Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Цитохром P450 BM3 12
1.2 Энзимология единичных молекул ферментов 18
1.2.1 Методы измерения каталитической активности единичных молекул ферментов 19
1.2.2 Уравнение Михаэлиса-Ментен для единичных молекул ферментов 25
1.3 АСМ-визуализация с использованием стандартных и сверхтонких зондов 30
1.3.1 АСМ для исследования активности отдельных молекул ферментов 34
Глава 2. Материалы и методы 37
2.1 Использованные реактивы и материалы 37
2.2 Характеристика исследуемого белка 37
2.3 Методика приготовления образцов для АСМ-измерений 38
2.4 Методика АСМ-визуализации BM3 с использованием стандартных и сверхтонких зондов 38
2.4.1 Обработка АСМ-изображений 40
2.5 Методика АСМ-мониторинга колебаний высоты единичных молекул BM3 в процессе каталитического цикла фермента 41
2.6 Дополнительные методы 46
2.6.1 Масс-спектрометрический анализ 46
2.6.2 Фотонная корреляционная спектроскопия 48
2.7 Методика АСМ-мониторинга температурной
денатурации BM3 49
2.8 Флуоресцентный анализ 50
Глава 3. Результаты и их обсуждение 52
3.1 АСМ-визуализация и определение олигомерного состояния BM3 с использованием стандартных и сверхтонких зондов 52
3.1.1 Исследование олигомерного состояния BM3 методом фотонной корреляционной спектроскопии 52
3.1.2 АСМ-визуализация BM3 в жидкости, вакууме и воздухе с использованием стандартных зондов 55
3.1.3 АСМ-визуализация BM3 в воздухе и в вакууме с использованием сверхтонких зондов 59
3.1.4 Определение олигомерного состояния BM3 из данных АСМ-экспериментов 62
3.2 Мониторинг активности единичных молекул BM3 c использованием АСМ 66
3.2.1 АСМ-измерения колебаний высоты BM3 на разных стадиях каталитического цикла фермента 66
3.2.2 Температурная зависимость средней амплитуды колебаний высоты молекул BM3 72
3.2.3 Обсуждение результатов АСМ-мониторинга активности единичных молекул BM3 73
3.3 Исследование температурной денатурации BM3 методами АСМ и флуоресцентного анализа 76
3.3.1 Флуоресцентный анализ температурной денатурации BM3 76
3.3.2 АСМ-исследование зависимости олигомерного состояния BM3 от температуры 80
3.3.3 Обсуждение полученных результатов исследования температурной денатурации BM3 92 Заключение 96
Выводы 98
Благодарности 99
Литература
- Методы измерения каталитической активности единичных молекул ферментов
- Методика приготовления образцов для АСМ-измерений
- Методика АСМ-мониторинга колебаний высоты единичных молекул BM3 в процессе каталитического цикла фермента
- АСМ-визуализация BM3 в жидкости, вакууме и воздухе с использованием стандартных зондов
Введение к работе
Актуальность изучения ферментативных систем обусловлена их
определяющей ролью в осуществлении важных биохимических реакций. Стандартным исследовательским подходом является изучение не единичных макромолекулярных ферментативных систем, а одновременно большого числа молекулярных систем и наблюдение усредненных по ансамблю свойств. Это обусловлено тем, что чувствительность прежних аналитических систем была невысокой и не позволяла проводить измерения свойств единичных молекул ферментов. В последнее десятилетие наблюдается большой интерес к исследованию единичных молекул ферментов, их свойств и активности, что легло в основу развития нового направления в биохимии – энзимологии единичных молекул, и обусловило актуальность развития новых методов их анализа. Изучение функционирования единичных молекул ферментов имеет определенные преимущества перед традиционным подходом. Основное преимущество заключается в получении информации о распределении молекулярных свойств отдельных биомолекул, а не об усредненных по ансамблю величинах, например, возможность напрямую наблюдать за стадиями (ан)фолдинга белка, наличие которых в стандартных экспериментах лишь предполагается, или наблюдать за работой единичных ферментов на различных стадиях реакции (Xie X.S. et al., 2001). Также следует отметить, что наблюдение за ферментной системой на уровне единичных молекул позволяет избежать влияния концентрационных факторов на результаты исследований. Например, некоторые биологические молекулы склонны к агрегации при высоких концентрациях, тогда как работа с малыми концентрациями или с единичными иммобилизованными молекулами позволяет следить за свойствами мономеров и олигомеров.
