Содержание к диссертации
Введение
1. Разобщение окислительного фосфорилирования. Основные типы разобщителей 11
1.1. Основные положения хемиосмотической теории 11
1.2. Разобщающее действие протонофоров, проникающих ионов и ионофоров 12
2. Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования 17
2.1. Действие жирных кислот на природные и искусственные мембраны. Ионофорное и протонофорное действие жирных кислот 17
2.2. Действие жирных кислот на энергетические функции митохондрий 20
2.3. Разобщающее действие жирных кислот в митохондриях бурой жировой ткани 21
3. Белки внутренней мембраны митохондрий, принимающие участие в разобщающем действии жирных кислот (разобщающиебелки) .23
3.1. Семейство митохондриальных белков переносчиков анионов 23
3.2. ADP/ATP антипортер как разобщающий белок в митохондриях печени, скелетных мышц, сердца и почек 24
3.3. Аспартат/глутаматный антипортер 27
3.4. Переносчик фосфата 28
4. Пути регуляции разобщения жирными кислотами окислительного фосфорилирования в митохондриях 29
Методы исследований 33
Результаты и их обсуждение
Литература 78
- Разобщающее действие протонофоров, проникающих ионов и ионофоров
- Действие жирных кислот на природные и искусственные мембраны. Ионофорное и протонофорное действие жирных кислот
- Разобщающее действие жирных кислот в митохондриях бурой жировой ткани
- ADP/ATP антипортер как разобщающий белок в митохондриях печени, скелетных мышц, сердца и почек
Введение к работе
В клетках печени около 30% потребления кислорода митохондриями не связано с синтезом АТР и обусловлено пассивной утечкой протонов через внутреннюю мембрану органелл (Rolfe and Brand, 1997). Предполагается, что основными физиологическими функциями этого дыхания, которое В.П. Скулачевым названо свободным окислением (Скулачев, 1989; , 1998), является возрастание теплопродукции при охлаждении и участие в защите от повреждающего действия активных форм кислорода, образующегося в митохондриях (Rolfe and Brand, 1997; Скулачев, 1989; Skulachev, 1998; Skulachev, 1999a).
В митохондриях печени свободное окисление практически полностью обусловлено функционированием так называемого протонного футильного цикла, когда энергия, запасенная в форме Дц,н+, рассеивается в виде тепла благодаря пассивной утечке протонов через внутреннюю мембрану (Самарцев и Полищук, 2002). Можно выделить два основных пути пассивной утечки протонов в митохондриях. Один из этих путей обусловлен протонофорным действием свободных жирных кислот. Другой путь, без жирных кислот, по-видимому, происходит за счет пассивной диффузии протонов или при участии специальных разобщающих белков -аналогов разобщающего белка митохондрий бурого жира термогенина (Stuart at al., 2001), или непосредственно через фосфолипидный бислой (Gutknecht, 1987а), Можно ожидать, что эти пути пассивной утечки протонов будут иметь различные термодинамические характеристики, в частности, различные величины энергии активации. Низкая величина энергии активации характерна для каналов, а высокая - для переносчиков (Шольц, 1994; Herick and Kramer, 1995). Определив энергию активации, можно выяснить, какие мембранные структуры формируют пути пассивной утечки протонов при свободном окислении.
Протонофорное разобщающее действие жирных кислот в печени обусловлено, главным образом, участием белков-переносчиков, расположенных во внутренней мембране митохондрий: ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров (Andreyev at al., 1989; Samartsev at al., 1997 a; 1997b). Суммарная доля участия этих белков в разобщении достигает 80% (Samartsev at al,, 1997; Самарцев и др., 1999). Ежек и Крамер исследовали еще один из белков внутренней мембраны митохондрий - переносчик фосфата. В опытах на реконструированной системе со встроенным в липосомы переносчиком фосфата из митохондрий дрожжей они показали способность этого белка ускорять трансмембранный циклический транспорт протонов жирными кислотами (Zackova at al., 2000; Engstova at al., 2001). Вполне возможно, что переносчик фосфата также принимает участие в разобщающем действии жирных кислот в митохондриях печени. В этом случае можно ожидать, что субстрат этого переносчика - фосфат и его ингибитор мерсалил будут обладать ресопрягающим действием так же, как субстраты и ингибиторы других переносчиков анионов, участвующих в разобщении (Andreyev at al., 1989; Samartsev atal, 1997; Wieckowski and Wojtczak, 1997).
