Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 6
2 1 Стрессы, виды стрессовых воздействий, реакция организмов на стресс 6
2.1.1 Температурный стресс. 8
2.1.2 Окислительный стресс. 10
2.1.3 Токсическое воздействие ксенобиотиков . 12
2.2 Клеточные механизмы стресс- резистентности 14
2.2.1 Стрессовые белки 14
2.2.2 Пероксидаза как стрессовый белок. 25
2.3 Перекисное окисление липидов и повреждение мембран при стрессах 27
2.4 Исследования механизмов адаптации у байкальс ких организмов к факторам среды абиотической природы 30
Постановка цели и задач исследования 35
Объекты и методы исследования 37
4.1 Систематика и экология изучаемых видов 37
4.2 Методика сбора и содержания амфипод 46
4.3 Выбор условий и методов проведения экспериментов 46
4.4 Методы анализа 48
4.4.1 Электрофорез 48
4.4.2 Вестерн-блоттинг. 50
4.4.3 Определение активности пероксидазы 50
4.4.4 Определение интенсивности перекисного окисления липидов по образованию диеновых конъюгатов. , 51
4.4.5 Расчет и статистическая обработка данных. 52
Результаты и обсуждение 53
5.1 Изучение полиморфизма белковых спектров байкальских и палеарктических видов амфипод. оценка влияния абиотических стрессовых факторов на содержание белков у амфипод 53
5.1.1 Межвидовой полиморфизм белковых спектров . 53
5.1.2 Возрастной полиморфизм белковых спектров. 59
5.1.3 Влияние стрессовых факторов на содержание белков у байкальских и палеарктических амфипод. 64
5.2 Изучение влияния абиотических стрессовых факторов на содержание и синтез ряда групп стрессовых белков у байкальских и палеарктических видов амфипод 78
5.2.1 Конститутивный синтез БТШ. 78
5.2.2 Влияние температурного стресса на содержание и синтез БТШ у амфипод . 81
5.2.3 Влияние окислительного стресса на содержание и синтез БТШ у амфипод.. 86
5.2.4 Влияние токсического стресса на содержание и синтез БТШ у амфипод.. 8 7
5.3 Изучение влияния абиотических факторов на активность пероксидазы у амфипод 92
5.3.1 Сравнительный анализ активности пероксидазы у представителей байкальских и палеарктических видов амфипод. 92
5.3.2 Влияние температурного стресса на активность пероксидазы у амфипод92
5.3.3 Влияние окислительного стресса на активность пероксидазыу амфипод. 98
5.3.4 Влияние токсического стресса на активность пероксидазы у амфипод .107
5.4 Изучение влияния окислительного стресса на интенсивность перекисного окисления липидов у амфипод 110
6 Выводы 116
7 Список цитированной литературы 118
- Токсическое воздействие ксенобиотиков
- Исследования механизмов адаптации у байкальс ких организмов к факторам среды абиотической природы
- Межвидовой полиморфизм белковых спектров
- Влияние температурного стресса на содержание и синтез БТШ у амфипод
Введение к работе
Большинство живых организмов в течение своей жизни сталкиваются с изменением факторов среды, многие из которых оказывают стрессовое воздействие. Особенно актуально это для гидробионтов, существование которых напрямую обусловлено характеристиками внешней среды. Организмы в ходе эволюционного развития выработали комплекс адаптивных механизмов компенсации стрессовых воздействий на поведенческом, физиологическом, биохимическом и молекулярном уровнях (Lindquist, Craig, 1988; Озернюк, 1992; Feder, Krebs, 1997; Имашева, 1999; Тимофеев, 2000; Тимофеев, Кириченко, 2004).
