Энергообеспечение и биоэнергетические характеристики митохондрий печени миноги (Lampetra fluviatilis) и лягушки (Rana temporaria) в периоды метаболической депрессии и активности Емельянова Лариса Вадимовна

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Метаболическая депрессия в природе 13

1.2. Жизненный цикл миноги и лягушки 14

1.3. Структура внутриклеточного стандартного метаболизма 20

1.4. Регуляция энергетического метаболизма. Роль митохондрий в метаболической депрессии

1.4.1. Система окислительного фосфорилирования. Метаболические состояния митохондрий по Чансу 22

1.4.2. Регуляция энергетического метаболизма в период метаболической депрессии 25

1.5. «Утечка» протонов, или разобщение окислительного фосфорилирования 30

1.5.1. Разобщители окислительного фосфорилирования

1.5.1.1. Искусственные разобщители 31

1.5.1.2. Природные разобщители 32

1.5.2. Механизм действия разобщителей: роль мембранных белков митохондрий 33

1.5.2.1. Белки внутренней мембраны митохондрий, принимающие участие в разобщении окислительного фосфорилирования 33

1.5.2.2. Гипотеза «мягкого разобщения». Механизм функционирования разобщающих белков 36

1.5.3. Универсальность свободного окисления и его регуляция в период метаболической депрессии 38

1.6. Неспецифическая проницаемость митохондрий. Физиологическое значение и регуляция 40

1.6.1. Две конформации неспецифической поры: низкопроводящая и высокопроводящая. Роль поры в Са -сигнализации и клеточной гибели 41

1.6.2. Некоторые аспекты регуляции функционирования поры 43

1.6.3. Структура поры 45

2. Материал и методы исследования

2.1. Экспериментальные животные 50

2.2. Измерение концентрации глюкозы в плазме крови 50

2.3. Исследование жирнокислотного состава плазмы крови 51

2.4. Определение свободных аминокислот в плазме крови 53

2.5. Выявление гликогена и липидов на срезах печени 55

2.6. Выделение митохондрий 56

2.7. Измерение скоростей дыхания митохондрий 57

2.8. Исследование набухания митохондрий 58

2.9. Определение содержания адениновых нуклеотидов в экстрактах митохондрий и печени 59

3. Результаты исследования

3.1. Энергетические субстраты в плазме крови миног и лягушек в периоды метаболической депрессии и активности 61

3.1.1. Содержание глюкозы 61

3.1.2. Содержание отдельных классов липидов и индивидуальных жирных кислот 63

3.1.3. Свободные аминокислоты 69

3.2. Биоэнергетические параметры митохондрий печени миног и лягушек в периоды метаболической депрессии и активности

3.2.1. Оценка параметров дыхания 74

3.2.2. Содержание адениновых нуклеотидов в митохондриях и ткани печени 85

3.3. Ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и глутамата на разобщающее действие лаурата 89

3.4. Мембранная проницаемость митохондрий печени миног и лягушек. Индукция поры и действие эффекторов поры на набухание митохондрий в разных средах инкубации. Сравнение с млекопитащими

3.4.1. Проницаемость мембран деэнергизованных и энергизованных митохондрий в растворе нитрата аммония 96

3.4.2. Эффекты ингибиторов поры на набухание митохондрий печени миног 98

3.4.3. Проницаемость митохондрий печени миног в неионизированнои изоосмотичной среде 100

3.4.4. Действие Са2+, Pi, лаурата и CsA на набухание митохондрий в неионизированнои среде 101

4. Обсуждение

4.1. Метаболизм глюкозы, липидов и свободных аминокислот в тканях миног и лягушек в разные сезоны года 104

4.2. Биоэнергетические особенности гепатоцитов пойкилотермных позвоночных животных 116

4.3. Роль АТФ/АДФ - и аспартат/глутаматного антипортеров в разобщении окислительного фосфорилирования. Вклад свободного окисления в клетках печени миног 120

4.4. Роль неспецифической проницаемости митохондрий в развитии деструктивных изменений в печени миног 122

4.5. Регуляция функционирования поры в митохондриях пойкилотермных животных 125

Выводы 129

Список литературы 131

• Система окислительного фосфорилирования. Метаболические состояния митохондрий по Чансу
• Определение свободных аминокислот в плазме крови
• Содержание отдельных классов липидов и индивидуальных жирных кислот
• Метаболизм глюкозы, липидов и свободных аминокислот в тканях миног и лягушек в разные сезоны года

Введение к работе

Метаболическая депрессия является неотъемлемой частью жизненных циклов многих животных и встречается у большинства видов беспозвоночных и всех классов позвоночных. Это явление характеризуется подавлением базальной метаболической скорости на 50 - 100% и длится до тех пор, пока организм в состоянии противостоять стрессам окружающей среды. Современные методы молекулярной биологии широко используются для выяснения механизмов регуляции метаболической депрессии. Но до настоящего времени ни молекулярные механизмы, ни процессы, связанные с контролем гипометаболизма, до конца не изучены, и фундаментальное явление метаболической депрессии остается как с биохимической, так и с физиологической точек зрения слабо освещенным. Тем не менее, за последнее десятилетие в исследовании этого феномена сделан определенный прогресс, результаты которого будут полезны для дальнейшего осмысления поставленной проблемы.

Анализ существующих фактов позволяет заключить, что центром регуляции интенсивности биоэнергетических процессов в клетке, прежде всего, следует считать митохондрии. Долгое время полагали, что основной функцией митохондрий является синтез АТФ. Поэтому наибольшее внимание было уделено регуляции сопряженного с синтезом АТФ дыхания митохондрий (Bohnensack et al., 1982; Erecinska and Wilson, 1982; Balaban, 1990). Меньшее значение придавали процессу, при котором потребление кислорода не сопряжено с синтезом АТФ. Этот процесс связан с утечкой протонов через специфические белки (АТФ/АДФ - антипортер, аспартат/глутаматный переносчик, белки-разобщители семейства UCP) внутренней мембраны митохондрий (Skulachev, 1998а; Stuart et al., 2001). Самым поразительным физиологическим свойством протонной утечки является участие в защите от повреждающего действия активных форм

кислорода, образующихся в митохондриях (Skulachev, 1998а; Kowaltowski et al., 2001). В митохондриях пойкилотермных животных скорость протонной утечки обнаруживает сезонную динамику (St-Pierre et al., 2000а; Bishop et al., 2002; Boutilier and St-Pierre, 2002). Кроме того, в конце 90-х годов стало ясно, что митохондрии играют ключевую роль в развитии и регуляции апоптоза и некроза в клетке (Skulachev, 1998b; 2000, 2002, Kim et al., 2003a; Kim et al., 2003b), открывая на мембранах неспецифическую пору (mitochondrial permeability transition pore), проницаемую для широкого спектра органических и неорганических веществ. Однако, выбор пути гибели клетки определяется ее энергосостоянием, то есть, эффективностью работы системы окислительного фосфорилирования и соотношением АТФ/АДФ.

В последнее время появилось множество доказательств, что любая
патология, связанная с энергетической депрессией, сопровождается, прежде
всего, изменениями свойств митохондрий. Низкие концентрации

адениновых нуклеотидов, повышенная проницаемость внутренней мембраны, супрессия активности электрон-транспортной цепи и системы окислительного фосфорилирования способствуют развитию многих заболеваний у высших животных, в том числе человека. Но парадоксален и примечателен тот факт, что для низших позвоночных животных эти изменения оказываются вполне приемлемыми и даже полезными в определенные фазы их жизненного цикла. Это подтверждает предположение Л.А Орбели о том, что в экстремальных условиях и при патологии высшие позвоночные, в том числе и человек, используют для выживания эволюционно более древние механизмы, изучению которых и посвящена данная работа.