В опытах на энергизованных митохондриях показано, что жирные кислоты индуцируют захват различных моновалентных катионов, и этот процесс сопровождается набуханием митохондрий и подавляется ионами магния (Wojtczak, 1974; Schonfeld et al., 2000; 2001). Ионофорное действие жирных кислот существенно усиливается при повышении рН (Schonfeld et al., 2000; 2001). Предполагается, что в ионофорном действии участвуют только анионы жирных кислот (Schonfeld et al., 2001). Анализ литературных данных о разобщающем действии жирных кислот свидетельствует о том, что в отсутствии ионов кальция ионофорное разобщающее действие жирных кислот может протекать одновременно с протонофорным.
Возможны различные пути регуляции разобщающего действия жирных кислот. Один из них - изменение количества молекул жирных кислот, взаимодействующих с ADP/ATP- антипортером и аспартат/глутаматным антипортером, при различных воздействиях на митохондрии. Ранее Самарцевым В.Н. было установлено, что участие этих переносчиков в разобщении разнонаправлено, но в равной степени изменяется при изменении рН среды инкубации: при повышении рН от 7,0 до 7,8 степень участия в разобщении ADP/ATP- антипортера увеличивается, а аспартат/глутаматного антипортера в такой же степени уменьшается (Samartsev at al, 1997; Самарцев и др., 1999). Однако необходимы дальнейшие исследования для обоснования этого механизма регуляции.
Целью настоящего исследования является получение новых данных о механизмах и путях регуляции свободного окисления в митохондриях печени. Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:
Дать оценку температурной зависимости дыхания митохондрий в присутствии и отсутствии жирных кислот.
Исследовать влияние неорганического фосфата и ингибитора переносчика фосфата мерсалила на разобщающее действие жирных кислот.
Изучить зависимость разобщающей активности пальмитата при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров от доли анионной и протонированной форм жирных кислот.
Оценить влияние трис(оксиметил)аминометана на разобщающую активность жирных кислот.
Разобщающее действие протонофоров, проникающих ионов и ионофоров
Большинство наиболее мощных разобщителей окислительного фосфорилирования имеют относительно простую химическую структуру и являются слабыми кислотами. Константа диссоциации (рКа) их кислотной группы в пределах 5-7. Разобщители усиливают проводимость Н через модельные фосфолипидные мембраны, а также через мембраны митохондрий и хлоропластов. Такие соединения называются протонофорами, так как они нарушают сопряжение дыхания и фосфорилирования путем увеличения протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий, рассеивая, таким образом, Дц.Н+ (Skulachev etal., 1967; Skulachev, 1998; Hanstein, 1976; Terada, 1981).
В таблице 1 приведена химическая структура наиболее часто применяемых разобщителей-протонофоров. Одним из немногих химических свойств, общих для разобщителей этого типа, является наличие кислотной группы, способной обратимо связывать и отдавать протоны. Наличие этой группы является обязательным требованием для разобщения, поскольку замена способного диссоциировать протона на метил ьную группу полностью устраняет способность разобщать (Скулачев, 1969; Terada, 1981).
Эти соединения содержат также достаточно объемные гидрофобные группы, придающие молекуле существенную лилофильность, а также кратные связи, сопряженные с ионогеннои группой, что приводит к делокализации заряда в анионе и обуславливает более высокую растворимость заряженной формы в мембране (McLaughlin and Dilger, 1980;Terada, 1981).
Разобщители-протонофоры сильно отличаются друг от друга как по разобщающей, так и по протонофорной активности (Liberman et al., 1969; Bakker et al., 1973). В работах Скулачева и Либермана была впервые показана корреляция между их способностью разобщать окислительное фосфорилирование и увеличивать проводимость протонов в бислойных фосфолипидных мембранах (Liberman etal., 1969; Skulachev, 1971).