Фауна озера Байкал представляет собой уникальный объект для изучения различных механизмов адаптации гидробионтов к факторам окружающей среды. Особенностью оз. Байкал является существование широкого разнообразия населяющих его форм, обитающих в специфичных условиях. К настоящему моменту проведен ряд работ по изучению этологических и физиологических аспектов адаптации байкальских гидробионтов к факторам среды различной природы. Так М.Ю. Бекман (1954), М.А. Тимофеевым (2000) и рядом других исследователей изучалось влияние гидрохимических характеристик байкальской воды на палеарктические и байкальские организмы. А.Я. Базикалова (1941), Б.И. Колупаев (1989), М.А. Тимофеев (2002) и другие исследователи проводили исследование влияния гипоксии на байкальские организмы. Материалы исследования влияния температурного фактора на байкальские виды представлены в работах R.W. Brover (1984), Н.И. Козловой (1997), Т.А. Гиль (2000), М.А. Тимофеева (2002). Большое развитие получили экспериментальные работы по изучению токсикорезистентности байкальских организмов (Камалтынов, 1970; Черепанов, 1981; Наделяев, 1981; Косолапов, 1982; Тимофеев, 1997).
Несмотря на широкий интерес исследователей к проблеме оценке отношения байкальских гидробионтов к факторам среды, базовые механизмы резистентности и стресс-адаптации на клеточном уровне у байкальских организмов практически не исследованы.
Известно, что одним из базовых механизмов стресс-адаптации на клеточном уровне является синтез стрессовых белков. К стрессовым белкам относят те группы белков, экспрессия и(или) активность которых увеличивается в ответ на воздействие различных стрессоров. Так, синтез стрессовых белков индуцируется широким кругом стрессовых воздействий, такими как экстремальные температуры, токсический и окислительный стрессы и др. (Gething, Sambrook, 1992, Sanders, 1993; Колесниченко, Войников, 2003; Wang, Spector, 1995; Arrigo, 1998; Morimoto, Santoro, 1998). В основном стрессовые белки представлены белками теплового шока (БТШ), низкомолекулярными белками теплового шока (нмБТШ), а так же рядом ферментов (включая антиоксидантные ферменты).
Байкальские амфиподы представляют собой наиболее интересный объект для изучения многообразия механизмов стресс-адаптаций у организмов оз. Байкал. В озере представлено более 257 видов амфипод (Takhteev, 1997), населяющих разнообразные экологические зоны и обладающих широким спектром адаптации. Особенностью фауны Байкала является ее длительное эволюционирование в особых условиях, что, вероятно, могло привести к появлению адаптации специфических для байкальских эндемиков. Сопоставительное исследование представителей фаун амфипод Байкала и видов Палеарктики позволило бы не только выявить механизмы и адаптивные процессы, характерные для байкальских эндемиков, но и более полно понять, как факторы среды влияют на механизмы стресс-адаптации у гидробионтов на клеточном уровне, и как это связано с экологическими характеристиками видов и особенностями их эволюционного формирования.
Токсическое воздействие ксенобиотиков
Ксенобиотики - это вещества, чужеродные для организма. Их разделяют на четыре группы: продукты хозяйственной деятельности человека (промышленность, сельское хозяйство, транспорт); вещества бытовой химии (моющие средства, вещества для борьбы с паразитами, парфюмерия); большинство лекарств; природные ксенобиотики (Кулинский, 1999).