В настоящей работе для изучения ферментативных систем использован подход на основе атомно-силовой микроскопии (АСМ). Этот метод предоставляет принципиальную возможность визуализировать и определять физико-химические свойства отдельных биомолекул. Субнанометровое вертикальное разрешение этого метода позволяет с высокой точностью определять высоту белка с
минимальным воздействием на него со стороны АСМ-зонда. Таким образом, АСМ можно использовать для визуализации белков, определения высот белковых молекул и, соответственно, определения их олигомерного состояния, а также для мониторинга конформационной динамики фермента в процессе ферментативной активности, что было продемонстрировано в данной работе на примере фермента цитохрома P450 BM3 (BM3).
BM3 принадлежит к суперсемейству гем-содержащих цитохромов P450 и
катализирует монооксигенацию жирных кислот (Miura Y. et al., 1974). Этот белок
является самодостаточным ферментом, в котором редуктазный и гемовый домены
объединены в единую полипептидную цепь, что обуславливает интерес к нему
как к удобной упрощенной модели цитохром P450-содержащих
монооксигеназных систем (Narhi L.O. et al., 1987). Поэтому BM3 был выбран в качестве объекта исследования.
Цель исследования – визуализация и измерение активности отдельных молекул фермента цитохрома P450 BM3 с использованием АСМ.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Подбор условий нековалентной иммобилизации фермента на АСМ-подложку для визуализации отдельных молекул.
-
АСМ-визуализация иммобилизованного фермента в различных средах, определение его олигомерного состояния на основе данных измерений с использованием стандартных и сверхтонких зондов.
-
Исследование влияния температуры на олигомерное состояние BM3 методами АСМ и флуоресцентного анализа.
-
АСМ-измерение амплитуды колебаний высоты молекул BM3 на отдельных стадиях каталитического цикла (при добавлении субстрата, донора электронов, ингибитора) при разных температурах и разработка методики определения каталитической активности ферментов из полученных АСМ-данных.
Научная новизна.
1. Разработана методика определения олигомерного состояния
иммобилизованного фермента BM3 с помощью АСМ c двумя типами зондов: стандартным и сверхтонким. Исследовано влияние среды АСМ-измерений
(жидкость, воздух, вакуум) и типов АСМ-зондов на высоты изображений фермента BM3 и на его олигомерное состояние. С использованием АСМ-измерений стандартным зондом получено подтверждение, что BM3 в жидкости может находиться как в мономерном, так и в олигомерном состоянии, а с использованием сверхтонкого зонда в вакууме удалось разрешить более детально олигомерное состояние BM3.
-
Разработана методика определения каталитической активности фермента с помощью АСМ по изменению амплитуды колебаний высоты его отдельных молекул. Показана зависимость амплитуды колебаний высоты отдельных молекул BM3, иммобилизованных на подложке, от температуры с помощью АСМ.
-
Проведено исследование температурной денатурации цитохрома P450 BM3 методами АСМ и флуоресцентного анализа. Предложен подход для выяснения взаимоотношения зависимости активности фермента от температуры и его температурной денатурацией, который объединяет мониторинг плавления фермента и АСМ-исследование его агрегации в процессе температурной денатурации. В низкотемпературной области 10-33C с помощью флуоресцентного анализа было обнаружено 3 кооперативных перехода, а с помощью АСМ-анализа для BM3 продемонстрировано сохранение его глобулярной формы при изменении степени олигомеризации в этой области.
Практическая значимость. Результаты диссертации носят в первую очередь фундаментальный характер. По мнению автора, наиболее интересны следующие полученные результаты: детальное разрешение олигомерного состояния BM3 с помощью сверхтонкой АСМ-иглы, определение особенностей колебаний высоты отдельных молекул фермента BM3, иммобилизованных на подложке, и обнаружение 3-х кооперативных переходов в низкотемпературной области на кривой плавления BM3.