Объектами наших исследований были минога речная {Lampetra fluviatiUs) и лягушка травяная {Rana temporaria). Минога - представитель класса Круглоротых, наиболее древнее из ныне живущих позвоночных животных, обладает своеобразным жизненным циклом. После активного

морского периода, в течение которого миноги питаются, паразитируя на разнообразных костистых рыбах, начинается анадромная преднерестовая миграция, которая заканчивается выметом половых продуктов и смертью. Миноги моноцикличиы. Мигранты, пришедшие в реку осенью, проводят в ней всю зиму, не питаясь. Известно, что в гепатоцитах в этот период наблюдается обратимая метаболическая супрессия (Savina and Gamper, 1998). Однако, молекулярные механизмы этого явления на уровне митохондрий детально не изучены.

В отличие от миног представители класса Амфибий размножаются многократно. Метаболическая депрессия у лягушек наблюдается в период гибернации и связана, главным образом, с гипотермией и гипоксией.

Для изучения особенностей энергообеспечения митохондрий указанных пойкилотермных животных в работе были проанализированы сезонные изменения в содержании основных энергетических субстратов в плазме крови.

Ряд энергетических характеристик митохондрий печени пойкилотермных позвоночных мы сопоставили с аналогичными характеристиками митохондрий печени гомойотермного позвоночного — мыши (линия ASN). Цели и задачи

Целью работы было

Изучение особенностей энергетического метаболизма

пойкилотермных позвоночных на примере миноги речной и лягушки травяной в периоды метаболической депрессии и активности.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать в плазме крови миног и лягушек содержание основных
метаболических субстратов: глюкозы, липидов и свободных аминокислот.

2. Оценить биоэнергетические параметры митохондрий печени:
скорости дыхания и фосфорилирования, содержание адениновх нуклеотидов

в митохондриях и в самой ткани.

3. Исследовать участие белков - переносчиков анионов внутренней митохондриалыюй мембраны (АТФ/АДФ - и аспартат/глутаматного антипортеров) в процессе разобщения дыхания и фосфорилирования.

4. Исследовать проницаемость мембран митохондрий в солевой и в неионизированной средах инкубации.

"У А-

5. Изучить действие индукторов (Са , Pj, лаурат) и ингибиторов поры
(CsA, ЭГТА, ДТТ, Mg , АДФ, БСА, гепарин) на проницаемость мембран
митохондрий.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В период метаболической депрессии содержание глюкозы и липидов в плазме крови миног и лягушек существенно снижается; количество свободных аминокислот в плазме миног увеличивается, а в плазме лягушек - уменьшается.

2. Биоэнергетические параметры митохондрий печени миног и лягушек обнаруживают сезонную изменчивость. Скорости дыхания и фосфорилирования супрессированы в состоянии гипометаболизма и восстанавливаются при выходе из этого состояния.

3. Содержание АТФ в митохондриях и в ткани печени миног и лягушек снижается в период метаболической депрессии и увеличивается в состоянии метаболической активности.

4. В митохондриях пойкилотермных животных «утечка» протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану обусловлена участием АТФ/АДФ - и аспартат/глутаматного антипортеров.

5. Изолированные митохондрии печени миног высокопроницаемы для ионов в солевых средах в период метаболической депрессии вследствие открытия неселективной поры, чувствительной к действию ингибиторов: CsA, ЭГТА, Mg²\ АДФ, БСА, гепарин.

6. В неионизированной изоосмотичной среде инкубации индукция поры в митохондриях печени возможна в присутствии Са , Pj и лаурата. Действие лаурата, как индуктора, зависит от энергосостояния митохондрий. При низкой энергизации митохондрий лаурат снижает пороиндуцирующее действие Са и Pj. В высокоэнергизованных митохондриях лаурат усиливает действие Са И Pj.

Научная новизна

6. Проведен сезонный анализ содержания в плазме крови миног и лягушек глюкозы, липидов и свободных аминокислот.

7. Продемонстрирована сезонная динамика биоэнергетических параметров митохондрий печени у исследованных видов животных.

8. Исследовано содержание адениновых нуклеотидов в печени лягушек в периоды метаболической депрессии и активности.

9. Установлено участие АТФ/АДФ - антипортера и аспартат/глутаматного переносчика в разобщении окислительного фосфорилирования в митохондриях печени миног и лягушек.

10. Исследована мембранная проницаемость митохондрий печени миног и лягушек в периоды метаболической депрессии и активности.

Таким образом, изучены некоторые новые молекулярные механизмы, лежащие в основе метаболической депрессии гепатоцитов пойкилотермных позвоночных.

Теоретическая и практическая значимость

Работа имеет, прежде всего, фундаментальное значение для эволюционной биохимии и биоэнергетики. Полученные данные дополняют сведения о функционировании и регуляции энергетического метаболизма у эктотермных животных. Кроме этого установлена важная роль митохондрий в развитии феномена обратимой метаболической депрессии. Результаты исследования могут быть использованы для дальнейшего изучения молекулярных механизмов регуляции энергетики митохондрий, а также в

прикладных целях. Обнаруженная нами на поикилотермных животных митохондриальная дисфункция, проявляющаяся в снижении синтеза АТФ, в снижении эффективности системы субстратного окисления, супрессии электрон-транспортной цепи, индукции неспецифической проницаемости мембран митохондрий, является патологичной для млекопитающих. Поэтому исследование молекулярных механизмов метаболической депрессии у поикилотермных позвоночных животных в дальнейшем может помочь в разработке новых терапевтических подходов в лечении заболеваний, связанных с митохондриальной дисфункцией.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались на Третьем Съезде Биохимического Общества в г. Санкт-Петербург, 2002; Всероссийском симпозиуме «Механизмы терморегуляции и биоэнергетики: взаимодействие функциональных систем» в г. Иваново, 2002; Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» в г. Пущино, 2003; Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы в г. Москва, 2004; IX зимней школе «Биоинформатика: от молекулярных механизмов к функциональным системам» на зоологической станции Твярминне, Финляндия, 2005. Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 статей, одна из которых в рецензируемом журнале, и 8 тезисов, четыре из которых опубликованы в иностранных изданиях. Структура диссертации

Диссертация состоит из глав: Введение, Обзор литературы, Материал и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы, Список литературы (277 источников). Работа иллюстрирована 21 таблицей и 25 рисунками.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В данном разделе обобщаются современные представления об особенностях биоэнергетики пойкилотермных животных в периоды гипометаболизма. Обзор начинается с описания жизненных циклов исследуемых объектов и подробного анализа структуры внутриклеточного энергетического метаболизма. Приведенные сведения отражают важную роль митохондрий в развитии метаболической депрессии. В связи с этим, особое внимание уделено рассмотрению наиболее актуальных на сегодняшний день вопросов, касающихся механизмов и роли свободного окисления, а также неспецифической проницаемости митохондрий.

Проблемы, связанные с энергообеспечением миног и лягушек будут рассмотрены в разделе «Результаты» и «Обсуждение».

1.1. Метаболическая депрессия в природе

Феномен метаболической депрессии встречается практически у всех видов беспозвоночных, за исключением Echinodermata (шероховики), и во всех классах позвоночных животных. Это явление может быть связано с гибернацией (млекопитающие, лягушки), торпидным состоянием (летучие мыши, колибри), анаэробиозом (моллюски, черепахи, ныряющие млекопитающие), обезвоживанием (морские креветки, змеи и лягушки), диапаузой (эмбрионы и насекомые) (Storey 1997; Guppy et al., 1994; Hochachka and Lutz, 2001), синхонией (лососевые рыбы, морские угри, миноги) (Larsen, 1980) и т.п.

Состояние метаболической депрессии, или гипометаболизма, характеризуется снижением метаболической активности на 50-100% по сравнению со стандартной метаболической скоростью (Guppy et al., 1994; Hulbert and Else, 2000). Базальная метаболическая скорость, или стандартная метаболическая скорость, - это скорость метаболизма в состоянии покоя организма в термонейтральных условиях, соответствующих температуре тела

(Hulbert and Else, 2000). Известно, что в период многомесячной глубоководной аноксии метаболическая скорость в печени пресноводной черепахи Chrysemus picta снижается на 94%, а в мозге на 50% (Hochachka et al., 1997). При отсутствии пищи и воды некоторые виды лягушек и змей депрессируют метаболические скорости скелетной мускулатуры на 50-80% в условиях нормоксии и гипоксии (Flanigan et al., 1993; Hand 1996; Donohoe et al., 1998; Donohoe and Boutilier, 1998). Недостаток пищи снижает почти на 50% стандартную метаболическую скорость мышей {Acomys russatu) (Merkt and Taylor, 1994) и бедуинских коз (Choshniak et al., 1995).