Таким образом, наличие корреляции между протонофорной и разобщающей активностью рассматривается как основной довод в пользу того, что действие разобгдителей обусловлено их способностью переносить протоны во внутренней мембране митохондрий (Liberman et al., 1969; Bekkeretal., 1973).
Молекулярный механизм переноса протонов слабыми кислотами через фосфолипидный бислой постулируется, исходя из исследований на искусственных мембранных системах, таких как плоские фосфолипидные мембраны и липосомы (Маркин и др., 1969; Чизмаджев и др., 1971; Le Blanc et al., 1971; Neumcke and Bamberg, 1975; Cohen et al., 1977; Benz et al., 1983; Kasianowicz et al., 1984). Известны несколько моделей для объяснения этого механизма. Общей их чертой является циклическое движение молекулы разобщителя: в одном направлении - в протонированной, а в противоположном - в анионной форме. Суммарным результатом этого процесса является перенос протона по градиенту ДцН (Маркин и др., 1969; Finkelstein, 1970; Le Blanc, 1971; Neumcke and Bamberg, 1975).
Скулачевым было показано, что разобщающее действие наиболее мощных разобщителей-протонофоров (SF6847, ФКФ, ХКФ) на митохондрии сердца и печени, бактериальные хроматофоры и протеолипосомы со встроенной в них цитохромоксидазой может полностью устраняться 6-кетохолестанолом. На основании полученных результатов было предположено, что в разобщающем действии этих веществ принимает участие цитохромоксидаза и (или) какие-либо другие белки внутренней мембраны митохондрий (Starkov et al., 1997; Skulachev, 1998).
Многочисленными исследованиями было убедительно доказано, что в митохондриях все энергозависимые виды транспорта веществ поддерживаются энергией ДнН+ (Скулачев, 1972; 1989; Skulachev, 1998). При этом АЧ является движущей силой при аккумуляции катиона сильного основания в матрикс или при откачивании аниона сильной кислоты из этого отсека (Скулачев, 1972; 1989; Rottenberg, 1990). В то время как ДрН способствует проникновению слабых кислот в матрикс или выходу слабых оснований из матрикса путем простой диффузии. При условии, что скорости транспорта этих ионов сравнимы со скоростью выброса Н+ протонными помпами, и, что транспортные процессы поддерживаются в течение времени, эти процессы могут привести к снижению Д Р и ДрН по отдельности или вместе и, следовательно, к разобщению окислительного фосфорилирования (Скулачев, 1972; 1989; Rottenberg, 1990).
Например, давно известно, что при аккумуляции Са2+ потребляющими кислород митохондриями проявляются все феноменологические аспекты разобщения (стимуляция дыхания, повышение АТР-азной активности, ингибирование фосфорилирования и других энергозависимых реакций). Хемиосмотическая теория объясняет этот феномен так: поскольку захват Са2+ митохондриями электрогенный, быстрый захват этих ионов сопровождается коллапсом АЧ1, и это приводит к разобщению (Скулачев, 1972; 1989; Rottenberg, 1990).
Аналогичным образом, разобщающий эффект ионофоров, таких как валиномицин в присутствии К+, объясняется как результат повышения проницаемости внутренней мембраны митохондрий для этих ионов, которые, захватываясь митохондриями с высокой скоростью, снижают АУ (Mitchell and Moyle, 1969а; 1969b; Rottenberg, 1984; 1990; Terada, 1981; Скулачев 1989).
Действие жирных кислот на природные и искусственные мембраны. Ионофорное и протонофорное действие жирных кислот
Возможны различные пути регуляции разобщающего действия жирных кислот. Первый путь регуляции - изменение количества белков-переносчиков, участвующих в разобщении, показан на примере экспрессии ADP/ATP-антипортера при гипертиреозе, когда увеличение количества этого переносчика в митохондриях после введения животным грийодтиронина сопровождается увеличением составляющей разобщения, подавляемой лигандом этого переносчика - карбоксиатрактилатом (Schonfeld at al., 1997).
Второй путь регуляции - модуляция разобщающего действия жирных кислот метаболитами энергетического обмена: глутаматом, аспартатом, цистеинсульфинатом, малатом (Самарцев, 2000; Samartsev at al., 1997; Самарцев и Зелди, 1995; Самарцев и Мохова, 1997).