Важным методологическим результатом диссертации является
разработанный алгоритм связи каталитической активности единичного фермента и амплитуды колебаний его высоты, полученной из АСМ-данных. Таким образом, настоящая работа вносит как практический, так и теоретический вклад в развитие
методов определения каталитической активности единичных молекул ферментов. Этот подход может быть использован для других ферментативных систем.
Предложен подход совмещения АСМ с флуоресцентным анализом для исследования температурной денатурации ферментов.
Положения, выносимые на защиту.
1. BM3 в жидкости и воздухе может находиться как в мономерном, так и в
олигомерном состоянии, что было показано с помощью АСМ.
-
Разработана методика оценки каталитической активности единичной молекулы фермента BM3 по изменению амплитуды колебаний ее высоты, наблюдаемой в АСМ-экспериментах.
-
Плавление BM3 в диапазоне температур 10-33оС происходит через 3 кооперативных перехода, при которых сохраняется глобулярная форма белка, но изменяется степень его олигомеризации.
Внедрение результатов исследования. Предложенный способ
исследования цитохрома BM3 на уровне единичных молекул может быть использован в фундаментальных исследованиях, направленных на изучение других ферментативных систем. Фундаментальные результаты, полученные в диссертационной работе, могут быть использованы в прикладных исследованиях, посвященных разработке новых биокаталитических технологий на основе иммобилизованных ферментов для решения задач фармацевтической, пищевой и энергетической промышленности.
Апробация работы. Основные результаты работы были изложены в докладах на следующих научных конференциях: Первая международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» 2010, Москва, Россия; 25th International Symposium on Microscale BioSeparations MSB 2010, Prague, Czech; 4-я международная конференция «Современные достижения бионаноскопии» 2010, Москва, Россия; VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 2011, Москва, Россия; 17th International Conference on Cytochrome P450 2011, Manchester, UK; European Proteomics Association 2012 Scientific Congress, Glasgow, Scotland.
Личный вклад автора. Все экспериментальные АСМ-измерения и подготовка образцов к сканированию выполнены автором лично. Эксперименты по флуоресцентному анализу проведены соискателем лично под руководством к.б.н. Петушковой Н.А.
Эксперименты по масс-спектрометрии проведены совместно с к.б.н. Кайшевой А.Л. под руководством д.б.н. Згоды В.Г. Эксперименты по электронной микроскопии проведены совместно с Канашенко С.Л. Разработка программного обеспечения для получения траекторий изменения высоты молекул из АСМ-кадров проведена совместно с Крохиным Н.В. Эксперименты по фотонно-корреляционной спектроскопии проведены совместно с к.ф.-м.н. Медведевой Н.В.
Планирование всех экспериментов, анализ и интерпретация
экспериментальных данных, формулировка теоретических положений выполнены Бухариной Н.С. лично под руководством д.б.н., профессора Иванова Ю.Д.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 статьи, 3 из которых – в ведущих журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки России.
Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 28 рисунков. Список литературы включает 101 источник.
Методы измерения каталитической активности единичных молекул ферментов
К методам изучения единичных молекул относятся оптический и магнитный пинцет, метод связанной частицы (tethered particle motion) [45], флуоресцентный анализ единичных молекул [46] и атомно-силовая микроскопия (АСМ). Эти подходы могут стать инструментальным решением таких важных биологических задач, как, например, взаимодействие белок-ДНК, фолдинг белка и активность единичных белков, в том числе работа ферментов в живой клетке.
