Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Биоэнергетические параметры митохондрий пролиферирую-щих и закончивших рост тканей .
1. Структурно-функциональные характеристики митохондрий тканей организмов, закончивших рост 9
2. Влияние тиоловых соединений на энергетический обмен в митохондриях 22
3. Структурно-функциональные характеристики митохондрий пролиферирующих тканей
3.1. Митохондрии организмов, пораженных злока чественными опухолями 26
3.2. Митохондрии организмов, находящихся на ранних стадиях постнатального развития.» 31
Глава II. Структура и свойства белков-маркеров роста .
1. Иммуноглобулин О ,характерный для процессов роста. 34
2. Глобулин, характерный для процессов роста 37
3. Влияние БМР и других белков на энергетический обмен в митохондриях 39
Глава III. Методическая часть.
1. Объект исследования 43
2. Методы работы
2.1. Ионообменная хроматография 44
2.2. Электрофорез. Иммуноэлектрофорез 44
2.3. Выделение митохондрий 44
2.4. Полярографическая регистрация дыхания митохондрий 46
2.5. Определение окислительного фосформирования ... 46
2.6. Изучение проницаемости мембран митохондрий для ионов. 50
2.7. Получение субмитохондриальных препаратов 50
2.8. Полярографическое определение Л/АІЇ)Н-% сукцинат-и цитохром-с-оксидазной активностей 51
2.9. Другие методы 52
Глава ІV. Влияние белков-маркеров роста на дыхание митохондрий
1. Зависимость действия белков-маркеров роста от источника выделения митохондрий и субстрата окисления 53
2. Функциональные параметры митохондрий, инкубируемых в присутствии БМР 55
Глава V. Выяснение механизма действия белков-маркеров роста на энергетический обмен в митохондриях .
1. Изучение в сравнительном аспекте влияния белков-маркеров роста и 2,4-динитрофенола на окислительное фосформирование в митохондриях 68
2. Роль состояния мембран в проявлении действия белков-маркеров роста на функциональные параметры митохондрий 75
3. Влияние белков-маркеров роста на структурную целостность митохондрий 91
Глава VІ. Участие сульфгидрильных групп митохондрий в реализации механизма действия белков-маркеров роста на энергетический обмен 104
Заключение 123
Выводы 128
Список литературы 131
- Структурно-функциональные характеристики митохондрий тканей организмов, закончивших рост
- Влияние БМР и других белков на энергетический обмен в митохондриях
- Определение окислительного фосформирования
- Функциональные параметры митохондрий, инкубируемых в присутствии БМР
Введение к работе
Обзор последних достижений молекулярной биологии рака показывает, что наибольший успех в понимании механизмов злокачественного перерождения клетки достигнут в области иммунологии - науки, теоретические положения которой позволят, по мнению ведущих исследователей, в недалеком будущем создать наиболее эффективные методы профилактики и интенсивной терапии опухолей /26,167/.
В настоящее время иммунологические методы оказались незаменимыми для онкологов экспериментаторов и клиницистов, поскольку позволили с высокой вероятностью диагностировать наличие в организме очагов злокачественного роста по присутствию в сыворотке крови особых белков-маркеров, не обнаруживаемых в норме. Типичными примерами таких белков являются: белок Дарци /133/, белок "зоны беременности" /237/, медленный L 2~ГЛ0(^УЛИН /^V» карцино-эмбриональный антиген /149/, В-белок /121/, онкофетальный белок /242/, белки, ассоциированные с раком: об -рпротеин /168/ и Р-97 /277/'. Кроме того, оказалось, что нормальный рост также сопровождается появлением в крови особых белков, свойства которых аналогичны таковым белков-маркеров злокачественного роста. К таким белкам относится, например, эмбриональный белок ^ -фетопротеин, биосинтез которого возобновляется при некоторыхффмах гепатом /I/
Значительный интерес в теоретическом и методическом плане представляют работы В.П»Короткоручко и сотр., впервые показавших наличие в крови людей и животных, пораженных злокачественными опухолями различного генезиса, особого белка-маркера роста, синтезирующегося в организмах-опухоленосителях с/р wvo , отсутствующего в крови практически здоровых организмов и принадлежащего к иммуноглобулинам Q (<% )/45,72/.