Попадание в организм даже одной молекулы ксенобиотика вызывает ответную реакцию. Тип и величина реакции определяется свойствами ксенобиотика, его концентрацией и мишенью (Юрин, 2001). При действии ксенобиотиков наблюдаются следующие изменения в клетках: 1) Нарушение энергетического обмена (Handy, Depledge, 1999); 2) Нарушение гомеостаза внутриклеточного кальция (Braekman et al., 1999); 3) Активация свободно-радикальных процессов в клетке (Kelly et al., 1998; Almeida et al., 2002; Correi et al., 2002); 4) Нарушение процессов синтеза белка и клеточного деления (Shugart, 2000); 5) Повреждение клеточных мембран (Куценко, 2002). В частности, изменение мембранной рецепции, стимуляция или угнетение биосинтетических процессов, изменение барьерно-транспортных свойств мембран (Юрин, 2001). Например, ионы и комплексы тяжелых металлов блокируют SH-зависимые ферменты, НАДФ- и НАД-зависимые метаболические реакции и вызывают оксидативный стресс в результате стимуляции образования перекиси водорода или нарушения нейтрализации свободных радикалов (Raderecht, 1998). Практически все ксенобиотики в организме растений, животных и человека претерпевают превращения, происходящие или спонтанно, или катализируемые ферментами (Юрин, 2001). В метаболизме ксенобиотиков участвуют около 30 ферментов. В нем различают две фазы: 1) модификация, создающая или освобождающая функциональные группы; 2) конъюгация - присоединение к последним других групп или молекул (Кулинский, 1999). Обычно обе фазы, особенно при совместном действии, приводят к увеличению гидрофильности и снижению активности и токсичности молекулы токсиканта (Парк, 1973). Метаболизм многих ксенобиотиков сопровождается образованием продуктов существенно уступающих по токсичности исходным веществам. Однако в процессе метаболизма могут образоваться и более токсичные соединения. В отдельных случаях сам процесс метаболизма ксенобиотиков является пусковым звеном в развитии процессов интоксикации. Так, например, в ходе биологического окисления ароматических углеводородов инициируются свободнорадикальные процессы в клетках, образующие аренокисды, которые в свою очередь активируют перекисное окисление липидов биологических мембран. В итоге инициируется мутагенное канцерогенное, цитотоксическое действие токсикантов (Куценко,2002). Неспецифической реакцией клеток на токсический стресс является синтез белков теплового шока (Gething, Sambrook, 1992; Sanders, 1993). 2.2 Клеточные механизмы стресс- резистентности. 2.2.1 Стрессовые белки.
При стрессовых воздействиях в организме происходит синтез множества групп специфичных белков. Универсальность клеточной реакции на стресс путем синтеза новых полипептидов указывает на ее фундаментальность, а разнообразие факторов, индуцирующих этот синтез, говорит о существовании единой системы восприятия и преобразования сигналов. Белки, синтез которых вызывается воздействием на организм стрессовых факторов среды, называются стрессовыми белками. Среди них выделяют белки теплового шока (БТШ), глюкозо-регулируемые белки, некоторые ферменты и т.д. (Das, 1967; Проссер, 1977; Gething, Sambrook, 1992; Sanders, 1993; Feder et al., 1995; Hard, 1996).
Переключение нормальной жизни клетки на стрессовую осуществляется одновременно на многих уровнях регуляции. Оно включает в себя релрограммирование генома - тормозится экспрессия генов, активность которых характерна для жизни клетки в нормальных условиях, и активируются гены теплового шока (Morimoto, 1993). В результате в клетках мРНК, кодирующие стрессовые белки, обнаруживаются через 5 минут от начала стресса (Burke, 1985). Тепловой шок вызывает не только репрограммирование генома и, следовательно, изменение состава вновь синтезируемых мРНК, но и репрограммирование рибосом — распад полисом, синтезирующих белки, типичные для нормальных условий обитания, и формирование полисом, синтезирующих стрессовые белки (Boston, 1996). Такое стремительное включение синтеза стрессовых белков не только на транскрипционном (синтез РНК на ДНК), но и на трансляционном (синтез белка на мРНК) уровне достигается в результате многих событий. Тепловой шок вызывает изменения в мРНК, синтезированных в клетке до шока, происходит модификация белковых факторов трансляции и рибосомных белков. Кроме того, мРНК стрессовых белков имеют отличия от мРНК обычных белков. Все это обуславливает ослабление, а затем и прекращение синтеза обычных белков в клетках, и переключение аппарата белкового синтеза на синтез стрессовых белков. В результате стрессовые белки обнаруживаются в клетках уже через 15 минут после начала теплового шока, их синтез активируется, достигая максимума за 2-4 часа теплового шока, а затем начинает ослабевать.