В 1961 Ротманом [47] была измерена каталитическая активность единичного фермента -галактозидазы. Смесь сильно разбавленного раствора фермента и сильно концентрированного флуорогенного субстрата переводилась в мелкодисперсный аэрозоль, капли покрывались силиконовым маслом во избежание испарения. Диаметр образующихся капель составлял 0,1 – 40 мкм, фермент преобразовывал слабо флуоресцирующий субстрат в сильно флуоресцирующий продукт, а флуоресценция снималась с отдельных микрокапель после 10-15 часов инкубации. В этом подходе молекулы фермента случайно распределены по каплям, но при определенной концентрации большинство капель не будет содержать фермент, некоторые капли будут содержать 1 молекулу и совсем небольшое количество капель – по 2, 3 или более молекул. Прямое измерение числа оборотов проводилось по флуоресцентному продукту и составило 115 с-1. Флуоресценция капель мутантной формы фермента (в 57 р менее активен) не наблюдалась, а при использовании фермента, подвергшегося частичной термоинактивации снова наблюдалось распределение Пуассона для активности в каплях, показывая, что отдельные молекулы были как активными, так и неактивными, то есть некоторые молекулы сохраняли полную активность. Другими словами, продемонстрирована своего рода статическая гетерогенность [48].
Этот метод был трудоемким, поэтому группы [49] и [50] разработали капиллярный метод мониторинга за активностью ферментов: вместо аэрозоля, как в описанной выше работе, использовался кремниевый капилляр. После инкубации разбавленного раствора фермента с концентрированным раствором флуорогенного субстрата флуоресцентный продукт отделяли электрофорезом, который проходил через высокочувствительный лазер-индуцированный флуоресцентный детектор. Условия подбирались так, что в капилляре находилось 1-2 молекулы фермента. В этих работах была обнаружена статическая гетерогенность (рис. 1.2.1) в активности молекул фермента: на примере лактатдегидрогеназы [49] и щелочной фосфатазы [50] было продемонстрировано, что отдельные молекулы фермента имеют различные каталитические скорости, а энергия активации может отличаться в 3 раза для разных молекул [50, 51]. Yeung [49] предположили, что эти отличия от молекулы к молекуле подтверждают парадигму энергетического ландшафта в теории о структуре белков (в теории укладки белков) с его иерархической организацией.
Энзимология единичных молекул щелочной фосфатазы. Образец инкубировался 20 мин при комнатной температуре. Флуоресцентный субстрат начал мигрировать из капилляра к детектору через 9 мин после прикладывания электрического поля 400 В/см. Автогидролиз субстрата привел к накоплению флуоресцентного продукта внутри капилляра, что отразилось в виде 5-минутного плато флуоресцентного сигнала. На плато наблюдается набор из 12 пиков. Каждый пик появился в результате образования флуоресцентного продукта единичной молекулой фермента. Широкое разнообразие высот пиков характеризует гетерогенность в активности от молекулы к молекуле фермента (адаптировано из [50]).
Таким образом, эти отличия возникают, потому что молекулы «пойманы» в разных долгоживущих конформациях. С другой стороны, в [50] связывают такие отличия от молекулы к молекуле с чистотой образца эукариотического белка, на которую влияют посттрансляционные модификации белка. Большинство эукариотических ферментов сильно модифицированы: многие ферменты гликозилированы, имеют N-концевое ацетилирование и т.д. Эти модификации и являются причиной вариаций в KM и Vmax у ферментов [52]. Проведя аналогичный эксперимент [53] с прокариотической щелочной фосфатазой определенной изоформы, группа обнаружила, что активность отдельных молекул имела более гомогенный характер, чем эукариотический фермент, а относительное отклонение значений активности составило 30%, что обусловлено главным образом точностью эксперимента с ферментом низкой активности.
В работе [54] наблюдались единичные обороты фермента миозина, катализирующего гидролиз аналога аденозинтрифосфата (АТФ), меченого Cy3, в аденозиндифосфат (АДФ). С помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения записывалось время удержания молекулы субстрата/продукта на иммобилизованном ферменте. Т.к. этап высвобождения продукта из активного центра фермента – лимитирующий по скорости, то определялась скорость диссоциации продукта гидролиза, которая составила 0,059 с-1. Это значение согласуется со скоростью реакции, определенной в объеме (0,045 с-1), поэтому был сделан вывод, что связывание/высвобождение Cy3-АТФ/АДФ, соответственно, отражает один каталитический оборот.
