Введение к работе
Актуальность проблемы. Ключевая роль первой фазы метаболизма ксенобиотиков
принадлежит ферментам суперсемейства цитохромов Р450, которые представляют собой
гем-содержащие монооксигеназы и входят в состав микросомальной монооксигеназной
системы. Активность монооксигеназной системы в направлении того или иного
ксенобиотика определяется главным образом концентрацией и активностью специфичных
для него изоформ цитохромов Р450. Поэтому для создания моделей лекарственного
воздействия необходимо проведение селективного изоформспецифичного количественного
анализа цитохромов Р450 в биологических объектах для выявления диапазонов изменения
концентраций данных ферментов при воздействии различных факторов и определения
взаимосвязей между концентрацией цитохромов Р450 и их активностью.
Мыши являются наиболее распространенными объектами для исследования
монооксигеназной системы, так как они обеспечивают целостную, физиологически
адекватную модель для изучения влияния различных факторов на активность цитохромов
Р450 (Tingle et al, 2006, Environmental Toxicology and Pharmacology, 21, 184-190). В геноме
мыши идентифицировано 36 ортологичных генов цитохромов Р450, которые потенциально
могут иметь идентичные функции у человека и мыши (Nelson et al, 2004, Pharmacogenetics,
14, 1-18). Также отмечено сходство каталитических активностей и процессов
ингибирования CYP1A, CYP2E и CYP3A.
Развитие персонализированной медицины требует создания новых методов оценки
концетраций и активностей цитохромов Р450 и их изменений в процессе индукции или
ингибирования лекарственными препаратами. Исследование активности и количественных
характеристик цитохромов Р450 представляет собой трудную задачу. Факторами,
усложняющими разработку методики масс-спектрометрического анализа применительно к
цитохромам Р450, являются высокая гомология между белками в одном семействе, а
зачастую и между семействами, что приводит к тому, что большая часть пептидов
отражают присутствие различных изоформ. Кроме того, цитохромы Р450 являются
гидрофобными мембранными белками, которые трудно поддаются анализу. Исследования
активности цитохромов Р450 ограничиваются трудностями подбора изоформспецифичных
субстратов, ферментативную реакцию с которыми катализировала бы только одна
изоформа, а также необходимостью разработки методики количественного анализа
метаболитов с высокой чувствительностью и минимальным количеством требуемого
биологического материала.
Цель исследования: разработка метода определения активности и концентрации
основных изоформ цитохромов Р450 печени мыши с использованием масс-спектрометрии
и валидация методики на пробах микросомальной фракции печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном. Основные задачи исследования:
-
Исследовать цитохромы Р450 микросомальной фракции печени контрольных мышей и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном методом общего протеомного профилирования.
-
Создать хромато-масс-спектрометрический метод мониторинга множественных реакций для определения концентраций фармакологически значимых изоформ подсемейств 1 А, 2С, 2D, 2Е и ЗА цитохромов Р450 печени мыши.
-
Разработать хромато-масс-спектрометрическую методику определения активности фармакологически значимых подсемейств 1А, 2С, 2D, 2Е и ЗА цитохромов Р450 печени мыши.
-
Апробировать и валидировать разработанные методики на примере микросомальной фракции печени мышей контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном. Сопоставить изменения активности и концентрации исследуемых цитохромов Р450 вследствие индукции.
Научная новизна работы. Впервые разработан изоформспецифичный метод
количественного анализа цитохромов Р450 печени мыши при помощи хромато-масс-
спектрометра с тройным квадруполем в режиме мониторинга множественных реакций без
использования изотопных меток. Метод требует минимального количества
биологического материала, чувствительность составляет до 0,1 фмоль/мкг
микросомального белка, воспроизводимость результатов более 80%. Впервые исследованы
диапазоны вариации концентраций и активности цитохромов Р450 в микросомальной
фракции печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом и
метилхолантреном, приведена активность в пересчете на молекулу фермента, а также
показано, что изменение активности и концентрационных характеристик коррелирует
между собой, что подтверждает правильность разработанных методов.
Практическая значимость работы. Разработанный метод позволяет проводить измерение
концентрации и активности цитохромов Р450 печени мыши в биологическом материале с
чувствительностью до 0,1 фмоль/мкг микросомального белка и воспроизводимостью
результатов более 80% без использования изотопных меток. Оценка воздействия
различных факторов на цитохромы Р450 необходима при использования мыши как
биологической модели при разработке лекарственных препаратов, а также для создания
моделей лекарственного воздействия. Описанная концепция и этапы разработки MRM
метода применимы для разработки методик анализа цитохромов Р450 монооксигеназной системы человека, что требуется для развития персонализированной медицины. Положения, выносимые на защиту.
Протеомное профилирование микросомальной фракции печени мыши для
идентификации и оценки количественных характеристик цитохромов Р450.
Разработка методики количественного анализа изоформ цитохромов Р450 в микросомах печени мыши без использования изотопных меток с высокой чувствительностью и воспроизводимостью, а также методики определения активности подсемейств 1 А, 2С, 2D, 2Е и ЗА цитохромов Р450 печени мыши методом мониторинга множественных реакций на масс-спектрометре с тройным квадруполем.
Определение содержания основных изоформ цитохромов Р450 в микросомальной фракции печени мыши, а также их вариабельности в процессе индукции.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международной конференции HUPO-2012, Boston, USA; VIII международной конференции «Bioinformatics of genome regulation and structure\systems biology BGRS\SB'12» 2012, Новосибирск, Россия; V Конференции молодых ученых России с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» 2008, Москва, Россия.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 6 статей - в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, и 4 публикации - в сборниках докладов научных конференций.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, заключения, списка литературных источников, включающих 123 наименования, и приложения. Работа изложена на 192 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 22 рисунка и 1 приложение.