Работами тех же авторов показано, что в крови новорожденных и пораженных карциномой Броун-Пирс кроликов, а также беременных крольчих, циркулирует белок-маркер роста, относящийся к фракции В -глобулинов ( /3 -маркер)/41,42/.
Важнейшим биологическим свойством белков-маркеров роста (БМР) является их способность нарушать энергетические процессы в препаратах нормальных тканей iff fffffO ~ угнетать дыхание митохондрий, активировать гликолиз и устранять эффект Пастера /8,16,44, 46,47,93,94,98/. Под действием БМР функциональные характеристики исследуемых препаратов (интактных митохондрий, полной и неполной гликолитических систем) приближаются к соответствующим характеристикам опухолевых тканей, для которых нарушение дыхания с параллельным повышением уровня гликолиза показано еще wOtoUfg fZGbl *
Нет основания исключать возможность того, что БМР обладают свойством нарушать энергетический обмен организмов, в которых происходит синтез указанных белков. Это представляется тем более вероятным в свете литературных данных о том, что, во-первых, сыворотка крови организмов с некоторыми патологиями обладает токсичностью по отношению к нормальным клеткам и субклеточным компонентам, в частности митохондриям /18,19,45,46,55,56,108,135/, и, во--вторых, важной ролью гуморальной регуляции в патогенезе опухолевых заболеваний /207,255/. В отдельных случаях, как показано, токсическими компонентами "патологических"сывороток являются иммуноглобулины /18,19,45,53,136/.
Если учесть, что иммуноглобулины могут влиять на энергетический обмен, а также имеют немаловажное значение в патогенезе заболеваний, связанных как с изменением спектра самих иммуноглобулинов, так и с деструкцией (иммуноповреждениями) мембранных систем клетки, открывающей возможность проникновения циркулирующих в крови белков, в том числе и антител, к субклеточным компонентам /5,22,181/, кажется достаточно обоснованным проведение исследова- ния, касающегося влияния "аномального" иммуноглобулина G (fgG ~ -маркера), принадлежащего к иммунной системе организма и /3 -маркера, возможно связанного с функционированием той же системы Аб/, на систему энергообеспечения клетки.
Связь между указанными системами, опосредованная в здоровой клетке множеством промежуточных звеньев /183,185/, при патологиях /5,181,260/, в том числе и при злокачественном росте, может быть нарушенной и являться функцией иммунных повреждений барьерных и регуляторних систем клетки /22/.
Исходя из вышеизложенного, основной целью нашего исследования является подробное изучение влияния, а также точки приложения и молекулярного механизма действия БМР на митохондрии, представляющие собой высокочувствительные индикаторы возникновения в организме патологических процессов /3,13,37,106,108/.
Полученные результаты позволят, по нашему предположению, не только объяснить, каким образом БМР приближают биоэнергетические параметры интактных митохондрий к соответствующим параметрам митохондрий активно пролиферирующих тканей (моделируя в определенном приближении состояние энергетического обмена при заболеваниях злокачественного характера, а также в процессах регенерации или постнатального развития, на основе степени изменения ми-тохондриального энергетического обмена), но и научно обосновать пути нейтрализации или корригирования влияния БМР на митохондрии.
Структурно-функциональные характеристики митохондрий тканей организмов, закончивших рост
В митохондриях энергия субстратов окисления в процессе переноса электронов по дыхательной цепи (редокс-цепи) превращается в электрохимическую энергию трансмембранного градиента протонов (А/ +), которая вновь трансформируется в энергию химических связей при фосфорилировании А$)Р неорганическим фосфатом /86/.
Митохондрии участвуют во многих метаболических процессах, таких, как цикл трикарбоновых кислот и J$ -окисление жирных кислот.