В работе [55] велось наблюдение за каталитическими оборотами единичной молекулы холестериноксидазы – флавопротеина, катализирующего окисление холестрина кислородом. В отличие от предыдущих экспериментов, флуоресцентными свойствами обладал активный центр фермента флавинадениндинуклеотид (FAD), который флуоресцирует в окисленной форме, а в восстановленной FADH2 – нет. Было показано, что при избытке холестерина и кислорода флуоресценция единичных молекул фермента, заключенного в агарозном геле, во временной развертке имела характер «on-off» (есть сигнал-нет сигнала). Каждый такой цикл «on-off» соответствовал обороту фермента, поэтому в режиме реального времени можно было получить траекторию состояний фермента во времени (более 500 оборотов для отдельного фермента). Помимо этого, была обнаружена корреляция между продолжительностью соседних событий «on» на траектории состояний фермента.
Методика приготовления образцов для АСМ-измерений
Как было отмечено ранее, преимуществами АСМ является возможность при сканировании контролировать прикладываемые силы с высокой точностью и проводить мониторинг объектов на молекулярном уровне. Ферменты же являются многообещающей системой для наблюдения за движением отдельных молекул белка, т.к. большинство из них претерпевают конформационные изменения во время каталитической реакции. Таким образом, АСМ открывает возможность мониторинга функционирования единичных молекул фермента в жидкой среде.
Ранее такой подход использовался в работах [82-84], где проводились наблюдения за флуктуациями высоты белков в процессе их каталитической активности. В работе [82] проводилось наблюдение за флуктуациями высоты молекул белка лизоцима (17 кДа, 4,53,03,0 нм), адсорбированного на слюде, с помощью АСМ в полуконтактном режиме в буфере. Были получены зависимости изменения высоты от времени, когда АСМ игла устанавливалась на монослое лизоцима без сканирования, в различных условиях окружающей среды: в буфере, в присутствии субстрата и ингибитора. В присутствии субстрата (олигосахарида) наблюдались колебания высоты амплитудой 1 нм и периодом 50 мс. В присутствии ингибитора эти флуктуации снижались до уровня, когда субстрат еще не добавлен. Интерпретация полученных результатов состоит в том, что флуктуации высоты соответствуют конформационным изменениям лизоцима во время гидролиза. Также возможно, что флуктуации высоты частично являются результатом разницы в высоте и эластичности переходного комплекса лизоцим-субстрат.
Аналогичный подход использовался и в работах [83, 84], где исследовали колебания антител IgG, а также работу фермента хитозаназы. В последней работе [84] АСМ-зонд устанавливался на вершине молекулы, и записывались траектории флуктуации вершины молекулы длительностью 0,2 с. Такие траектории были получены в чистом буфере, в присутствии субстрата (хитозан) и в присутствии двухвалентных ионов металла в качестве ингибиторов (Cu2+, Mn2+ и Zn2+). Флуктуации, полученные на слюде, не изменялись при изменении состава буферной смеси и имели величину 0,2 нм с длительность менее 3 мс, а также случайное распределение, эти значения могут быть связаны с термо- и электронным шумами установки. Траектории флуктуации неактивного фермента помимо аналогичного шума имели всплески высотой 0,2 нм и длительностью 15-20 мс. При добавлении субстрата на траекториях появлялись дополнительные всплески с амплитудой 0,4 нм и длительностью 2-8 мс, частота всплесков была 100-150 с-1. Эти события связывали с активностью фермента, так как заявленная активность, определенная стандартными методами составляла 120 с-1. После добавления Cu2+ фермент полностью терял свою активность, т.к. не наблюдалось характерных всплесков. Mn2+ и Zn2+ только частично уменьшили флуктуации фермента: в присутствии Mn2+ высота всплесков была также 0,4 нм, но период 20-50 мс и скорость 20-25 с-1. В присутствии Zn2+ высота всплесков была 0,3 нм c периодом 20-50 мс, кроме этого, всплески были невыраженными. Также было проведено сравнение среднеквадратичного отклонения по высоте на полученных траекториях (28 отдельных неактивных и 18 отдельных активных молекул фермента). Было показано, что в активном состоянии значение среднеквадратичного отклонения (RMS) составило 0,2 нм (0,12 нм на слюде) против 0,13 нм в неактивном состоянии. При добавлении двухвалентных ионов Cu2+, Mn2+ и Zn2+ значение RMS упало до 0,13, 0,15 и 0,15 нм, соответственно. В работе [85] с помощью АСМ исследовались функциональные изменения адсорбированного на слюде фибриногена по измерению силы диссоциации антиген-антитела. Для этого проводились АСМ-измерения в режиме силовой спектроскопии АСМ-зондами, функционализированными моноклональными антителами, распознающими участок 392-411 фибриногена, тогда как фибриноген был на подложке.