Для пойкилотермных животных, таких как минога {Lampetra fluviatilis) и лягушка {Rana temporaria) метаболическая депрессия является естественным этапом их жизненных циклов, позволяющим выживать в условиях гипотремии, гипоксии и отсутствии экзогенного питания. Фенотипически гипометаболизм у этих животных сопровождается рядом этологическпх и морфо - физиологических изменений. Поэтому будет логично перейти к рассмотрению жизненных циклов объектов нашего исследования, уделив особое внимание описанию биоэнергетики животных в период метаболической депрессии.

1.2. Жизненный цикл миноги и лягушки

Жизненный цикл миноги начинается с личиночной стадии (пескоройки) (рис. 1). В течение 4-5 лет пескоройки лежат, зарывшись в ил в реке (Нева), отфильтровывая из воды микроорганизмы, которыми они кормятся. Затем наступает метаморфоз, сопровождающийся радикальными морфологическими изменениями: появлением ротового диска, глаз, увеличением плавников, модификацией структуры жаберных отверстий. После метаморфоза взрослые особи мигрируют в Балтийское море, где в течение 18 месяцев ведут активный образ жизни хищника, паразитируя на ракообразных и костистых рыбах (Hardisty and Potter, 1971; Youson and

Рис. 1. Диаграмма семилетнего жизненногоцнкла (I-VII) миноги речной Lampetrafluviatilis

(Hardisty, Potter, 1971). Л - стадия личинки (4.5 года), на 5-м году жизни метаморфоз: Т-трансформация, Ма - макрофтальмия, П - паразитическая фаза в море (1.5 года), Нм - нерестовая миграция в Неве (0.5 года), II — нерест и гибель.

Sower, 2001). Анадромная преднерестовая миграция половозрелых миног из Финского залива в Неву начинается в конце лета - начале осени и достигает своего пика в ноябре. С этого периода мигранты проводят всю зиму в реке, не питаясь. Отсутствие экзогенного питания у половозрелых особей представляет генетически «запрограммированный» и отрегулированный поведенческий феномен, названный «синхонией» (Larsen, 1980). За период естественного голодания у миног существенно снижается масса и сокращается длина тела, атрофируется пищеварительный тракт и редуцируется дренажная система печени (Larsen, 1980). Деструктивные изменения в паренхиме печени напоминают гистологическую картину билиарной атрезии желчных протоков новорожденного ребенка (Sterling et al., 1967). В течение всей фазы естественного голодания энергетические траты и развитие гонад осуществляется исключительно за счет мобилизации липидов и белков, главным образом, мышечной ткани, накопленных в период активного питания. Роль печени в «голодный» зимний период анадромной миграции столь незначительна, что гепатэктомированные миноги в течение нескольких недель неотличимы от ложно - оперированных животных и сохраняют уровни глюкозы крови в пределах нормы. Однако, гепатэктомия в весенний период, начиная с марта, прекращает созревание половых продуктов и приводит к преждевременной гибели животных (Larsen, 1980).

нояб дек янв февр март апр май

нояб дек янв февр март апр май

Рис. 2. Сезонные изменения содержания АТФ (А) и скорости дыхания (Б) клеток печени миног в период анадромной миграции (Savina and Gamper, 1998).

Ооцит

Кровь

JL-.

Гепатоцит

Аппарат Гольджи

"~~ ч*

Вителлогенин

Вителлогенин

Рецептор

/Г Желтое! V

тело і і Фосвитин

Е-Р комплекс

\

Рецептор(Р)

\ і Липовителлин

\

. / Фолликулярные клетки >

\ /

д у Вителлогениновьй
""* рецептор

Эстроген (Е)

Микровезикулярноеі у s^~~-fL тело / /

Ядро

ДНК U ,

Вителлогенин-мРНК /

/

/

Цитозопь /

Рис. 3. Гормональная регуляция синтеза вителлогенина в печени рыб.

Объяснение в тексте (Mommsen and Walsh, 1988).

Исследования метаболической ситуации в гепатоцитах показали, что в сентябре - октябре содержание АТФ в клетках печени сравнимо с таковым у млекопитающих, с приближением зимы происходит стремительное снижение концентрации АТФ (рис. 2 А) и нарастание АМФ. Энергетический заряд Аткинсона не превышает 0.3-0.5. В этот период в гепатоцитах наблюдаются очень низкие скорости дыхания (рис. 2 Б). Начиная с марта, энергетический обмен в гепатоцитах резко меняется, наблюдается тенденция к нарастанию АТФ и снижению АМФ, увеличиваются скорости дыхания (Savina and Gamper, 1998). Активация метаболизма в этот период связана с развитием вторичных половых признаков и окончательным формированием половых продуктов (Larsen, 1980). По-видимому, в весенний период преднерестовой миграции у миног происходят те же процессы гормональной индукции, которые были ранее описаны для некоторых видов рыб (Mommsen and Walsh, 1988).

Под влиянием гипофизарных гормонов фолликулярные клетки ооцита начинают секретировать в кровь эстроген, который проникает в гепатоциты путем ускоренной диффузии (рис. 3). Эстроген-рецепторный комплекс внутри гепатоцита связывается со специфическими участками ДНК, что приводит к активации гена вителлогенина. Далее синтез вителлогенина осуществляется на шероховатом ЭР и кровотоком доставляется к ооциту. Необходимо отметить, что эстрадиол одновременно вызывает в гепатоцитах бурный липолиз тех липидных капель, которые ждали «своего часа» всю «голодную» зиму, чтобы весной энергетически обеспечить синтез вителлогенина, необходимого для завершения созревания икринок.

Миноги - моноцикличные животные, после нереста они погибают (Hardisty and Potter, 1971; Youson and Sower, 2001).

В отличие от миног лягушки размножаются многократно на протяжении жизненного цикла. Представители вида Rana temporaria, как правило, в личиночном состоянии развиваются в воде и дышат жабрами.

Личиночный период развития длится 50 - 90 суток, после чего происходит метаморфоз, при котором возникают глубокие и многочисленные, быстро следующие друг за другом изменения в строении организма. Взрослые животные проводят на суше большую часть активного периода, питаясь насекомыми и моллюсками. Продолжительность жизни лягушек в природе невелика, 4-6 лет (в неволе 16-18 лет), а половозрелость наступает на третий год их жизненного цикла. Развитие половых продуктов происходит летом, а их окончательное созревание отмечается в конце осени и зимой (Ноздрачев и Поляков, 1994).

Осеннее понижение температуры окружающей среды сопровождается снижением пищевого рациона, что в свою очередь, приводит к снижению активности животных. В этот период животные группируются и двигаются к будущим местам зимовки по канавам и ручейкам, совершая преимущественно днем миграции на расстоянии 1-1.5 км. Травяные лягушки зимуют на дне озер и прудов, под нависающими берегами или в зарослях растительности. Явление зимней спячки, или гибернации, для них представляет сложную последовательность взаимосвязанных изменений организма в ответ на гипотермию и гипоксию. В замкнутых водоемах температура может достигать 0 - 4С, а напряжение кислорода колеблется в пределах 3-12 кПа. В таких условиях процессы жизнедеятельности у лягушек во время гибернации не прекращаются, но резко замедляются. Почти на 50 - 80% супрессируется стандартный метаболизм (Boutilier et al., 1997; Boutilier, 2001). У зимующих особей снижается артериальное давление (Pinder, 1987), повышается сродство гемоглобина к кислороду, и увеличивается в коже количество капилляров (Donohoe and Boutilier, 1998; Boutilier, 2001). Легочное дыхание прекращается, и в течение почти полугода животные живут только за счет кожного дыхания. В условиях низкого кислородного давления (рОг < 8 кПа) в тканях усиливается гликолитическое производство АТФ, что вызывает резкое снижение запасов гликогена в

печени и скелетных мышцах, а также увеличение концентрации лактата в крови в первый месяц гибернации (Donohoe and Boutilier, 1998). Во избежание полного истощения углеводных резервов в последующие месяцы животные резко снижают скорость гликолиза и переключаются на аэробный метаболизм для поддержания процессов, связанных главным образом с потреблением АТФ. Такое «гипометаболическое возмещение» подразумевает переход в новое аэробное метаболическое состояние, позволяющее успешно утилизировать избыток лактата. Следует отметить, что лактат не накапливается в скелетных мышцах животных. В печени это вещество в дальнейшем включается в глюконеогенез или вступает в общий путь катаболизма, окисляясь до углекислого газа и воды (Boutilier, 2001).