Ферменты, катализирующие эти реакции, расположены внутри митохондрий в матриксном пространстве и потоки метаболитов, в обоих направлениях пересекающие митохондриальные мембраны, регулируются специфическими транспортными системами-переносчиками.
Внутренняя митохондриальная мембрана содержит ферменты редокс-цепи и протонную аденозинтрифосфатазу (Н+- А ГР азу), состоит на 3/4 общей массы из белка и непроницаема для ионов и высокомолекулярных соединений» Молекулы воды, небольшие нейтральные молекулы кислорода (0p)f аммиак (но не протоны, гидроксилнионы и ионы аммония), а также "проникающие" анионы хлора (С " ) и ацетат-ионы (С//зСОСГ )(при условии симпорта катионов) могут самостоятельно входить в матрикс или выходить из него /II8-I20/. Внешняя мембрана митохондрий проницаема для ионов /276/ и для ряда высокомолекулярных соединений, в том числе и для иммуноглобулинов О /23/.
Морфологические особенности митохндрий, выделенных из различных органов, довольно значительны и тесно связаны с физиологическими функциями конкретного органа: так, митохондрии миокарда, в которых преобладают реакции цикла трикарбоновых кислот, окисления жирных кислот и синтеза АТР, имеют плотную упаковку крист; митохондрии печени, содержащие большое количество ферментов, не связанных непосредственно с окислительным метаболизмом, характеризуются рыхло упакованными кристами /172,233,246/, JtackenBrock показал, что структура митохондрий зависит от энергетического состояния этих органелл: митохондрии, инкубируемые в присутствии субстрата окисления, находятся в "ортодоксальной" конфигурации (матрикс расширен и заполняет все межмембранное пространство); последующее внесение в среду инкубации акцептора фосфата приводит к сжатию матрикса и переходу органелл в "конденсированное" состоя- ние /152,156/, Структура митохондрий in sifv может изменяться в ответ на изменение физиологического состояния организма /266/.
Так, количество и плотность упаковки крист меняется у митохондрий в процессе холодовой адаптации, а также при патологиях /83,85/. Кроме того, при патологиях различного генезиса наблюдается резкое сжатие митохондрий, сопровождаемое отслаиванием внешней мембраны или набухание, приводящее к вымыванию матрикса, разрушению и разрыву крист и внешней мембраны /98,138,149,173,203/.
Для изучения точек приложения и механизмов действия различных физико-химических факторов на энергетический обмен в митохондриях используют субмитохондриальные препараты, получаемые резким изменениемосмотичности среды инкубации или ультразвуковой обработкой -"озвучиванием" /150,158,176,196/, Осмотический шок индуцирует разрыв внешней мембраны; "озвучивание" (в зависимости от условий) повреждение целостности обеих мембран или появление субмитохон-дриальных частиц (СМЧ) с обращенной ориентацией: ферменты, расположенные на матриксной (М) стороне внутренней мембраны митохондрий в СМЧ обращены наружу /154,155/. Характерным свойством СМЧ является способность активно окислять /VA& H , практически не окисляемый интактными митохондриями /150,196/.
Митохондриальная дыхательная Средокс) цепь содержит следующие компоненты: флавопротеины, железо-серные белки, цитохромы (а, вис), убихинон, а также другие белки и коферменты, организованные в фосфолипидной матрице внутренней мембраны таким образом, что транспорт электронов по редокс-цепи сопровождается переносом протонов из матриксного пространства митохондрий наружу /204,205/. Поскольку интактная мембрана обладает НИЗКОЙ ИОННОЙ проницаемостью, на ней устанавливается электрохимический трансмембранный пітенциал протонов (АДП+), используемый митохондриями для синтеза ATPt сопровождающегося возвращением Н+ в матрикс-ное пространство /204,205/. Нарушение структурной целостности мембраны ведет к снижению дД и+ и падению эффективности энергообразования в митохондриях /71,113,150,234,246/.