Таким образом, АСМ может быть использован для непосредственного наблюдения за поведением единичных молекул фермента BM3, а не измеряя значение активности, усредненное для ансамбля большого количества молекул фермента, как это делалось в работах, где использовались спектральные и радиоактивные методы [20, 27, 28, 29]. АСМ-измерение активности BM3 в данной диссертационной работе также основывалось на мониторинге увеличения амплитуды флуктуаций высоты фермента в процессе каталитического цикла.
Методика АСМ-мониторинга колебаний высоты единичных молекул BM3 в процессе каталитического цикла фермента
Фотонная корреляционная спектроскопия (PCS) относится к методам, позволяющим определять распределение биомолекул по размерам непосредственно в жидкости [92]. Данный метод основан на определении коэффициента диффузии частиц в растворе по характерной частоте флуктуаций интенсивности рассеянного на этих частицах света, далее из коэффициента диффузии рассчитывается радиус частиц.
В нашей работе метод PCS был использован как дополнительный метод для определения олигомерного состояния BM3. В результате было показано, что в растворе присутствуют объекты с характерным гидродинамическим диаметром, равным 13±7 нм (табл. 3.1.1). Белок в PCS-измерениях находился в буфере, содержащем 20% (v/v) глицерина (глицерин необходим для хранения белка при -80С). Вязкость такой среды в два раза больше вязкости буфера без глицерина, поэтому необходимо пересчитать гидродинамический диаметр объектов, полученный методом PCS, согласно зависимости определяемого диаметра частиц от вязкости раствора (уравнение Эйнштейна-Стокса). В результате, скорректированное значение диаметра молекул белка составило (7±4) нм. Сравним полученное значение с радиусом Стокса BM3, оцененного из модели компактного глобулярного белка и из эллиптической модели. А именно, так как трехмерная структура полноразмерного белка неизвестна, то из общих соображений форму этого белка можно представить в виде 1) сферической глобулярной структуры или 2) эллипсоида, как описано в разделе 2.6.2. Таблица 3.1.1 – Результаты измерений с использованием фотонной корреляционной спектроскопии: диаметр молекул BM3 и доля таких объектов в растворе. Было проведено 7 измерений для подтверждения стабильности измерений во времени. Измерения № 1-2 были проведены в начале эксперимента. Измерения № 4-6 были проведены через 1 час после начала эксперимента. Измерения №7-8 были проведены через 1,5 часа после начала эксперимента. Экспериментальные условия указаны в разделе 2.6.2.
Рассмотрим модель компактного глобулярного белка. Диаметр мономера (удвоенный радиус Стокса) белка такой формы, вычисленный из его массы по формуле (2.6.2а), составит D8 нм, а его объем, вычисленный по формуле (2.6.2б), V1265 нм3. Диаметры и объемы димеров и тримеров, рассчитанные также по формулам (2.6.2а) и (2.6.2б), составят 10 и 11,5 нм, 530 и 795 нм3, соответственно. Таким образом, диаметры объектов в PCS-измерениях, лежащие в диапазоне от (7-4=3) нм до (7+4=11) нм, соответствуют олигомерным состояния белка от мономеров до тримеров.