Согласно имеющимся на сегодняшний день литературным данным, биохимические особенности метаболической депрессии у разных видов амфибий подробно изучены только на мышечной ткани, и почти ничего не известно о биоэнергетике гепатоцитов и митохондрий печени. Мышцы составляют основную массу тела лягушек и, следовательно, на их долю приходится большая часть поглощаемого кислорода (Boutilier et al., 1997; West and Boutilier, 1998). Кроме того, у зимующих лягушек скелетная мускулатура испытывает наибольший кислородный дефицит по сравнению с другими тканями за счет усиления кровоснабжения кожных покровов для ускорения газообмена (Currie and Boutilier, 2001). Поэтому неудивительно, что в период метаболической депрессии в скелетной мускулатуре снижаются активности некоторых аэробных ферментов: цитратсинтазы и цитохоромоксидазы (St-Pierre and Boutilier, 2001). По мнению некоторых авторов, эти изменения могут быть следствием 1) снижения объемной плотности митохондрий, либо 2) изменения внутренних свойств этих органелл (Guderley and St-Pierre, 2002).

Известно также, что при низком напряжении кислорода уровень АТФ и значение энергетического заряда в центральных органах (мозге, легких,

почках и печени) лягушки травяной стремительно снижаются, тогда как в периферических тканях (скелетной мускулатуре) - удивительно стабильны (West and Boutilier, 1998). Такое различие в динамике адениновых нуклеотидов лишний раз подтверждает тот факт, что этот вид нельзя «ставить в ряд» с факультативными анаэробами, такими как глубоководные морские черепахи {Chrysemys picta) (Buck et al., 1993), золотые рыбки {Carassius auratus) (Van den Tillart et al., 1989), морские рачки {Artemia franciscand) (Guppy et al., 1994), способными длительное время выживать в условиях аноксии. Иначе говоря, метаболизм лягушек в период метаболической депрессии является преимущественно аэробным. Поэтому лягушки служат удобной моделью в исследовании энергетического метаболизма в период длительной гибернации.

1.3. Структура внутриклеточного стандартного метаболизма

Базальный метаболизм включает в себя множество биохимических процессов. Известно, что у млекопитающих приблизительно 90% клеточного дыхания составляет митохондриальное, из которых 20-40% затрачивается на «утечку» протонов (proton leak) через внутреннюю мембрану митохондрий. Оставшиеся 80 - 60% сопряжены с синтезом АТФ для поддержания анаболизма белков (20 - 30%), трансмембранного градиента ионов Na⁺, К⁺ (20 - 28%) и Са²⁺ (4 - 8%), активности АТФ-азы актиномиозина (2-8%), глюконеогенеза (7 - 10%) и уреогенеза (2.5 - 3%) (Brand, 1990; Rolfe and Brand, 1996; Rolfe and Brown, 1997; Hulbert and Else, 2000; St-Pierre et al., 2000a; Boutilier, 2001). Таким образом, исследователи рассчитали, что 66 -90% синтезируемой АТФ в тканях млекопитающих используется для поддержания биосинтеза белков и функционирования ионных помп (Buttgereit and Brand, 1995; Rolfe et al., 1999). Близкие значения (60 - 80%) получены на изолированных гепатоцитах черепах (Hochachka et al., 1996), радужной форели (Pannevis and Houlihan, 1992) и золотой рыбки

(Krumschnabel and Wieser, 1994). Кроме того, в клетке могут протекать многочисленные окислительные реакции, не сопряженные с синтезом ЛТФ. Этот тип внутриклеточного дыхания, альтернативный сопряженному переносу электронов и протонов электрон-транспортной цепью, был назван немитохондриальным дыханием. Микросомы и пероксисомы содержат многочисленные редокс-ферменты: ксантиноксидазу, цитохром P₄so и монооксидазы, катализирующие реакции детоксикации и окисления природных субстратов. Этот тип дыхания составляет 14 - 21% от общего клеточного дыхания (Nobes et al., 1990; Rolfe and Brand, 1996).

У большинства пойкилотермных животных метаболическая депрессия на клеточном уровне приводит к замедлению процессов производства и потребеления АТФ (Hochachka et al., 1996; Boutilier ant St-Pierre, 2000; St-Pierre et al., 2000a). В такой ситуации, супрессируются скорости метаболических путей, обеспечивающих синтез белков, жиров и углеводов, а также активность протонных футильных циклов и ионных помп, главным образом, Ыа⁺/К⁺-АТФ-азы (Guppy et al., 1994; Hand and Hardevvig, 1996; Kwast and Hand, 1996; Hochachka and Lutz, 2001). Поэтому в случае лимитирования синтеза АТФ живая клетка отдает приоритет менее энергоемким процессам. Иначе говоря, живая система в гипометаболическом состоянии подобно компьютеру начинает работать в режиме экономии энергии (Guderley and St-Pierre, 2002).

Все сказнное выше позволяет сделать вывод, что биохимическая компенсация в ответ на воздействие неблагопрятных экологических факторов, прежде всего, обусловлена изменением функциональных особенностей митохондрий. Эти органеллы заслуживают особого внимания в изучении механизмов адаптационной биохимии, потому что их основная функция сводится к энергообеспечению клетки. Система окислительного фосфорилирования является основным поставщиком АТФ у аэробных организмов.

1.4. Регуляция энергетического метаболизма. Роль митохондрий в метаболической депрессии

1.4.1. Система окислительного фосфорилироваиия.

Метаболические состояния митохондрий по Чансу

Система окислительного фосфорилироваиия включает дыхательную цепь, состоящую из четырех энзиматических комплексов (НАДН -дегидрогензы, комплекса I; сукцинатдегидрогеназы, комплекса II; цитохром - с — редуктазы, комплекса III; цитохром - с — оксидазы, комплекса IV) и АТФ - синтетазы (комплекса V). Согласно хемиосмотической теории Митчелла синтез АТФ в митохондриях осуществляется АТФ - синтетазой за счет электрохимического потенциала протонов Ацц⁺, который генерируется на внутренней мембране в результате транспорта электронов вдоль дыхательной цепи и выброса протонов в межмебранное пространство протонными помпами (Mitchell, 1961; Николе, 1985) (рис. 4).

Проанализируем под углом зрения хемиосмотической теории Митчелла стационарные режимы работы изолированных митохондрий, известные как метаболические состояния по Чансу (табл. 1) (Chance and Williams, 1956).

Сразу после внесения митохондрий в среду инкубации наблюдается
вспышка дыхания, обусловленная фосфорилированием

внутримитохондриального АДФ, которая быстро переходит в медленное дыхание, свойственное высокоэнергизованному состоянию 4. В состоянии 4 (дыхание митохондрий в присутствии субстратов и исчерпании экзогенной АДФ в среде инкубации) электрохимический потенциал протонов Ацц⁺ на внутренней мембране митохондрий достигает максимальных значений (180-230 мВ). Наблюдается термодинамическое равновесие между свободной энергией Гиббса АТФ-синтетазной реакции, называемой также фосфатным потенциалом (АТФ/АДФхРі), и Дцц⁺. Поток электронов в дыхательной цепи должен быть приостановлен. Небольшое дыхание в состоянии 4 происходит

Рис. 4. Схема окислительного фосфорилирования в митохондриях (Lehninger et al., 1993).