Эффективность синтеза АТР зависит от применяемого субстрата окисления. Так, образование АТР активнее всего идет при окислении янтарной кислоты (сукцината). Сукцинат не имеет конкурентов по созданию богатых энергией соединений и связанному с ним фосфорили-рованию, что обусловлено большей скоростью его окисления по сравнению с А/АЗ) -зависимыми субстратами (пируват#м, С -кетоглутара-том, малатом и др.)/21,32,33,49,66,85,236,244/.
Работами С/?а/)СЄ определена локализация трех участков сопряжения в редокс-цепи /125,126/. Отношение числа молекул АТР, синтезированных в определенный промежуток времени к числу атомов поглощенного кислорода обозначается Р/0 ( AQ)P /0) и характеризует эффективность окислительного фосфорилирования в данном препарате митохондрий. Значение Р/0 для M4JD -связанных субстратов равняется трем. Субстраты, электроны которых входят в редокс-цепь на на уровне убихинона или цитохрома с дают значение Р/0 соответственно 2 и I /83,85,244/. Следует учесть, что в эксперименте значение Р/0 обычно несколько ниже теоретического и зависит как от условия выделения органелл, так и от физиологических особенностей митохондрий данной ткани /83,212,227,246,268/.
Наиболее точные данные, характеризующие функциональное состояние митохондрий, могут быть получены полярографическим методом /34/, позволяющим оценить степень энергизации органелл, эффективность окислительного фосфорилирования (А#)//0), интактность мембранного аппарата, а также локализовать повреждения редокс-цепи митохондрий при патологиях /34,36,38,85,125,126,127,128/.
Скорость потребления кислорода митохондриями, отражающая функциональное состояние органелл, зависит от наличия в среде инкубации субстратов окисления, акцепторов фосфата и кислорода.
Исследуя влияние перечисленных факторів на интенсивность дыхания, Chance ввел представление о пяти состояниях дыхательной цепи, различающихся по скорости дыхания митохондрий, природе факторов, лимитирующих дыхание, а также по состоянию окисления восстановления переносчиков электронов в редокс-цепи /124,125/. Метаболическое состояние I регистрируется в отсутствие субстрата окисления и фосфорилирования. Последующее добавление субстрата фосфорилирования (акцептора фосфата) AJDP индуцирует переход в состояние 2, в котором единственным фактором.
Влияние БМР и других белков на энергетический обмен в митохондриях
Работами, предметом изучения которых явились отношения "энергетический обмен - белки (полипептиды)" в норме и при патологии, показано, что чаще всего влияние таких белков (токсинов, эндогенных белков и пептидов, появляющихся в организме гГри некоторых патологиях) на функциональные параметры митохондрий реализуется на уровне мембран. Так, дифтерийный токсин, разобщающий окисление с фосфорилированием в интактных митохондриях, повышает проницаемость митохондрий для протонов и других ионов, а также ингибирует ферменты окисления МАЗ) -зависимых субстратов /106/.
Уже упоминавшимися работами Гулидовой и др. показано, что отдельные компоненты сыворотки крови больных шизофренией (возможно, иммуноглобулины Q ), разобщают окислительное фосфорилирова-ние, индуцируют набухание органелл, фрагментацию крист митохондрий /18,19/. Лидеман приводит данные, аналогичные результатам работ /18,19/, отмечая, что сыворотка крови доноров также обладает некоторой биологической активностью по отношению к мембранным системам клетки, в частности, к митохондриям /53/, однако для реализации эффекта нормальной сыворотки необходим длительный период инкубации, присущий, например, манометрическому методу изучения окислительного фосфорилирования /56/.
Катионные белки эозинофилов нарушают энергетический обмен в митохондриях, ингибируя /М40//-дегидрогеназу, что, па мнению авторов, имеет биологическое значение /246/. Гистоны /96/ и протамины /40/ разобщают окислительное фосфорилирование повышают проницаемость митохондриальных мембран для ионов-компонентов среды инкубации, а также ингибируют отдельные ферментные системы.