В эллиптической модели для вычисления стоксовского радиуса эллипсоида необходимо знать размеры его полуосей. Эти размеры можно оценить следующим образом. Полная длина аминокислотной последовательности ВМ3 составляет 1049 а.о. (UniProtKB: P14779), в том числе 458 а.о. гемового домена и 191 а.о. FMN-домена (PDB ID: 1BVY) [5]. Следовательно, длина аминокислотной последовательности FAD-домена составляет 400 а.о. То есть линейные размеры FAD-домена приблизительно равны линейным размерам гемового домена (6,2 х 6,9 х 4,0 нм), найденными из модели базы PDB. Из [5] оценим размеры гемового домена, связанного с FMN доменом: (6,2 6,9 8,5) нм. Если добавить к нему FAD-домен, то линейные размеры всей молекулы составят приблизительно (6,2 6,9 (4,0+8,5 12,0)) нм, которые и будут использованы в дальнейших расчетах оценки радиуса Стокса по формуле (2.6.2в). Для упрощения оценочных расчетов возьмем 2а=12 нм, 2b=2c=(6,2+6,9)/2=6,6 нм. В этом случае диаметр мономера, рассчитанный по формуле (2.6.2в), должен составлять 8 нм, как и в случае модели глобулярного белка, а объем мономера, рассчитанный по формуле (2.6.2г) – 274 нм3. Диаметры и объемы димеров (а=6,6 нм, b=3,3 нм, c=6 нм) и тримеров (а=7,1 нм, b=7,1 нм, c=6 нм), рассчитанные по формулам (2.6.2в) и (2.6.2г), составят 9,8 и 13,3 нм, 547 и 1266 нм3, соответственно. Диаметр тримера соответствует значению 14 нм. Следовательно, измеренные методом PCS диаметры объектов, лежащие в диапазоне от (7-4=3) нм до (7+4=11) нм, соответствуют объектам от мономеров до тримеров.
Таким образом, значение (7±4) нм гидродинамического диаметра BM3, измеренного методом PCS, соответствует состоянию белка от мономеров до тримеров с максимумом, соответствующим мономеру. Но разрешение этого метода не позволяет определить стехиометрическое соотношение между мономерами, димерами и тримерами. Поэтому для уточнения олигомерного состояния BM3 был использован метод АСМ.
Качественные АСМ-изображения белков можно получить при условии их хорошей адгезии на АСМ-подложке [80], которая сильно зависит от того в каких условиях - в вакууме, в воздухе или в жидкости - проводятся измерения. Это особенно критично при определении олигомерного состояния белков.
Поэтому АСМ-эксперименты по визуализации ВМЗ, нековалентно адсорбированного на слюде, были проведены в жидкости, в воздухе и в вакууме для сравнения. АСМ-изображения BM3 были получены стандартными зондами в жидкости (рис. 3.1.1 A), в воздухе (рис. 3.1.1 Б; рис. 3.1.2 A) и в вакууме (рис. 3.1.2 Б). Так как Dimension 3100 АСМ не позволяет проводить измерения в вакууме в отличие от NTEGRA Aura АСМ, поэтому АСМ-визуализация в воздухе была взята как точка пересечения между двумя приборами, а на рисунках 3.1.1 Б и 3.1.2 A приведены оба АСМ-изображения BM3, полученные стандартными зондами в воздухе на этих АСМ. Соответствующие перечисленным условиям визуализации плотности распределения BM3 на АСМ-изображениях по высотам p(h) представлены на рисунках 3.1.1 В и 3.1.2
АСМ-визуализация BM3 в жидкости, вакууме и воздухе с использованием стандартных зондов
Таким образом, на 1 и 2 этапах каталитического цикла значения амплитуд колебаний высоты отдельных молекул ABM3 были 0,31 нм (рис. 3.2.2), то есть сравнимы со значениями усредненного шума от слюды mica на этих этапах. Таким образом, добавление субстрата не сказывалось на колебаниях высоты молекулы.
После добавления в жидкостную ячейку АСМ донора электронов NADPH запускается реакция гидроксилирования лауриновой кислоты (3 этап каталитического цикла). На рисунке 3.2.3 А приведен пример траектории колебаний высоты отдельной молекулы на 3 этапе АСМ-мониторинга. Видно, что после добавления NADPH наблюдаемые колебания выше уровня колебаний до добавления NADPH, то есть при каталитической реакции амплитуда колебаний отдельных молекул фермента возрастает.