Таблица 1. Состояния дыхания изолированных митохондрий по Чансу

(Николе, 1985).

Состояние

Митохондрии

Субстрат

Дыхание

низкое

+ низкое

+ высокое

исчерпан низкое

нет (кислород исчерпан)

Состояние 1 +

Состояние 2 +

Состояние 3 + +

Состояние 4 + +

Состояние 5 + +

Состояние 3 можно подразделить на:

Состояние Зразобш ^: высокая скорость дыхания достигается благодаря добавлению протонофора

Состояние Зддф : высокая скорость дыхания достигается благодаря добавлению АДФ

Состояние 3i/2: промежуточное состояние, когда скорость дыхания определяется

скоростью образования АДФ (физиологическое)

потому, что внутренняя мембрана митохондрий не абсолютно непроницаема для протонов. Они могут переноситься в матрикс даже в отсутствии синтеза АТФ. Одним из факторов, определяющих утечку протонов в состоянии 4, может быть циклический перенос Са в обмен на Н (Николе, 1985).

При внесении в среду инкубации АДФ митохондрии переходят в активное метаболическое состояние (состояние 3). В результате обмена эндогенной АТФ на экзогенную АДФ транслоказой адениновых нуклеотидов в митохондриях снижается энергия Гиббса системы АТФ/АДФхР;. АТФ-синтетаза начинает работать в сторону синтеза АТФ. В состоянии 3 синтез АТФ скоррелирован с оттоком протонов по каналу протонной АТФ - азы, что влечет за собой спад Лцц⁺ на 10 - 30%. Как следствие, наступает разбалансирование равновесия между Лцц⁺ и окислительно-восстановительными потенциалами переносчиков дыхательной цепи. Усиленный транспорт электронов вдоль дыхательной цепи и выброс протонов в межмебранное пространство сопровождается «вспышкой» дыхания.

Окисление субстратов и фосфорилирование АДФ в митохондриях прочно сопряжены. Скорость использования АТФ регулирует скорость потока электронов по дыхательной цепи. Если АТФ не используется и его концентрация в клетках возрастает, то прекращается и поток электронов к кислороду. С другой стороны, расход АТФ и превращение его в АДФ увеличивает окисление субстратов и поглощение кислорода. Соотношение скорости синтеза АТФ к скорости его потребления, называется дыхательным контролем (ДК). Количественно ДК определяется как отношение скорости дыхания в состоянии 3 к скорости дыхания в состоянии 4.

Мерой стехиометрической эффективности окислительного
фосфорилирования является коэффициент окислительного

фосфорилирования АДФ/О, что эквивалентно Р/О - отношению количества

фосфорной кислоты, использованной на фосфорилирование АДФ, к атому кислорода, поглощенного в процессе дыхания.

1.4.2. Регуляция энергетического метаболизма в период метаболической депрессии

Вот уже три десятилетия вопрос о принципах регуляции энергетики митохондрий в периоды гипометаболизма остается открытым. Ранние источники содержат противоречивые данные относительно проблемы метаболической депрессии (Roberts and Chaffee 1971, 1976; Roberts et al., 1972; Genrich and Aprille, 1988). Такое расхождение представлений можно объяснить методическими сложностями и выбором объектов исследований.

В настоящее время в литературе все чаще встречаются данные о том, что при неблагоприятных условиях среды: гипотермии, гипоксии, недостатке еды, и отстуствии воды, животные обратимо супрессируют систему окислительного фосфорилирования. Митохондрии позвоночных в периоды метаболической депрессии обнаруживают низкие значения мембранного потенциала, скоростей дыхания и фосфорилирования (Bishop and Brand, 2000; St-Pierre et al., 2000b; Bishop et al., 2002). Однако молекулярные механизмы супрессии энергетического метаболизма до сих пор остаются малоизученными.

Скорость синтеза АТФ строго соответствует энергетическим потребностям клетки. Это достигается согласованной регуляцией всех этапов заключительного пути катаболизма, включающего превращение пирувата в ацетил-КоА, цитратный цикл и электрон-транспортную цепь. Увеличение скорости утилизации АТФ для совершения различных видов работы увеличивает концентрацию АДФ, что ускоряет окисление НАДН в электрон-транспортной цепи и, следовательно, повышает скорость реакций, катализируемых НАД - зависимыми дегидрогеназами. Так, окисление пирувата может происходить только в том сучае, если электроны и протоны от НАДН и ФАДН₂ поступают в дыхательную цепь. Таким образом,

отношение АТФ/АДФ и НАДН/НАД - главные модуляторы скорости реакций общего пути катаболизма.

На заключительном этапе катаболизма наиболее важными регуляторными ферментами являются пируватдегидрогеназный комплекс, цитратсинтаза, изоцитратдегидрогеназа и а - кетоглутаратный комплекс (Lehninger et al., 1993; Storey, 1997; Hagopian et al., 2004). Координированный контроль активности этих ферментов осуществляется различными способами: доступностью субстратов, ингибированием продуктами реакций, аллостерически и путем ковалентной модификации (Lehninger, 1993; Andrew, 2004; Kwon and Harris, 2004). Важное значение в регуляции активности перечисленных ферментов играет соотношение НАДН/НАД⁺. При повышении концентрации НАДН активность регуляторных ферментов снижается. В периоды метаболической депрессии у пойкилотермных животных отмечается высокое содержание митохондриальных восстановленных пиридиновых нуклеотидов, что, по-видимому, может быть причиной блокирования цикла Кребса на уровне НАД - зависимых ферментов митохондриального матрикса. Так известно, что низкая энергизация клеток печени миног (заряд Аткинсона 0.1-0.2) сопровождается высокой степенью восстановленности пиридиновых нуклеотидов (НАДН/НАД⁺) в митохондриях. Это, в свою очередь, приводит к аллостерической дезактивации пируватдегидрогеназы и блокированию других НАД - зависимых ферментов цикла трикарбоновых кислот: изоцитратдегидрогеназы, а-кетоглутаратдегидрогеназы, малатдегидрогеназы (Савина, 1992).

Есть основания полагать, что одной из важных стратегий гипометаболического состояния является регуляция функционирования АТФ - синтетазы (Hochachka and Lutz, 2001). В обычных условиях этот интегральный белок внутренней мембраны митохондрий является основным производителем АТФ. Однако при гипо- или аноксии, когда недостаток

нормоксия _н> н- н*

Рис. 5. Механизмы регуляции функционирования белков внутренней мембраны митохондрий.

При нормоксии перенос электронов по дыхательной цепи сопровождается выбросом протонов через комплексы I, III, IV внутренней мембраны в межмебранное пространство. Таким образом, на мембране создается ДцН\ заставляющий двигаться протоны по каналу АТФ-синтетазы обратно в матрикс. Параллельно под действием ДиТГ происходит синтез АТФ из АДФ. В отсутствии кислорода (аноксия) выброс протонов через дыхательные комплексы прекращается. Выброс протонов происходит через протонную АТФ-азу за счет энергии АТФ, что позволяет поддерживать ДцН⁺ на высоком уровне (Hochachka and Lutz, 2001).

кислорода является лимитирующим фактором, АТФ - синтетаза начинает усиленно откачивать протоны из матрикса, пытаясь сохранить ДЧ'_М на внутренней мембарне митохондрий (рис. 5). А это означает, что при низком напряжении кислорода, митохондрии переключатся с «производственной деятельности на потребительскую», активно используя энергию АТФ (Lisa et al., 1998).