Малат способен стимулировать окислительное фосфорилирование, но не разобщенное с помощью ДНФ, дыхание митохондрий и при окислении сукцината, при этом возможность окисления самого малата устраняется ротеноном (Самарцев, 1990). Действие малата усиливают NAD-зависимые субстраты дыхания, глутамат, пируват, а также тиоловые соединения, цистеин и тиомочевина. Показано, что малат может регулировать окислительное фосфорилирование и разобщенное пальмитатом дыхание, действуя на переносчик адениннуклеотидов. Большую роль в реализации регуляторного действия малата играют расположенные на наружной поверхности митохондрий в гидрофильной области SH-груттпы (Самарцев и Зелди, 1995).
Один из субстратов аспартат/глутаматного антипортера цистеинсульфинат (продукт окисления цистеина) заметно снижает ресогтрягающее действие глутамата, аспартата и диэтилпирокарбоната. В присутствии цистеинсульфината эти вещества вызывают ресопрягающее действие в более высоких концентрациях. Следовательно, ресопрягающий эффект глутамата, аспартата, и диэтилпирокарбоната обусловлен их взаимодействием с аспартат/глутаматным антипортером (Самарцев и Мохова, 1997).
Возможны и другие пути регуляции разобщающего действия жирных кислот. Один из них - изменение количества молекул жирных кислот, взаимодействующих с ADP/ATP-антипортером и аспартат/глутаматным антипортером, при различных воздействиях на митохондрии. При повышении рН среды инкубации с 7,0 до 7,8 ресопрягающее действие КАтр усиливается, а ресопрягающее действие глутамата (или аспартата) ослабляется при разобщении пальмитиновой и лауриновои кислотами. Это свидетельствует о реципрокном изменении степени участия ADP/ATP анти портера и аспартат/глутаматного антипортера в разобщающем действии жирных кислот при изменении рН среды инкубации (Самарцев, 2000).
Одним из регуляторов разобщающего действия жирных кислот является цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ). В присутствии ионов магния этот детергент почти не влияет на стимуляцию дыхания митохондрий пальмитиновой кислотой, но увеличивает ресопрягающий эффект глутамата и настолько же уменьшает ресопрягающий эффект карбоксиатрактилата, при этом их суммарный эффект (составляющий 80 %) не изменяется (Самарцев и др., 2001). Таким образом, ЦТАБ уменьшает вклад ADP/ATP антипортера и настолько же увеличивает вклад аспартат/глутаматного антипортера в разобщающее действие жирных кислот. В присутствии ЦТАБ ресопрягающие эффекты КАтр и глутамата в меньшей степени зависят от рН среды инкубации, чем в его отсутствие (Самарцев и др., 2001). Добавление к митохондриям гидрофобного катиона тетрафенилфосфония также приводит к увеличению степени участия в разобщении аспартат/глутаматного антипортера и в такой же степени к уменьшению АОР\АТР-антипортера (Самарцев и др., 1999; Samartsev and Mokhova, 1997; Samartsev at al., 2000; Самарцев и др., 2001). Изменения противоположной направленности вызываются добавлением отрицательно заряженного амфифильного соединения лаурилсульфата (Samartsev at al., 2000). Предполагается, что существуют общие механизмы влияния Н+ и ЦТАБ на разобщающее действие жирных кислот: и в том, и в другом случае разнонаправленные, но равные по величине изменения степени участия анионных переносчиков в разобщении (Самарцев и др., 2001). Полученные данные объясняются предположением о том, что жирные кислоты в анионной форме лучше доступны для ADP/ATP-антипортера, а нейтральные формы - для аспартат/глутаматного антипортера (Самарцев и др., 2001). ЦТАБ изменяет степень участия анионных переносчиков в разобщающем действии жирных кислот вследствие того, что он образует с анионами жирных кислот нейтральные комплексы. (Самарцев и др., 2001).