После окончания теплового шока синтез стрессовых белков прекращается и возобновляется синтез белков, характерный для клетки в нормальных температурных условиях. При этом мРНК стрессовых белков быстро разрушаются в клетках при нормальной температуре, тогда как сами белки могут сохраняться существенно дольше, обеспечивая, по-видимому, повышение устойчивости клетки к нагреву. Длительное пребывание клеток в условиях теплового шока обычно также приводит к ослаблению и прекращению синтеза стрессовых белков. В этом случае включаются механизмы регуляции экспрессии генов стрессовых белков по принципу обратной связи. Накопление стрессовых белков в клетках выключает активность их генов. Возможно, таким путем клетка поддерживает количество стрессовых белков на необходимом уровне, препятствуя их сверхпродукции (Кулаева, 1997).
Исследования механизмов адаптации у байкальс ких организмов к факторам среды абиотической природы
Изучение механизмов адаптации к абиотическим факторам среды байкальских организмов привлекает интерес многих ученых. При этом основное внимание исследователей привлекает связь адаптационных возможностей с закономерностями формирования пространственно-временной структурой популяций гидробионтов в озере, а так же проблемой "несмешиваемости" байкальской и сибирской фаун. Большинство работ посвящено сравнительному изучению адаптивных возможностей байкальских и палеарктических форм.
Так, М.Ю Бекман (1954) проводила эксперименты с амфиподами вида Gammarus lacustris, представляющим фауну Палеарктики, и отмечала замедление роста амфипод данного вида в байкальских условиях. М.Ю. Бекман было сделано предположение, что, возможно, небайкальским видам не хватает в Байкале тепла для нормального созревания и развития половых продуктов - яиц и сперматозоидов, а также для нормального развития зародыша. Было сделано предположение, что при пониженной температуре цикл развития небайкальских гидробионтов удлиняется, это удлинение, вероятно, происходит за счет наиболее теплолюбивой фазы роста гидробионтов.
Позже был проведен ряд работ, показывающих, что байкальские и сибирские виды различаются по отношению к особенностям химического состава воды озера Байкал. Так, М.А. Тимофев и Д.И. Стом установили, что амфиподы вида Gammarus lacustris при возможности выбора избегают байкальскую воду (Стом, Тимофеев, 1999). Подобная реакция избегания байкальской воды была описана и для некоторых других сибирских организмов (Раев, 2001; Balayan, 2002).
Отношение гидробионтов к кислородному режиму оценивали в нескольких работах. Так, А.Я. Базикаловой (1941) проведена работа по определению устойчивости 17 эндемичных видов амфипод с различных глубин озера Байкал к гипоксии и интенсивности поглощения ими кислорода. В результате проведенной работы было сделано заключение о большей устойчивости вида Gammarus pulex (вероятно имелся в виду G. lacustris) в сравнении с представителями байкальской фауны амфипод. Из исследованных эндемиков наибольшую устойчивость проявили амфиподы вида Ейlimnogammarus cyaneus. Так же в работе были показаны временная и температурная зависимости интенсивности дыхания амфипод. М.А. Тимофеевым проведена работа по установлению уровня минимального содержания кислорода в среде для 7 видов байкальских амфипод и G. lacustris. Показана зависимость между устойчивостью исследованных видов амфипод к гипоксии и их распространением за пределы озера Байкал (Timofeyev, 2002; Тимофеев, Кириченко, 2004).