Большинство животных умеренно снижают активность митохондриальной АТФ - азы в гипометаболическом состоянии. Например, амфибии и черепахи эффективно ограничивают потребление АТФ митохондриальной АТФ - азой, стабилизируя низкие значения мембранного потенциала. Обращаясь к этой проблеме, исследователи обнаружили, что при гипоксии в митохондриях сердца лягушки стабилизируются низкие значения Дцц⁺. Несомненно, такое ограничение обуславливает снижение каталитической активности протонной АТФ - азы (St-Pierre et al., 2000с). Как известно, одна из субъединиц АТФ - азы (IFi) ингибирует гидролиз АТФ. При гипоксии закисление матрикса в деэнергизованных митохондриях индуцирует связывание IFi субъединицы с АТФ - азой, и, в конечном итоге, снижает скорости гидролиза АТФ ферментом (Rouslin, 1991; Hochachka and Lutz, 2001).

Многие пойкилотермные животные длительное время вынуждены переживать гипотермию и гипоксию, поэтому возникает вопрос, изменяется ли сродство митохондрий к кислороду в период гипометаболизма? Известно, что у млекопитающих, подвергающихся воздействию кратковременной гипоксии, этот параметр митохондрий не изменяется (Guderley and St-Pierre, 2002). Напротив, исследования, проведенные на скелетной мускулатуре гибернирующих лягушек, обнаружили заметное увеличение сродства митохондрий к кислороду (снижение Pso) в активном метаболическом состоянии (состояние 3) по сравнению с контрольными животными (табл. 2). В настоящее время не известно, сопровождается ли изменение Р₅₀

Таблица 2. Изменение свойств митохондрий скелетных мышц лягушки Rana temporaria в период метаболической депрессии.

Параметры митохондрий Величина изменения параметра, (%)

Активность цитрате и нтазы -52

Скорости дыхания в состоянии 3 -58

Скорости дыхания в состоянии 4 -52

Скорость «протонной утечки» -51

Р$осостояния 3 -55

/>50 состояния 4 О

¹ St-Pierre and Boutilier, 2001; ² St-Pierre at al., 2000a; ³ St-Pierrc ct al., 2000b

Расчеты сделаны относительно параметров митохондрий контрольных животных.

реорганизацией митохондрий. Однако следует отметить, что увеличение сродства митохондрий к кислороду, по-видимому, имеет важное физиологическое значение, так как величина внутриклеточного Ро₂ скелетных мышц в период метаболической депрессии может быть аналогична Pso митохондрий (St-Pierre et al., 2000b).

Согласно современным представлениям немаловажная роль в определении интенсивности энергетического метаболизма принадлежит ядерному и митохондриальному геномам (Webster et al., 1993; Prabhakar et al., 1995; Scarpulla, 1997; Au and Scheffer, 1998). Митохондриальный геном содержит 37 генов, 13 из которых кодируют белковые субъединицы электрон-транспортной цепи и системы окислительного фосфорилирования. Адаптация энергетического метаболизма организмов к меняющимся условиям среды происходит путем изменения экспрессии этих генов с помощью регуляторных факторов. Эффекторами могут быть температура, кислород и АФК, адениновые нуклеотиды, НАДН или НАДФН, Ca^2f (Hochachka and Lutz, 2001). Регуляция свойств митохондрий и митохондриального биогенеза перечисленными факторами сопровождается

различными биохимическими и физиологическими проявлениями, которые проанализированы и описаны в обзорах канадских исследователей (Moyes et al., 1998; Guderley and St-Pierre, 2002). В свою очередь, ядерный геном кодирует большинство ферментов цикла Кребса, полимеразы и вспомогательные факторы, регулирующие танскрипцию и репликацию митохондриального ДНК, а также процессинг и трансляцию РНК (Scarpulla, 1997; Au and Scheffer, 1998). Поэтому, для полного понимания генетического контроля механизмов адаптационной стратегии необходимо «распутать» функции ядерного генома и межгеномной коммуникации.

1.5. «Утечка» протонов, или разобщение окислительного фосфорилирования

Ранее уже говорилось, что важным компонентом стандартной метаболической скорости является «утечка» протонов (proton leak) через внутреннюю мембрану митохондрий. Физиологическая роль этого процесса заключается в разобщении дыхания и фосфорилирования. В результате этого на мембране рассеивается Ацц⁺, и синтез АТФ прекращается. Нередко в литературе для удобства и точности определения этого процесса употребляются следующие названия: введенный Белицером и Цыбаковой термин «разобщенное дыхание» (Белицер, Цыбакова, 1939) и термин Скулачева «свободное окисление» (Скулачев, 1962, 1989). Разобщение довольно часто провоцируется специфическими веществами, способными переносить протоны в матрикс митохондрий, минуя протонофорный канал АТФ-синтетазы. В результате этого рассеивается Ацц⁺ и прекращается синтез АТФ. В качестве индукторов разобщения рассматривают большую и давно изучаемую группу веществ — разобщителей окислительного фосфорилирования (Hanstein, 1976; Terada, 1981, 1990; Skulachev, 1998а).

РССРН

>-FCCPH

_н*

н*

FCCP"^-

FCCP'

межмебранное пр остр анство

матрпкс

Рис. 6. Механизм разобщения окислительного фосфорилированин искусственным разобщителем FCCP (Николе, 1985).

7.5./. Разобщители окислительного фосфорилированин

1.5.1.1. Искусственные разобщители

В 1948 г. впервые Лумис и Липман описали разобщающую активность 2, 4 - р - динитрофенола (ДНФ) (Loomis and Lipman, 1948). Позднее в лаборатории Ленинджера было обнаружено, что ДНФ усиливает протонную проводимость в плоских фосфолипидных мембранах (Bielawski et al., 1966). После открытия FCCP и СССР в начале 60-х годов (Heytler and Prihard, 1962; Goldsby and Heytler, 1963), был обнаружен большой ряд органических соединений с относительно простой химической структурой среди акарацидов, фунгицидов и гербицидов, эффективно разобщающих окислительное фосфорилирование (Terada, 1981).

Классические искусственные разобщители - протонофоры представляют собой слабые органические кислоты с делокализованным отрицательным зарядом вследствии множественных мезомерных состояний. Делокализация заряда обеспечивает растворимость в липидном слое мембраны и циклическое движение молекулы разобщителя в одном направлении - в протонированной, а в другом - в анионной формах (рис. 6).

Суммарным результатом этого процесса является перенос протона по градиенту Ацш-в матрикс митохондрий (Mitchell, 1961; Skulachev, 1998а).

1.5.1.2. Прародые разобщители

Среди природных веществ - разобщителей большой интерес представляют жирные кислоты. Исследования разобщающего действия жирных кислот продолжаются почти полстолетия. На протяжении многих лет внимание к жирным кислотам как к эндогенным разобщителям было направлено в основном на изучение их роли в термогенезе (Skulachev, 1991). В 60-х годах достаточно подробно было описано действие жирных кислот на митохондрии, которое заключалось в активации латентной АТФ - азы, ингибировании АТФ/Pj обменной реакции, стимуляции дыхания в состоянии 4, снижении величины Р/О и набухании митохондрий (Scholefield, 1956; Lehninger and Remmert, 1959; Wojtczak and Wojtczak, 1960; Wojtczak and Lehninger, 1961; Borst et al., 1962). В 1956 г. Прессман и Ларди объяснили разобщающий эффект жирных кислот их детергентным действием на мембрану (Pressman and Lardy, 1956). Это, по-видимому, справедливо для высоких концентраций жирных кислот (200 нМ олеата/мг митохондриального белка), когда митохондриальная АТФ - аза становится нечувствительной к атрактилозиду, олигомицину и зависит от содержания в среде Mg²⁺ (Vaartjes and Van den Bergh, 1978).

Эффективность разобщающего действия жирных кислот зависит от длины углеродной цепи, степени ненасыщенности и строения функциональной группы (Gutknecht, 1988; Wojtcak and Shonfeld, 1993; Winkler and Klingenberg, 1994; Jezek et al., 1997a; Jezek et al., 1997b; Penzo et al., 2002). Наиболее эффективны жирные кислоты с длиной углеродной цепи от 10 до 16 атомов углерода. При увеличении длины цепи до 18 и 20 атомов углерода активность резко снижается (Winkler and Klingenberg, 1994, Самарцев, 2000). Количество и положение двойных связей в углеродной

цепи также влияет на степень разобщения окислительного фосфорилирования (Rottenberg and Hashimoto, 1986).