В таблице 3.2.1 представлено среднее значение амплитуды колебаний высоты АВМІ на 3 этапе, которое составило (0,36±0,02) нм. Такое значение было получено для 42% из 90 визуализированных и обработанных молекул. Эти молекулы были условно названы «активными». Для активных молекул значения Aвмзас11те были выше, чем верхняя граница значений /BM3restmg на 2 этапе (0,25+0,03=0,28 нм). Таким образом, наблюдалась статическая гетерогенность, когда отдельные молекулы имеют различную активационную энергию для старта каталитической реакции [49-51].
На 4 этапе АСМ-мониторинга после добавления ингибитора амплитуда колебаний высоты молекул BM3 уменьшалась до исходного значения 1-го и 2 70 го этапов (рис. 3.2.3 Б). Рассчитанное среднее значение амплитуды колебаний высоты в этом случае составило (0,21±0,02) нм (табл. 3.2.1).
На рисунке 3.2.4 представлена зависимость BM3 от времени наблюдения с момента старта каталитической реакции. Каждая точка на графике соответствует отдельной молекуле. Видно, что на протяжении всего времени наблюдения ( 60 мин) есть активные молекулы. Рисунок 3.2.4 – Результаты АСМ-мониторинга колебаний высоты молекулы BM3 на 3 этапе каталитического цикла. Соотнесение значений BM3 отдельных молекул BM3 и времени, прошедшего с момента добавления NADPH, то есть старта реакции гидроксилирования. Заштрихованная область область неактивных молекул BM3. () – линия тренда, проведенная через активные молекулы.
Как было отмечено ранее, на 1 и 2 этапах зависимости между высотой молекулы и амплитудой колебаний ее высоты не наблюдалось. Для активных молекул, согласно литературным данным каталитическая константа kcat мономеров в 5 раз меньше, чем kcat олигомеров [7]. Поэтому АСМ-данные мониторинга колебаний высоты молекулы BM3 на 3 этапе были разделены на 2 группы: данные для объектов с высотой 2,2 нм (мономеры) и для объектов с высотой 3,5 нм (олигомеры) (рис. 3.2.2). В каждой группе были выделены активные молекулы и найдены значения BM3, которые представлены в таблице 3.2.2. Как видно из таблицы, значения BM3 мономеров и олигомеров сравнимы, но доля активных олигомеров составляет 31% от всех визуализированных молекул, доля активных мономеров – 11%. При этом приблизительно половина всех визуализированных олигомеров активна, тогда как наблюдалось только 27% активных мономеров среди визуализированных мономеров. Таким образом, вероятность обнаружить активный олигомер выше, чем активный мономер.
Температурная зависимость средней амплитуды колебаний высоты молекул BM3 Известно, что активность BM3 зависит от температуры [31,33]. Зависимость активности иммобилизованного в геле белка от температуры имеет куполообразную форму с максимумом при 25оС [31].
В нашей работе были также проведены измерения амплитуды колебаний высоты белка от температуры. Зависимость изменения амплитуды колебаний высоты BM3 BM3 от температуры представлена на рисунке 3.2.5, на котором видно, что наблюдается максимум средней величины амплитуды колебаний молекул BM3 при 22оС.
Основным вопросом, возникающим при измерении активности фермента, иммобилизованного на АСМ-подложке тем или иным методом, является вопрос о сохранении активности этого фермента после иммобилизации. Для выяснения этого вопроса была проведена МС-идентификация продукта реакции гидроксилирования лауриновой кислоты в двух случаях: 1) в случае BM3, свободно плавающего в растворе (рис. 3.2.6 А), и 2) в случае BM3, нековалентно иммобилизованного на АСМ-подложке (рис. 3.2.6 Б). То есть МС-анализ показал, что в реакционной смеси после АСМ-мониторинга каталитического цикла иммобилизованного на слюде BM3 идентифицируется продукт каталитической реакции гидроксилирования лауриновой кислоты, а именно гидроксилауриновая кислота (рис. 3.2.6 Б).