Б.И. Колупаев (1989) проводил исследование влияние пониженного содержания кислорода в воде на дыхание байкальских гидробионтов, которые в течение многих поколений обитают в среде с высоким содержанием этого газа. Им было показано, что пребывание байкальских моллюсков Benedictia baicalensis в воде с пониженным содержанием кислорода вызывает частичный переход на анаэробный тип дыхания. У гольяна и амфипод вида Eulimnogammarus verrucosus, в отличие от моллюсков, не наблюдалось подключения анаэробных процессов. Как у бокоплавов, так и у моллюсков в гипоксических условиях происходило снижение интенсивности общего потребления кислорода. Моллюски при этом увеличивали, а бокоплавы снижали выделение углекислоты (Колупаев, 1989). Позже М.А. Тимофеев и К,А. Кириченко (2003) показали возможность использования байкальскими амфиподами вида Ommatogammarus flavus процессов анаэробного дыхания.
Исследования термопреферендума байкальских организмов описано в ряде работ. Термопреферендум байкальских рыб изучался Н.И. Козловой (Козлова, 1997). Термоизбирательное поведение нескольких представителей глубоководных амфипод оз. Байкал изучалось у видов Acantogammarus grewinkii, Garjaevija sarsi, Abyssogammarus swartchewskii, A. sarnatus, Odontogammarus calcaratus, Plesiogammarus zienkowitzi. Основной целью проводимого исследования являлось определение зависимости характера термопреферендума глубоководных амфипод от изменений величины гидростатического давления (Brover et al., 1984). Работа по определению отношения байкальских амфипод к температурному фактору проведена М.А. Тимофеевым. Исследованы термопреферендум и терморезистентность семи видов байкальских амфипод. Показана зависимость между устойчивостью амфипод к повышенным температурам, и их распространением за пределы озера Байкал (Timofeyev, 2002). Устойчивость некоторых видов амфипод к повышенным температурам так же исследовалась Т.А. Гиль (2000).
Довольно большое развитие получили экспериментальные работы по изучению токсикорезистентности байкальских организмов. Обширная работа по оценке изменений сообществ амфипод Южного Байкала под действием сточных вод БЦБК проводил P.M. Камалтынов (1970). В работах Черепанова и др. (1981) исследовали отношение амфипод вида Е. verrucosus к токсикантам: уксуснокислому натрию, двухлористому марганцу и бензохинону. Показателем физиологического состояния рачков после токсического отравления выступала интенсивность газообмена. В работе показано, что в присутствии малых доз токсикантов происходит увеличение интенсивности газообмена у амфипод исследуемого вида. Наделяев И.Н. (1981) также показал, что растворы фенола в пределах концентрации от 0,001 до 0,0001 мг/л вызывают повышение суточного потребления кислорода амфиподами. Устойчивость ряда литоральных амфипод к соединениям цинка, фенола, гидрохинона, ртути и кадмия определяли Косолапое В.Н. (1982), P.M. Камалтынов (1983), Тимофеев М.А. (1997). Рассматривается возможность использования некоторых байкальских организмов в качестве тест-объектов, например, для оценки степени очистки производственных сточных вод (Стом, 2003).
Несмотря на широкий интерес к проблеме изучения механизмов адаптации байкальских гидробионтов, ответ байкальских организмов на воздействие стрессовых факторов на биохимическом и молекулярном уровнях изучен крайне недостаточно. Известны единичные работы по данному направлению:
Так, проведено исследование синтеза БТШ70 и повреждений ДНК при воздействии стрессовых факторов у байкальских губок Baicalospongia intremedia, Lubomirskia fusifera, L.abietina. При температурном стрессе у данных видов губок была отмечена зависимая от времени экспозиции экспрессия БТШ70. В ответ на воздействие модельных токсикантов, таких как свинец, медь, цинк и тетрахлоргваякол, а так же после экспозиции организмов в сточных водах Байкальского целлюлозно-бумажного комбината были обнаружены экспрессия БТШ70 и повреждения ДНК (Efremova et al., 2002).
Межвидовой полиморфизм белковых спектров
Для получения данных о возможности существования межвидового полиморфизма было проведено сопоставление белковых спектров 10 видов амфипод, из них 3 вида палеарктических, 7 байкальских: Chaetogammarus ischnus, Gammarus tigrinus, G lacustris, Gmelinoides fasciatus, Eulimnogammarus cyaneus, E. vittatus, E. verrucosus, E. marutuji, E. maacki, и Ommatogammarusflavus. Количество использованных особей 350, количество проделанных электрофоретических измерений 80.