По характеру своего действия жирные кислоты похожи на классические искусственные разобщители, что позволило говорить о наличие общего механизма действия (Schonfeld, 1989; Kamp and Hamilton, 1992). Однако заметный прогресс в этом вопросе был достигнут в 90-х годах, когда стало ясно, что в разобщающем действии жирных кислот принимают участие белки внутренней мембраны митохондрий.

1.5.2. Механизм действия разобщителей: роль мембранных белков митохондрий

1.5.2.1. Белки внутренней мембраны митохондрий, принимающие участие в разобщении окислительного фосфорилирования

Во внутренней мембране митохондрий локализованы не менее
двадцати транспортных систем, которые необходимы для нормального
функционирования окислительного фосфорилирования, цикла

трпкарбоновых кислот, метаболизма аминокислот, для транспорта восстановительных эквивалентов и для работы других метаболических путей, ферменты которых расположены между цитозолем и матриксом митохондрий (Klingenberg, 1970). Некоторые из этих белков помимо своих основных функций принимают участие в разобщении окислительного фосфорилирования. Установлено, что протонофорное разобщающее действие жирных кислот в митохондриях может быть опосредовано АТФ/АДФ -антипортером (Andreyev et al., 1989), аспартат/глутаматным антипортером (Samartsev et al., 1997a), дикарбоксилатным и фосфатным переносчиками (Wi^ckowski and Wojtczak, 1997; Woj'tczakand Wiqckowski, 1999).

А ТФ/АДФ - антипортер

Идея о существовании в митохондриях особых белков, которые участвуют в разобщающем действии жирных кислот, была выдвинута в 90-х годах Скулачевым (Skulachev, 1991). По мнению автора, ионизированная

карбоксильная группа молекулы жирной кислоты в силу особенностей своего строения имеет локализованный отрицательный заряд. Этот заряд сильно гидратирован, что предотвращает диффузию аниона жирной кислоты через гидрофобный слой мембраны. Поэтому в отличие от классических разобщителей (ДНФ, FCCP) транспорт депротонированной формы жирной кислоты возможен только при участии белковых переносчиков (Wojtczak and Schonfeld, 1993; Skulachev, 1998; Wojtczak and Wi?ckowski, 1999). Эксперименты, проведенные на митохондриях мышц и печени, показали, что разобщение, индуцированное низкими концентрациями жирных кислот, подавляется Катр, атрактилозидом, бонгкрековой кислотой, которые являются ингибиторами АТФ/АДФ - антипортера, и субстратом АДФ. Наибольшее ресопрягающее действие оказывал Катр: повышал мембранный потенциал и снижал протонную проводимость митохондриальной мембраны (Brustovetsky et al., 1992; Simonyan and Skulachev, 1998). В пользу того, что АТФ/АДФ - антипортер принимает участие в разобщающем действии жирных кислот, можно привести следующие доводы. Точечная мутация АТФ/АДФ - антипортера в дрожжах не только ингибирует данный переносчик, но и сильно снижает разобщающую активность жирных кислот в митохондриях, изолированных из мутантных форм дрожжей (Polcic et al., 1997). Ежек и соавторы (Jezek et al., 1998) показали, что деления гена АТФ/АДФ - антипортера предотвращает ресопрягающий эффект Катр в митохондриях дрожжей.

Экспериментальные исследования с применением полимеразной цепной реакции и дот-блотинг гибридизации показали, что ресопрягающий эффект ингибиторов АТФ/АДФ - антипортера строго коррелирует с содержанием переносчика в тканях. В настоящее время известно, что в митохондриях сердца, скелетной мускулатуры (Brustovetsky et al., 1992) и почек (Schonfeld, 1990) содержание АТФ/АДФ - антипортера выше, чем в митохондриях печени, соответственно, и разобщающее активность жирных

кислот в большей степени выражена в мышечной ткани и почках. Позднее соответствующая взаимосвязь была обнаружена в митохондриях, где генная экспрессия переносчика определялась уровнем тироидных гормонов в организме животных (Schonfeld, 1990; Schonfeld et al., 1997).

Аспартат/глутаматный переносчик

В лаборатории Скулачева было установлено, что глутамат, аспартат и
диэтилпирокарбонат также ресопрягают дыхание митохондрий,

разобщенное жирными кислотами (Samartsev et al., 1997а). Это позволило
заключить, что аспартат/глутаматный переносчик принимает участие в
разобщающем действии жирных кислот. Кроме того, было обнаружено рН -
зависимое реципрокное изменение степени участия АТФ/АДФ - антипортера
и аспартат/глутаматного переносчика в разобщающем действии жирных
кислот (Samartsev et al., 1997b). Повышение рН среды инкубации с 7.0 до 7.8
приводило к ослаблению ресопрягающего эффекта глутамата и усилению
ресопрягающего эффекта Катр. В митохондриях печени крыс

ресопрягающий эффект совместного действия Катр и глутамата не превышает 80%. Для объяснения этого феномена было выдвинуто предположение о протонировании и депротонировании соответствующих функциональных групп переносчиков: остатков лизина в АТФ/АДФ -антипортере и остатков гистидина в аспартат/глутаматном антипортере (Samartsev et al., 1997b; Самарцев и др., 1999). Позднее Скулачевым применительно к АТФ/АДФ - антипортеру, была предложена модель разобщения жирными кислотами, предполагающая протонирование их карбоксильных групп в субстратном центре переносчика (Skulachev, 1998а).

Оставшиеся 20% ресопрягающего действия могут быть обусловлены участием дикарбоксилатного либо фосфатного переносчиков внутренней мембраны митохондрий (Wiekowski and Wojtczak, 1997; Skulachev, 1999).

Белки семейства UCP

Конец XX века ознаменовался открытием целого семейства белков, гомологичных термогенину. Они были названы разобщающими белками (uncoupling proteins, UCPs). В настоящее время известны шесть представителей этого семейства UCP1 - 6 (Nicholls, 1979; Boss et al., 1997; Fleury et al., 1997; Sanchis et al., 1998; Mao et al., 1999; Stuart et al., 1999a; Skulachev, 1999; Boss et al., 2000; Raimbault et al., 2001; Vianna et al., 2001; Schrauvven and Hesselink, 2002; Rousset et al., 2004; Sokolova and Sokolov, 2005).

Функции белков - разобщителей UCPs до конца не изучены. Есть основания считать, что представители этого семейства участвуют в регуляции энергетического метаболизма (Воуег et al., 1998), иммунитета (Arsenijevic et al., 2000) и ожирения (Esterbauer et al., 2001). Вместе с тем, многие авторы полагают, что гомологи регулируют процессы, связанные с образованием в митохондриях АФК, снижая мембранный потенциал и тем самым, защищая клетку от процессов перекисного окисления липидов, повреждения белков и ДНК (Skulachev, 1999; Negre-Salvayre et al., 1997; Stuart et al., 1999; Schrauvven and Hesselink, 2002; Erlanson-Albertsson, 2003).

1.5.2.2. Гипотеза «мягкого разобщения». Механизм функционирования разобщающих белков

Для объяснения физиологической роли разобщения и механизма функционирования белков-разобщителей в 90-х годах Скулачевым была предложена концепция «мягкого разобщения» (mild uncoupling). Согласно этой гипотезе митохондрии обладают особым защитным механизмом, предотвращающим резкое повышение Ацц+ в состоянии 4 (Skulachev, 1998а). Когда потребление кислорода по пути фосфорилирующего дыхания тормозится из-за исчерпания АДФ и накопления АТФ, происходит образование АФК, которые, повреждая внутреннюю мембрану митохондрий,

Матрикс

Цитозопь

Рис. 7. Модель функционирования АТФ/АДФ - антипортера как разобщающего белка (Skulachev, І998а). Объяснение представлено в тексте.