Ишемический токсин-полипептид» появляющийся в крови и тканях экспериментальных животных и человека при ишемической болезни, разобщает окислительное фосфорилирование, угнетает скорость дыхания митохондрий Б состоянии 3 и активирует - в состоянии 4 вследствие индуцированного указанным токсином повышения ионной проницаемости /52/»
Ценность приведенных, достаточно разнородных на первый взгляд данных заключается в том, что внесение в среду инкубации указанных белков (пептидов) изменяет энергетический обмен в митохондриях, моделируя на уровне отдельной органеллы состояние указанного обмена в органе или даже целом организме, пораженном данной патологией или подвергнутом воздействию патогенных факторов эндогенного и экзогенного происхождения. Следовательно, нет оснований исключать патогенетическую роль белков и пептидов, появляющихся в тканях и крови при патологиях /18,53,106,108/, тем более, что в некоторых случаях их действие на митохондрии удается нейтрализовать веществами, обладающими терапевтическим эффектом при данных патологиях /19,39,108/.
Данные, касающиеся возможности участия белков в нарушении энергетического обмена организмов-опухоленосителей получены Короткоручко и др., показавшими, что БМР обладают способностью влиять на функциональные параметры митохондрий миокарда кроликов и активировать гликолиз в постмитохондриальном супернатан-те /45,98/. БМР угнетают реакцию Пастера, "создавая тем самым как бы раковую энергетическую ситуацию ЧВ.П.КороткоручксГ, 1979, с. 20).
В экспериментах с {/QG-маркером установлено, что ответственной за указанные эффекты является не цельная молекула иммуноглобулина Q-маркера, а лишь ее -фрагмент, в котором локализованы антигенсвязывающие участки /45/. Эффекторный участок молекулы с/с -фрагмент достоверно не влияет на функциональные параметры митохондрий /46,47/.
Интересно, что показанная Мс&еося Є/QC. способность иммуноглобулина Q миеломных больных ингибировать / г+,Независимую АТР-азу также связана с фрагментами легких цвпей, участвующими в образовании антигенсвязывающего участка в молекуле иммуноглобулина /198/. Таким образом, нельзя исключать возможность того, что в основе действия БМР (по крайней мере o G- -маркера) лежит иммунологическое сродство указанного белка к определенным компонентам мембран митохондрий (по аналогии с результатами работ /5,19,27/.
Эффект белков-маркеров может быть также связан в определенной степени с физико-химическими особенностями миеломного иммуноглобулина Q , а именно: с изменением гидрофильно-липофильно-го баланса белковой глобулы и наличием обширного гидрофобного участка на поверхности молекулы. В силу этого миеломный &$Q располагается вертикально на границе раздела фаз "вода-воздух" и "вода-масло" в модельных системах, нормальный Уд@ в тех же условиях ориентируется горизонтально /60/. Интерес представляет также аналогия между продемонстрированной Va/?ere/)otor?e/e/? еМс: повышенной гидрофобностью нормального иммуноглобулина, приобретаемой в процессе изменения конформации $ ? в среде с низким значением рН и являющейся причиной резкого повышения проницаемости липосом /257/ и данными Иванова и др., сообщивших о повышенной гидрофобности молекул JffG -маркера /24/. в процессе трансформации клетки, литературные данные не слишком обширны. Однако в последнее время появилась работа Jomosjok. Rxec yc/rl » сумевших моделировать "раковую энергетическую ситуацию в тест-системе, содержащей митохондрии и ферменты гликолиза, введением в среду инкубации белков, накапливающихся в эпителиоме Que по . Как показано, эти белки разобщают окислительное фос-форилирование в интактных митохондриях посредством увеличения ИОННОЙ проницаемости мембран, а также, подобно БМР, усиливают гликолиз и снимают эффект Пастера /250,251/.
Элбакидзе и др, показали участие низкомолекулярных тканеспе-цифических разобщителей в регулировании пролиферативных процессов в тканях /104/.