Как видно из электрофореграмм (рис. 1-3), для исследованных видов характерен ярко выраженный межвидовой полиморфизм белков. Причем полиморфизм характерен не только для систематически далеких видов, таких как, например, E.cyaneus и G. lacustris (рис. 1, треки 2,3), но и для близкородственных видов, находящихся в пределах одного рода как, например, Е. vittatus (рис. 1, 2) и Е. cyaneus (рис. 1, трек 3). Как видно из предоставленной электрофоре граммы (рис. 1), особенностью белковых спектров байкальских видов амфипод является присутствие белков с молекулярной массой в районе 80-90 кДа (рис. 1, белковая зона а). Следует отметить, что содержание данных белков также высоко и у амфипод палеарктического вида G. lacustris из прибайкальских озер, в то время как у амфипод палеарктического вида G. tigrinus упомянутый белок не имеет столь яркой выраженности (рис. 1, белковая зона Ь). У амфипод вида G. tigrinus отмечено несколько белков, которые не представлены ни у амфипод вида G lacustris, ни у байкальских видов: белок с молекулярной массой в районе 35 кДа (рис. 1, белковая зона с), содержание которого достаточно велико, 36 к Да, а так же 23,5, 23 и 22 кДа (рис. 1, белковая зона d).
Отмечены некоторые белки, которые наблюдаются в белковых спектрах амфипод видов G. tigrinus, G. lacustris, и некоторых байкальских видов: с молекулярной массой в районе 16 кДа - G. lacustris, Е. cyaneus, Е. marituiji; 22 кДа - Е. cyaneus, Е. verrucosus, От. flavus, Е. maacki; 29 кДа - G. lacustris, Е. verrucosus; 50 кДа - G, lacustris, Е. cyaneus, Е. marituiji; в зоне 60 к Да - G. lacustris, Е. verrucosu; в районе 63 кДа - G. lacustris, Е. cyaneus, Е. marituiji, Е. verrucosus.
У амфипод вида G. lacustris и байкальских видов так же выявлены некоторые гомологичные белки (которые не встречаются у амфипод вида G. tigrinus): с молекулярной массой 80-90 кДа, как упоминалось раньше, эти белки отмечены у амфипод вида G. lacustris и всех исследованных видов байкальских амфипод. Так же в спектрах амфипод вида G. lacustris и всех байкальских видов отмечаются белки с молекулярными массами 27 и 37 к Да. Белок с молекулярной массой 20,5 кДа так же отмечен в спектрах амфипод видов Е. cyaneus, Е. verrucosus, Е. maacki, 30 к Да - Е. marituiji, Е. verrucosus, причем у амфипод последнего вида содержание данного белка выше, чем у G. lacustris. Белок с молекулярной массой 22,5 к Да выявлен у амфипод видов G. lacustris и Е. cyaneus.
Белок с молекулярной массой 34 к Да отмечен исключительно у амфипод байкальского вида О. flavus.
На рисунке 2 представлены электрофореграммы белков амфипод байкальских видов Е. vittatus и G.fasciatus. Как и у других байкальских видов амфипод, у представителей этих видов так же представлены белки с молекулярной массой близкой к 80 - 90 кДа (рис. 2, белковая зона а). Высоко содержание белков с молекулярными массами около 50 кДа (рис. 2, белковая зона Ь), 60 (рис. 2, белковая зона с), 63, 37 (рис. 2, белковая зона d) и 27 кДа (рис. 2, белковая зона е). Как отмечалось выше, данные белки отмечены у амфипод вида G. lacustris и рассматриваемых ранее байкальских видов амфипод. Содержание белков с молекулярными массами 60 и 63 кДа среди рассматриваемых видов наиболее высоко у амфипод вида G. fasciatus.