К регуляторам разобщающего действия жирных кислот можно отнести и этанол. Этанол в присутствии ионов магния не влияет на разобщающее действие пальмитиновой кислоты, но ослабляет ресопрягающие эффекты КАтр и глутамата при добавлении их к митохондриям по отдельности до и после жирных кислот (Самарцев и др., 2002). Вместе с тем этанол не влияет на суммарную величину ресопрягающих эффектов КАтр и глутамата. Предполагается, что участвующие в разобщении ADP/ATP-антипортер и аспартат/глутаматный антипортер функционируют как единый разобщающий комплекс с общим пулом жирных кислот (Самарцев и др., 2002). Под влиянием этанола молекулы жирных кислот приобретают способность перемещаться: при добавлении карбоксиатрактилата - от ADP/ATP-антипортера к аспартат/глутаматному антипортеру, при добавлении глутамата - в противоположном направлении (Самарцев и др., 2002).
Разобщающее действие жирных кислот в митохондриях бурой жировой ткани
Согласно гипотезе В.П. Скулачева (Skulachev, 1991), которая легла в основу современных представлений о механизме разобщающего действия жирных кислот, функцией UCP-1 и ADP/ATP-антипортера является перенос аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный, а последующий перенос недиссоциированной формы кислоты через бислой осуществляется без участия белков по механизму флип-флоп. Эта гипотеза получила свое дальнейшее развитие и экспериментальное подтверждение в работах на реконструированной системе со встроенным в липосомы UCP-1 (Jezek at al., 1998). Различные варианты этой гипотезы применяются для объяснения разобщающего действия жирных кислот при участии ADP/ATP-и аспартат/глутаматного антипортеров (Skulachev, 1998; Skulachev, 1999; Skulachev, 1999; Wojtczak and Wieckowski, 1999; Самарцев, 2000; Самарцев и др., 1999). Анионы жирных кислот с очень низкой скоростью переходят из внутреннего монослоя мембраны на наружный из-за существования высокого энергетического барьера (Jezek at al., 1998; Schonfeld, 1992). Преодолению этого барьера могут способствовать положительно заряженные группы мембранных белков или липофильные анионы (Jezek at al., 1998; Schonfeld, 1992). Энергию активации транспорта аниона жирной кислоты можно определить из температурной зависимости разобщающего действия жирных кислот, так как именно транспорт аниона жирной кислоты лимитирует этот процесс (Skulachev, 1998; Skulachev, 1999b; Skulachev, 1999; Wojtczak and Wieckowski, 1999; Skulachev, 1991; Jezek at аЦ 1998).
При исследовании температурной зависимости дыхания митохондрий все эксперименты были проведены в присутствии в среде инкубации ЭГТА, ионов магния и олигомицина. Как известно, ЭГТА, связывая ионы кальция, препятствует индукции жирными кислотами Са2+-зависимой неспецифической проницаемости митохондрий (Wieckowski and Wojtczak 1998; Chawez at al., 1999), а ионы магния подавляют ионофорное действие жирных кислот (Sharpe at al., 1994). Наличие олигомицина необходимо для подавления циклов гидролиза-ресинтеза АТР, один из них, как известно, может индуцироваться жирными кислотами (Wojtczak and Schonfeld, 1993). Ранее Самарцевым В.Н. с соавторами (Самарцев и др., 1999) показано, что в присутствии ЭГТА, ионов магния и олигомицина стимуляция дыхания митохондрий жирными кислотами обусловлена только их протонофорным действием, главным образом, при участии ADP/ATP-антипортера и аспартат/глутаматного антипортера. При исследовании температурной зависимости дыхания митохондрий необходимо также убедиться, что митохондрии не содержат эндогенных жирных кислот. Для этого исследовали влияние свободного от жирных кислот БСА на дыхание митохондрий при различной температуре. Как видно из таблицы 2, дыхание митохондрий в состоянии 4 не изменяется при добавлении в среду инкубации свободного от жирных кислот БСА. Следовательно, применяемые нами препараты митохондрий не содержат эндогенных жирных кислот. В таблице 3 приведены результаты исследования влияния повышения температуры от 13 до 37С на дыхание митохондрий в присутствии и отсутствии пальмитата. Как видно из таблицы, при повышении температуры увеличивается как скорость дыхания в состоянии 4, так и скорость дыхания в присутствии пальмитата. Однако если при повышении температуры с 13 до 37 С скорость дыхания в состоянии 4 увеличивается только в 1,7 раза, то в присутствии 40 мкМ пальмитата скорость дыхания увеличивается в 6,6 раза. При всех температурах последующее добавление ДНФ приводит к дополнительной стимуляции дыхания в 2 - 3 раза (таблица 3). Следовательно, даже при концентрации 40 мкМ пальмитат вызывает лишь частичное разобщающее действие на митохондрии, т.е. транспорт одной из форм пальмитата лимитирует процесс.