В заключение отметим, что изложенные литературные данные об изменении энергетического метаболизма при патологиях на уровне целого организма как отражающем однонаправленные изменения биоэнергетических параметров митохондрий того же организма, индуцированные, наряду с другими факторами, биологически-активными веществами эндогенного происхождения, послужили достаточным основанием для составляющей главную цель нашей работы расшифровки механизма действия и точки приложения БМР с тем, чтобы оценить роль указанных белков в нарушении энергетического метаболизма малигнизированных тканей и найти адекватные способы нормализации последнего, а также попытаться моделировать состояние энергетического обмена трансформированных клеток на основе степени изменения митохондриальных процессов м v/Tro , посредством внесения в среду инкубации митохондрий белков-маркеров роста - биологически-активных компонентов сыворотки крови организмов с очагами активной пролиферации.
Определение окислительного фосформирования
Митохондрии миокарда и печени кроликов выделяли общепринятыми методами дифференциального центрифугирования /65/. Для получения интактных митохондрий, обладающих высоким КДК, с максимальной точностью поддерживали температуру и рН растворов, приготовленных из реактивов квалификации х.ч. или ос.ч на бидис-тшілированной воде /35/.
Выделение митохондрий миокарда кролика проводили как описано в работе /30/ с некоторыми модификациями /8/. После декапита-ции животного сердце немедленно удаляли, перфузировали 0,15 М t\C (0С) 5 мин и измельчали охлажденными ножницами. Измельченную ткань заливали средой выделения следующего состава: 0,32 М сахароза, 10 мМ ЭДТА, 40 мМ никотинамид, рН 7,5 (1-2С) в соотношении 1:10 (на единицу ткани брали 10 объемов раствора) и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком до разрушения клеток (1-2 мин). Ткани миокарда новорожденных и пораженных карциномой Броун-Пирс кроликов гомогенизировали не дольше 40-60 с, в силу высокой лабильности митохондрий указанных тканей» Гомогенат переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали 10 мин при 700 а . Надосадочную жидкость аккуратно сливали и центрифугировали 15 мин при 9 000 Й . Полученный осадок митохондрий суспендировали в среде разведения: 0,25 М сахароза и 0,05 М трио //С ,рН 7,5 из расчета 0,1 мл среды на количест-во митохондрий, выделенных из I г ткани миокарда. В течение всей процедуры выделения температура не поднималась выше 4 С.
Выделение митохондрий печени кролика проводили по методу /65/ с модификациями. Часть свежевыделенной печени весом 4-5 г помещали в большой объем (500 мл) охлажденной 0,25 М сахарозы и оставляли на льду на 10-15 мин. После охлаждения ткань печени измельчали ножницами, промывали 0,25 М сахарозой и помещали в гомогенизатор, где находилось 100 мл среды выделения : 0,25 М сахароза, I мМ ЭДТА, 4 мМ трис //С ,рН 7,2. Гомогенизировали 30-40 с в три четыре хода пестика. Гомогенат центрифугировали 10 мин при 600 о . Надосадочную жидкость аккуратно сливали, фильтровали через СЛОЙ марли и центрифугировали при 8 500 а . Ватным тампоном удаляли жировой слой с поверхности супернатанта и остаток надосадочной жидкости тщательно сливали вместе с верхней рыхлой фракцией осадка. Осадок митохондрий ресуспендировали в среде выделения и дважды промывали, центрифугируя по 10 мин при 8 500 а, после чего суспендировали в среде разведения: 0,25 М сахароза, 4 мМ трис- НС& ,рН 7,2 из расчета 0,2 мл среды на количество митохондрий, выделенное из I г исходной ткани. Температура в течение всего процесса выделения не превышала 4С.