При сопоставлении белковых спектров амфипод байкальских и европейских видов Е, cyaneus, Е. vittatus, G. tigrinus, С. ischnus (рис. 3), отмечено, что у амфипод байкальских видов состав белков намного богаче, чем у европейских, и характеризуется большим количеством высокомолекулярных белков (рис. 3, белковая зона а). В тоже время, у амфипод европейских видов белковые спектры заметно беднее и в основном представлены низкомолекулярными белками (рис. 3, белковая зона Ь).
Наблюдаются отличия по содержанию белков с молекулярной массой 80-90 кДа (рис. 3, белковая зона с), присутствие которых, как уже ранее отмечалось, характерно для белковых спектров амфипод всех байкальских видов. Как видно из рисунка 3, содержание данных белков в спектрах видов европейских заметно ниже, чем в спектрах байкальских видов амфипод.
Влияние температурного стресса на содержание и синтез БТШ у амфипод
Для оценки токсического влияния на индукцию синтеза нмБТШ были проведены эксперименты с экспозицией амфипод в течение 24 часов в растворах хлористого кадмия трех концентраций - 5, 0,5 и 0,05 мг/л. Проведено 20 экспериментов. Использованы виды G lacustris, Е. cyaneus и Е. verrucosus. Критерием выбора перечисленных видов служило их отношение к токсическому воздействию. Палеарктический G lacustris устойчив к воздействию различных токсикантов. Байкальский Е. cyaneus является одним из самых устойчивых среди байкальских видов амфипод к токсическому воздействию. Е. verrucosus чувствителен к токсическому стрессу. Использовано 100 рачков. Результаты экспериментов отображены на рисунке 23.
На рисунке 23 представлены материалы по изучению влияния токсического стресса на синтез нмБТШ у видов G. lacustris, Е. cyaneus и Е. verrucosus. Как видно из рисунка, токсический стресс индуцировал синтез нмБТШ у исследованных видов. Отмечается индукция синтеза нескольких групп нмБТШ. У амфипод палеарктического вида G. lacustris, устойчивых к токсическому воздействию, при экспозиции в растворах хлористого кадмия с концентрацией 5 мг/л отмечается индукция синтеза трех белков с молекулярными массами 28, 32 и 57 кДа. При экспозиции рачков данного вида в растворах 0,5 мг/л отмечается индукция синтеза белка с молекулярной массой 32 к Да, однако с меньшей интенсивностью, чем при экспозиции в растворах с концентрацией 5 мг/л. Экспозиция рачков в растворах с концентрацией 0,05 мг/л ведет к снижению синтеза белковой группы с молекулярной массой 32 кДа. Экспозиция амфипод вида Е. cyaneus, одного из наиболее устойчивых байкальских видов к токсическому воздействию, в растворах хлористого кадмия с концентрацией 5 мг/л происходит индукция синтеза белка с молекулярной массой 32 кДа. При снижении концентрации растворов до 0,5 мг/л у амфипод наблюдается небольшая редукция синтеза белка с молекулярной массой 32 кДа, однако происходит индукция синтеза белков с молекулярными массами 15 и 52 кДа. При экспозиции рачков в растворах с концентрацией 0,05 мг/л синтез белков с молекулярными массами 15 и 52 кДа редуцируется. Происходит снижение синтеза белка с молекулярной массой 32 к Да.
Для амфипод вида Е. verrucosus, чувствительных к воздействию токсикантов, экспонированных в растворах хлористого кадмия с концентрацией 5 мг/л отмечается индукция синтеза белка с молекулярной массой 32 кДа. При экспозиции в растворах с концентрацией 0,5 мг/л синтез белка с молекулярной массой 32 кДа несколько снижается и отмечается небольшая индукция синтеза белков с молекулярной массой 15 кДа. Экспозиция рачков в растворах с концентрацией 0,05 мг/л ведет к снижению синтеза белка с молекулярной массой 32 кДа, синтез белка с молекулярной массой 15 кДа равен таковому при экспозиции в растворах с концентрацией 0,5 мг/л.
