количества доступных жизнеспособных патогенных бактерий в черноземе по сравнению с другими почвами. Наши выводы согласуются с результатами, полученными Д.Г. Звягинцевым по адсорбции Staphylococcus aureus и Pseudomonas pyocyanea на прокаленном или обработанном пергидролем черноземе (Звягинцев, 1970).
Причина ранее отмеченного незначительного различия в выживаемости С. burnetii в черноземах Воронежской обл. и ЦЧЗ, вероятно, кроется во внутренней специфике органического вещества этих почв и, возможно, объясняется различной гидрофобностью их органического вещества. В настоящее время установлено, что максимальное прикрепление клеток наблюдается в системах, в которых и клетки, и сорбенты гидрофобны (Кайырманова и др., 2004). При этом важно отметить, что образцы черноземов Воронежской обл. были отобраны в местах наличия природного очага коксиеллеза, в то время как образец чернозема ЦЧЗ - в месте, где коксиеллез ни разу не регистрировался.
С позиции влияния температуры почв на выживаемость С. burnetii следует обратить внимание на тот факт, что отличия в выживаемости при +20 и +4С являются статистически значимыми в трех почвах из пяти, а при +20 и -20С - во всех пяти. Таким образом мы полагаем, что при температуре -20С имеет место консервация С. burnetii в жизнеспособном состоянии, что приводит к увеличению выживаемости. В выявленной закономерности (обратно пропорциональной зависимости выживаемости С. burnetii от содержания органического углерода) проявляется протекторная функция гумусовых веществ (Орлов, 1990), характеризующая санитарную роль почвы в биосфере. В последние годы коренным образом меняются взгляды на процессы, традиционно толковавшиеся как «отмирание» патогенных микроорганизмов во внешней среде: вскрыты причины редкости и непродолжительности выделения культур из почв или водоемов. Речь идет о переходе многих патогенных бактерий в некультивируемое состояние при обитании в почве (воде), что с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) удалось доказать как в экспериментах (иерсинии, листерии, сальмонеллы), так и обнаружением некультивируемых форм возбудителей псевдотуберкулеза, чумы и холеры в естественных почвах и водоемах очагов инфекций (Литвин и др., 1997). Важным механизмом сохранения и распространения некоторых патогенных микроорганизмов является их выживание в простейших (в частности, в амебах). Эти бактерии способны противостоять фагоцитозу свободноживущих амеб и использовать их как хозяев (Molmeret et al., 2005). Таким образом, амебы представляют собой их природный резервуар, действуя как «Троянские кони» микробного мира (Barker и Brown, 1994).
Удельная поверхность почвы и адгезия бактерий (сравнение методик)
До сегодняшнего дня большинство моделей по изучению взаимодействия бактерий с простейшими были сфокусированы на водах больниц и стояков водного охлаждения. Однако, как отмечено Snelling и др. (2006), исследования структуры и последовательности генов 16S и 18S рРНК абсолютно необходимы для составления каталога разнообразия бактерий и простейших, населяющих как различные воды, так и различные типы почв. Почва считается одной из сложнейших природных систем для жизни микробов, насчитывающей около 109 бактериальных клеток на грамм и 104 различных видов (Crawford, 2005). Культивирование всего разнообразия видов пока представляется недосягаемой целью, так как дает такое огромное количество изолятов, которые невозможно индивидуально прокультивировать и определить (Janssen, 2006). Поэтому в случае с патогенными микроорганизмами необходим направленный метод, способствующий быстрому и эффективному их обнаружению в почвенной среде.
По результатам, представленным в этой работе, мы можем заключить, что амебная со-культура является подходящим методом как для каталогизации почвенных микроорганизмов, с выделением редких и даже новых видов, так и для чисто практического скрининга почв на наличие потенциально патогенных микроорганизмов. Интересно отметить, что С. burnetii также сохраняется внутри свободно-живущих амеб (в течение 18 дней) (La Scola, Raoult, 2001), что указывает на возможность последних играть роль и в естественных почвенных условиях - предоставлять дополнительную нишу для выживаемости патогенных микроорганизмов.
Подводя итоги, обратим внимание, что некоторые известные ранее факультативные патогены человека, выделяемые из почвы, являются АРБ, при этом почвы и пески в местах проживания человека содержат АРБ, являющиеся новыми видами бактерий. В будущем представляется необходимым исследовать другие типы почв, к примеру, расположенные в районах с более влажным климатом (по сравнению с сухим средиземноморским климатом Марселя) как с целью скрининга новых территорий на наличие потенциальных патогенов человека, так и для оценки разнообразия АРБ в разных природных зонах, а также расширить и углубить наши представления о роли температуры в вопросе выживаемости в почве патогенных микроорганизмов {Coxiella burnetii, в частности) и роли амеб в выживании коксиеллы в почвах. ВЫВОДЫ 1. Почвы (дерново-подзолистая, серая лесная, чернозем, каштановая, болотная почва высокогорья и городские почвы) представляют собой биотоп, в котором выживают патогенные бактерии. 2. Из 11 почвенных и песчаных объектов, расположенных в местах частого и массового пребывания людей, выделено 33 вида амебо-резистентных бактерий, 20 из которых - ранее описанные патогены человека. 3. Спектр естественных почв, в которых может выживать Coxiella burnetii (возбудитель Q-лихорадки) не менее 20 дней, достаточно широк: дерново-подзолистая, серая лесная, чернозем, каштановая и болотная почва высокогорья. 4. Выживаемость патогенных бактерий (Coxiella burnetii, АРБ) в почвах связана обратной зависимостью с активностью органо-минеральной матрицы: при уменьшении содержания органического вещества (черноземы, +20С) и удельной поверхности почв (городские почвы) выживаемость увеличивается. 5. Обнаружено четыре потенциальных представителя новых видов/родов (типирование по гену rrs, сходство 97%): candidates "Bradyrhizobium massiliensis", "Acinetobacter timonensis", "Flavobacterium massiliensis" и "Sphingobacterium massiliensis", а также новый вид рода Acinetobacter (секвенирование всего гена гроВ, сходство 94.9% к А. tandoii). Полученные последовательности генов помещены в GenBank. 6. Доказана применимость метода амебной со-культуры для скрининга почв на наличие потенциально патогенных бактерий.