Препараты митохондрий хранили в течение всего опыта (не более двух часов) на льду в узком стаканчике для уменьшения площади контакта органелл с воздухом /34/. 2.4. Полярографическая регистрация дыхания митохондрий Для изучения дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях применяли полярографический метод исследования /34/, используя в качестве рабочего электрода стационарный платиновый электрод, а также хлорсеребряный электрод сравнения, соединенные с полярографом Р б0 (ЧССР). Потенциал 0,65 В, температура 26-0»5С, объем полярографической ячейки I мл. Измеряли скорость дыхания митохондрий в метаболических состояниях 4п, 4о, 3, 3,5, Зр на основании которых рассчитывали коэффициенты дыхательного контроля (КДК), А&Р/0 и А&Р ft /25,30,125,126,189/. Эксперименты по изучению перечисленных параметров функциональной активности митохондрий проводили согласно с сггад/, У/еЄтап /189/ и Qhaoee, /125,126/. Методика cLarc/tf, \Х/єсл?ял дает возможность анализировать метаболические состояния 4п и 3,5 (КДКЛ)/30,189/(рис. 2,6); Chart ее, \Х///ат переход 4п 3-4о-Зр (КДКЧ) /125/(рис. 2,а). Определение дыхательной активности по tcrrc/y, иУесета/? проводили с использованием двух полярографических ячеек-контрольной и опытной /30/. В контрольную ячейку вносили среду инкубации: 70 мкМ сахарозу, 150 мкМ КСС , 10 мкМ fyCtfg ,субстрат окисления (10 мкМ сукцинат, 5 мкМ глутамат, пируват, »6 -кетоглута-рат, малат) в виде натриевых солей, рН 7,4, 2,4-динитрофенол 1,5 мкмоль, QoQSH 100 нмоль, цитохром с "3/о/г?ес/ "(ПНР) 5 мкмоль, дитиотреитол "е?/?л "(ВНР) 15 мкмоль, глутатион (восст.) 15 мкмоль, цистеин 15 мкмоль. Конечный объем доводили бидистиллированной ВОДОЙ ДО І МЛ, ВНОСИЛИ охлажденной полуавтоматической пипеткой 0,025 мл суспензии митохондрий (1,5-2 мг белка) и, где указано, І мг БМР, погружали в ячейку электродный блок и регистрировали . Б течение I мин (рис 2,6). Опытную ячейку дополняли помимо сахарозы, солей и субстрата 20 мкМ Л / и акцепторной системой (5 мкМ АТР +0,05 М глюкоза + 0,2 мг гексоки-наза крист, "tSigmq "(США). Сразу после внесения митохондрий ре-гистрировали с на протяжении I мин. Вычисляли КДКЛ, равный отношению V3 5/ Vііи Л89/. Определение дыхательной активности по СлсгЛСЄ, W с проводили согласно работам /34,125/: в полярографическую ячейку помещали I мл среды инкубации следующего состава: 0,3 М сахароза, 10 мМ І ОЄ , 5 мМ К//гРО % 20 мМ трис- ЦСЄ ,рН 7,5 (в опытах с митохондриями миокарда кроликов) или 0,25 М сахароза, 20 мМ КСЄ ДО мМ ЩЮ ,$ mty&, 0,25 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-« НС ,рН 7,4 (для митохондрий печени)/34,2б1/, погружали в ячейку электродный блок и переводили перо самописца в исходное положение. Реакцию начинали добавлением 0,04 мл густой суспензии митохондрий (4-6 мг белка) и регистрировали скорость дыхания органелл в метаболическом состоянии I ( -Хрис, 2,а).
Функциональные параметры митохондрий, инкубируемых в присутствии БМР
Общепринятым этапом исследований по выяснению механизма действия различных веществ на энергетический обмен в митохондриях является сравнение ответа органелл на внесение в среду инкубации указанных веществ с ответом митохондрий на разобщи-тель-протонофор 2,4-динитрофенол (ФЛ ), повышающий протонную проводимость мембран, снижающий &Fu+ и эффективность окислительного фосфорилирования /85/.