Обращает на себя внимание то, что при всех температурах зависимость скорости дыхания от концентрации пальмитата близка к линейной (рис. 3). Как известно, близкая к линейной зависимость скорости дыхания митохондрий от концентрации протонофора свидетельствует о В качестве показателя специфического разобщающего действия пальмитата предлагается использовать величину стимуляции дыхания, которая определяется как разница между скоростью дыхания митохондрий после и до добавления этой жирной кислоты. Это связано с тем, что при используемых концентрациях жирных кислот скорость дыхания в состоянии 4 является составной частью скорости дыхания в присутствии пальмитата. Как показали проведенные нами расчеты (на основании данных работ (Вестерхофф и ван Дам, 1992; Zoratti and Petrolini, 1985; Woelders at a]., 1986; Schonfeld at al., 1989; Shinohara at al., 1995)), то небольшое падение Д, которое происходит при 2-3 кратной активации дыхания пальмитатом, снижает эту составляющую лишь на 5 - 10%.
На графике Аррениуса температурная зависимость стимуляции дыхания митохондрий пальмитатом при концентрациях от 10 до 40 мкМ представляет собой два линейных участка с перегибом при 22С (рис. 5).
В таблице 4 приведены величины наблюдаемой Еа для различных состояний митохондрий. Из данных таблицы следует, что дыхание митохондрий в состоянии 4 характеризуется низкой величиной Еа, в то время как разобщающее действие пальмитата характеризуется величиной Еа в несколько раз большей. Эта величина не зависит от концентрации пальмитата, если для оценки его разобщающего действия использовалась величина стимуляции дыхания (таблица 4).
ADP/ATP антипортер как разобщающий белок в митохондриях печени, скелетных мышц, сердца и почек
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при значениях рН, когда, согласно нашим расчетам, количество анионов пальмитата значительно преобладает над числом его нейтральных молекул, в протонофорном разобщающем действии принимает участие главным образом ADP/ATP-антипортер.
Приведенные в настоящей работе, а также полученные ранее данные (Samartsev at al.,1997; Самарцев и др., 1999; Самарцев и др., 2001) свидетельствуют о том, что механизм протонофорного разобщающего действия жирных кислот более сложен, чем предполагалось ранее (Skulachev, 1998; Skulachev, 1999а, 1999b; Wojtczak and Wieckowski, 1999; Самарцев, 2000). Действительно, выявленные при сдвиге рН, равные по величине, но противоположные по направлению изменения составляющих частей разобщающей активности пальмитата, характеризующие участие в разобщении ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров, не могут быть объяснены тем, что роль этих переносчиков в разобщении заключается только в переносе анионов жирных кислот с внутреннего монослоя мембраны на наружный.
Нами установлено, что составляющая часть протонофорной активности, характеризующая участие в разобщении ADP/ATP-антипортера, повышается пропорционально увеличению доли анионов пальмитата. Ранее Скулачевым В.П., для объяснения протонофорного действия лаурилсульфата, который в растворе при нейтральных значениях рН существует только в форме анионов, было предположено, что ADP/ATP-антипортер не только переносит, но и протонирует эти анионы на наружной поверхности мембраны. Образовавшиеся нейтральные молекулы самостоятельно пересекают фосфолипидный бис л ой, где на внутренней поверхности мембраны депротонируются (Skulachev, 1998), Это в полной мере относится и к пальмитату, когда при высоких значениях рН количество его анионов значительно больше, чем нейтральных молекул. При снижении рН, когда большинство анионов пальмитата протонированы, существует другая проблема - как депротонировать нейтральные молекулы на внутренней стороне мембраны. По-видимому, депротонирование осуществляется при участии аспартат/глутаматного антипортера, который тут же переносит анион пальмитата с внутренней стороны мембраны на наружную. Аспартат/глутаматный антипортер связывает субстраты с двумя отрицательными и одним положительным зарядами (глутамат и аспартат). Поэтому можно предположить, что в его активном центре находятся как минимум две положительно- и одна отрицательно- заряженные группы. Наличие этой группы, по-видимому, и препятствует взаимодействию анионов (но не нейтральных молекул) жирных кислот с переносчиком.