Таким образом, токсический стресс ведет к синтезу нмБТШ с молекулярными массами 15, 28, 52 и 57 кДа, наличие которых видоспецифично. Синтез белка с молекулярной массой 32 кДа отмечен у всех исследованных видов. Интенсивность синтеза данного белка зависит от концентрации растворов токсиканта. Наибольший уровень синтеза белка обнаруживается у особей экспонированных в растворе с самой высокой концентрацией CdCL2 - 5 мг/л, а наименьший - в растворе с наименьшей концентрацией — 0,05мг/л.
Следовательно, у амфипод всех исследованных видов происходит индукция синтеза тех или иных белков семейства нмБТШ, что свидетельствует о вовлеченности белков данного семейства в токсикорезистентность изученных видов. Индукция синтеза этих белков указывает на возможные нарушения структуры и синтеза клеточных полипептидов. Наличие большего количества белков семейства нмБТШ у амфипод вида G. lacustris вероятно связано с его большей устойчивостью к воздействию токсического стресса. То же можно сказать и о Е. cyaneus, у которого обнаружен синтез трех белков семейства нмБТШ. У Е. verrucosus обнаружен синтез лишь 2 белков данного семейства, что коррелирует с его наименьшей устойчивостью к токсикантам среди исследуемых видов.
Интересно отметить различия в содержании такого стрессового белка, как БТШ 70, у палеарктических и байкальских видов амфипод. Из представленных выше материалов видно, что БТШ70 у видов из европейских водоемов G.tigrinus и C.ischnus несомненно участвует в механизмах стрессовой защиты. Об этом говорит индукция синтеза данного белка у этих видов под действием окислительного стресса. В то же время у Е. cyaneus окислительный стресс усиления синтеза БТШ70 не вызывал. При остром температурном стрессе у байкальских видов Е. cyaneus, Е. vittatus и Е. verrucosus экспрессия данного белка заметно снижалась вопреки ожидаемому повышению.
БТШ70 относится к семейству шаперонов, основными функциями которого является связывание белков, регулирование их сворачивания, транспорта и восстановления (Sanders, 1993). Существует ряд работ, подтверждающих участие белков семейства БТШ70 при адаптации организмов к неблагоприятным условиям, при этом отмечается усиление синтеза данного белка и его накопление в клетках (Sanders, 1993; Werner, Nagel, 1997; Feder, Hofmann, 1999). В то же время у байкальских амфипод, вероятно, существует специфика участия БТШ70 в системе стрессовой защиты. Об этом говорит не только его не задействованность при окислительном стрессе у Е. cyaneus, но и отмеченное снижение синтеза при повышенных температурах трех исследованных байкальских видов. Вероятным объяснением этого факта может являться только то, что БТШ70, являясь типичным элементом стрессовых систем большинства организмов, у байкальских видов не играет основной роли в стрессовых адаптациях. Возможно, с этим связана и их малая концентрация.
Таким образом, у изученных байкальских и палеарктических видов амфипод наблюдается конститутивный синтез БТШ70 и отсутствует конститутивный синтез нмБТШ. Уровень конститутивного синтеза БТШ70 у байкальских видов амфипод выражен слабее, чем у палеарктических видов. Абиотические стрессовые факторы оказывают влияние на интенсивность синтеза БТШ70 и нмБТШ у изученных видов амфипод. Наблюдается усиление синтеза БТШ70 при влиянии окислительного стресса у палеарктических видов амфипод. Отмечено снижение синтеза БТШ70 у байкальских амфипод при влиянии температурного стресса. Показано усиление синтеза нмБТШ у некоторых представителей байкальских и палеарктических амфипод при температурном и токсическом стрессовых воздействиях.