В полярографических исследованияхповышение скорости дыхания митохондрий в состоянии 4 указывает на разобщение, поскольку интактные митохондрии не поглощают кислород в отсутствие акцепторов фосфата /85,124,125/. Следовательно, внесение в среду инкубации какого-либо реагента, ускоряющего дыхание митохондрий в 4-м метаболическом состоянии, свидетельствует о том, что данный реагент обладает разобщающим действием.
Влияние БМР и А/Р на митохондрии миокарда кролика показаны на рис. II. Очевидна однонаправленность действия указанных веществ на скорость дыхания в состоянии 4п, хотя количественно эффект различается: &Л/Р сильнее активирует дыхание митохондрий в метаболическом состоянии 4п, БМР более действенно снижает скорость окисления сукцината и пирувата в состоянии 3,5. Характерно, что влияние как БМР, так и &А/Р на энергетический обмен сильнее выражено в присутствии А/АЗ)-зависимых субстратов окисления (табл. 12).
БМР также снижают активацию дыхания в состоянии 4п, будучи добавлены в среду инкубации митохондрий однонаправленно с указанным разобщителем (рис. 7-Ю). Литературные данные свидетельствуют о способности ЮЛ/Р ускорять дыхание митохондрий как в состоянии 4, так и в состоянии 3,5 (в зависимости от концентрации разобщителя), чего не наблюдалось в наших исследованиях: напротив, 2 А/Р снижает Vo с. По-видимому, это явление обусловлено повышенной лабильностью митохондрий миокарда, вызывающей переход органелл в режим ингибирования окисления субстратов ЩУК и обратного дыхательного контроля. Кроме того, показано, что, во-первых, в определенных условиях (нарушение структуры митохондрий) стимулирующее влияние 2)Л/Р сменяется ингибирующим, во-вторых, добавление J9A/P к разобщенным или "постаревшим" органеллам вызывает снижение уровня дыхания /109,110,166,209/. Для проверки предположения об изменении ответа митохондрий на $)Л/Р как следствия ЩУК-ового торможения, мы использовали в качестве субстрата глутаминовую кислоту. По данным работ /32,33/ КДК митохондрий в присутствии глутамата, быстро удаляющего избыток ЩУК- (КДКГЛ) может служить удобной мерой сдвига митохондрий к низкоэнергетическому состоянию. Свидетельством тому, что аномальный ответ митохондрий миокарда кролика на $А/Р действительно обусловлен ЩУК-овым торможением, являются приведенные на рис. II данные по изучению дыхательной активности митохондрий, окисляющих сукцинат и пируват в присутствии глутамата (30С) - условиях, в которых образующийся ЩУК с большой скоростью переаминируется /33/. В данных условиях Ю4/Р ускоряет дыхание митохондрий в состоянии 3,5, а ингиби-рующее влияние БМР на дыхание в том же состоянии недостоверно снижено (р 0,05). Интересно, что БМР в присутствии глутамата снижают КДКЛ интактных митохондрий миокарда кролика не столь эффективно, как в случае использования других субстратов окисления (табл. I). Таким образом, ингибируюшее влияние &А/Р на дыхание митохондрий миокарда отчасти обусловлено ЩУК-овым торможением; эффект же белков-маркеров, по-видимому, более сложен. Несмотря на отличия в действии 0А/Р и БМР на функциональные параметры митохондрий, сходство в изменении скорости дыхания в метаболическом состоянии %i, индуцированном внесением в среду инкубации этих веществ, дало основания для проведения экспериментов по изучению фосфорилирующей активности митохондрий и степени сопряжения окисления с фо сформированием, заключавшихся в определении убыли неорганического фосфата (Р ) из среды инкубации параллельно с измерением потребления кислорода и последующим вычислением эффективности окислительного фосфорилирования (коэффициент Р/0). В таблице б представлены значения Р/0 митохондрий печени кролика, вычисленные на основании прямых измерений поглощения РI из среды инкубации. БМР в ходе пятиминутной инкубации ингибируют поглощение Р и кислорода (в присутствии пирувата) и резко снижают коэффициент Р/0.