В процессе переноса протонов в матрикс нейтральные молекулы жирных кислот быстро пересекают фосфолипидный бислой. По-видимому, протонирование анионов жирных кислот ADP/ATP-антипортером или депротонирование их нейтральных молекул аспартат/глутаматным антипортером происходит тоже быстро. И, следовательно, в обоих случаях единственной стадией лимитирующей процесс разобщения является перенос анионов жирных кислот с внутренней стороны мембраны на наружную. Этот процесс, как предполагается, осуществляется на наружной поверхности белка в интерфазе белок-липид, при этом отрицательно заряженная карбоксильная группа жирной кислоты взаимодействует с сайтом низкого сродства, который находится посреди мембраны, а гидрофобный ацильный хвост располагается в толще фосфолипидногобислоя (Wojtczak and Wieckowski, 1999). Если расположение этого сайта у ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров одинаково, то удельная активность этих переносчиков по отношению к транспорту анионов жирных кислот может быть равна. Недавно Самарцевым В.Н. с соавторами были получены данные, которые свидетельствуют о том, что ADP/ATP- и аспартат/глутаматный антипортеры участвуют в разобщении как единый разобщающий комплекс в соотношении 1:1 (Самарцев и др., 2002). Наличие равного количества участвующих в разобщении переносчиков объясняет равные изменения величин J] и J2 при сдвиге рН, а также равенство констант к [ ик2.
Результаты экспериментов на модельных мембранных системах свидетельствуют о том, что жирные кислоты способны переносить через гидрофобный барьер как протоны (Самарцев, 2000; Shinohara at al., 1995), так и другие, главным образом моновалентные, катионы (Sharpe at al., 1994). В опытах на энергизованных митохондриях показано, что жирные кислоты индуцируют захват различных моновалентных катионов, и этот процесс сопровождается набуханием митохондрий и подавляется ионами магния (Wojtczak, 1974; Schonfeld at al, 2000; Schonfeld at al, 2001). Это набухание не связано с индукцией кальций-зависимой неспецифической проницаемости митохондрий, так как не подавляется ЭГТА и циклоспорином A (Schonfeld at al., 2001). Проникающие ионы и ионофоры относят к разобщителям окислительного фосфорилирования, однако они вызывают лишь кратковременное разобщение, поскольку вызывают быстрое защелачивание матрикса митохондрий (Rottenberg at al, 1990). Это в полной мере относится и к жирным кислотам. Очевидно, что для пролонгирования ионофорного разобщения необходимо чтобы одновременно с катионом в матрикс переносился и протон. Наше внимание привлек TR1S, как один из потенциальных проникающих катионов, способный депротонироваться в матриксе. Ионофорное действие жирных кислот существенно усиливается при повышении рН (Schonfeld at al., 2000; Schonfeld at al., 2001). Можно полагать, что в ионофорном действии участвуют только анионы жирных кислот.
Ранее нами было показано, что в концентрации 3 мМ ионы магния не оказывают существенного влияния на протонофорную активность пальмитата (Samartsev at al., 1997а, 1999b; Samartsev and Mokhova, 1997). При этом практически полностью подавляется транспорт жирными кислотами моновалентных катионов (Sharpe at al., 1994; Wojtczak, 1974). Поэтому сопряженную с транспортом катионов разобщающую активность пальмитата, по другому говоря ионофорную активность, можно определить как изменение скорости дыхания митохондрий в присутствии жирной кислоты при добавлении ионов магния (Jjon Ju - JuMg)- При повышении концентрации ионов калия в среде инкубации до 70 мМ дыхание митохондрий в присутствии пальмитата лишь незначительно подавляется MgCl2 (таблица 10).