приводят к запуску в клетке «программы самоуничтожения». В таких условиях механизм «мягкого разобщения» инициирует «неомическую утечку» протонов через митохондриальную мембрану. Этот феномен заключается в повышении проницаемости мембраны к протонам посредством специфических белков при превышении Дцн+ порогового значения, что предотвращает генерацию АФК. Разобщающий белок выполняет функцию челнока, переносящего анион жирной кислоты (рис. 7). На внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны анион жирной кислоты («FA") присоединяет ион «Н* (1), откачиваемый из митохондрий ферментами дыхательной цепи. Получающаяся при этом протонированная форма жирной кислоты («FAH) диффундирует через внутреннюю мембрану (2) и диссоциирует на матриксной поверхности мембраны на ионы «FA~ и иЬГ (3). Последний компенсирует нехватку Н' внутри митохондрий. Анион nFA" образует с катионом лиганда иС⁺ белка -разобщителя электронейтральный комплекс пА' пС⁺ (4), который

возвращается на внешнюю поверхность внутренней мембраны. При захвате протонов ("Н⁺) из межмембранного пространства этот комплекс разрушается, в результате чего образуется нейтральная молекула жирной кислоты (hFAH) и пС⁺ (5). Вследствие разности мембранного потенциала пС⁺ диффундирует на внутреннюю поверхность мембраны (6).

Однако, несмотря на очевидный прогресс в понимании природы разобщения окислительного фосфорилирования, точный механизм функционирования разобщающих белков до сих пор остается неясным.

1.5.3. Универсальность свободного окисления и его регуляция в период метаболической депрессии

Исследования последних лет показали, что значительный вклад свободного окисления митохондрий в метаболизм клетки — явление универсальное, присущее всем эукариотическнм клеткам. Его удельная величина составляет 20 - 30% от общей скорости клеточного дыхания (табл. 3) (Rolfe and Brown, 1997; Savina and Gamper, 1998; Stuart et al., 2001; St-Pierre et al., 2000). Из данных, представленных в таблице 3, можно сделать два важных вывода. Во-первых, относительный вклад свободного окисления в общую метаболическую скорость не зависит от филогенетического положения и от массы тела животного. Во-вторых, удельная величина свободного окисления не является показателем эндотермии. Действительно, если сравнить огромных размеров млекопитающее и мелкое пойкилотермное животное, скорости дыхания которых на единицу массы равны, можно видеть, что доля свободного окисления, обусловленная пассивной утечкой протонов, будет также одинакова.

Супрессия стандартного метаболизма более чем на 50% при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды вызывает резкий спад скорости свободного окисления митохондрий пойкилотермных животных (Hand and Hardewig, 1996; St-Pierre et al., 2000; Bishop et al., 2000). Логично предположить, что такая перестройка может быть еще одной

Таблица 3. Вклад «протонной утечки» в скорость дыхании гепатоцптов, изолированных in эндотермных и эктотср.мпых животных (Stuart ct al., 2001).

Животные

Дыхание (%)

Позвоночные:

>30

>25

>25

*

Savina and Gamper, 1998.

стартегией, позволяющей животным сократить энергетические траты (Boutilier, 2001; Guderley, St-Pierre, 2002) в периоды гипометаболизма. Известно также, что снижение скорости «утечки протонов» ускоряет переход поикилотермных животных в торпидное состояние и поддерживает суббазальные скорости метаболизма, и, наоборот, увеличение скорости может ускорить пробуждение (Martin et al., 1999). Доказательством отрицательной регуляции свободного окисления в митохондриях в период метаболической депрессии следует считать изменение соотношения Р/О. Ввиду того, что доставка кислорода в этот период ограничена, значение Р/О в митохондриях увеличивается (Hand and Hardewig, 1996), а скорости дыхания митохондрий в состоянии 4 снижаются (Boutilier, 2001; Bishop et al., 2002).

1.6. Нсспецифичсская проницаемость митохондрий.

Физиологическое значение и регуляция

Со времени появления хемиосмотической гипотезы Митчелла прошло более 40 лет. За это время наука обогатилась новыми доказательствами об особенностях функционирования митохондрий. Стало очевидно, что функция этих органелл не ограничивается снабжением АТФ. Важным открытием стало то, что митохондрии играют существенную роль в решении судьбы клетки, обеспечивая ее жизнедеятельность, либо запуская «программу» гибели. Такая уникальная особенность митохондрий объясняется их участием в процессах внутриклеточной Са ⁺- сигнализации, способностью быстро аккумулировать и затем освобождать большие концентрации Са (Gunter and Pfeiffer, 1990; Gunter et al., 1994; Duchen, 1999; Drummond et al., 2000).

Бесспорно, физиологическая роль Са в митохондриях уникальна. Как
известно, активность ключевых НАД - зависимых ферментов
заключительных этапов катаболизма: пируватдегидрогеназы,

изоцитратдегидрогеназы и а-кетоглутаратдегидрогеназы аллостерически регулируется Са (Gunter et al., 2000; Duchen, 2004; Jacobson and Duchen, 2004). Исследования, проведенные на интактных митохондриях, показали, что для активации пируватдегидрогеназы и а-кетоглутаратдегидрогеназы достаточно повышения внутримитохондриального Са²⁺ на 4 нмоля/мг белка (McCormack and Denton, 1984; Gunter et al., 2004). Кроме того, Ca²⁺ в митохондриях регулирует активность АТФ - синтетазы и электрон-транспортной цепи (Самойлов и Понаморенко, 1991; Gunter et al., 2004).

Проведенные в 70-х годах новаторские исследования Хантора и Хаворта (Havvorth and Hunter, 1979; Hunetr and Haworth, 1979) обнаружили, что трансдукция Са - сигнала между цитоплазмой и митохондриями может осуществляться через специфический канал, или пору во внутренней мембране митохондрий - mitochondrial permeability transition роге. Авторы

Г Г'ОССИИСКЛП | СИПЛИОТГ^д

пришли к заключению, что в физиологических условиях пора может «мерцать» и находиться в субпроводящем состоянии, регулируя в клетке Са ⁺ - гомеостаз. К сожалению, тогда результаты исследований не получили своего признания в научных кругах и были забыты почти на три десятилетия.

1.6.1. Две копформации неспецифической поры: низкопроводящая и высокопроводящая. Роль поры в Са²*- сигнализации и клеточной гибели

В конце прошлого столетия экспериментальные исследования действительно подтвердили данные Хаворта и Хантера. Синхронные измерения набухания митохондрий и потока ионов обнаружили существование поры в двух состояниях: низкопроводящем (low-conductance state, или subconductance state) и высокопроводящем (high-conductance state) (Novgorodov and Gudz, 1996; Broekemeier et al., 1998; Ichas and Mazat, 1998; Kushnareva and Sokolove, 2000). Оказалось, что в низкопроводящем состоянии пора проницаема для молекул, масса которых не превышает 300 Да, и таких ионов, как Н⁺, Ca^2f, К⁺ (Ichas and Mazat, 1998). Исследования показали, что вход Са в митохондрии блокируется специфическим

ингибитором Са - унипорта - рутением красным, а выход - CsA -ингибитором поры (Altschuld et al., 1992). Использование метода пэтч-клэмп позволило также установить, что in vitro и in situ пора «пульсирует» (flickering) (Zoratti and Szabo, 1995). Перечисленные аргументы позволили предположить, что в интактных органеллах присутствие низкопроводящей «мерцающей» поры необходимо для поддержания внутриклеточного Са²⁺-гомеостаза (Altschuld et al., 1992; Kass et al., 1992; Ichas et al., 1994; Ichas et al., 1997; Petit et al., 1996).

Интересно, что распределение митохондрий в клетке далеко не случайно и связано с метаболическими потребностями. Митохондрии образуют взаимосвязанную тубулярную сеть, имеющую многчисленные тесные контакты с ИФз - рецепторами ЭР (либо рианодиновыми рецепторами ЭР нейронов и СР сократительной ткани). Функциональным

следствием этой анатомической организации является то, что освобождение Са²⁺ из ИФз - чувствительных депо ЭР индуцирует активность поры в низкопроводящем состоянии в области контакта с митохондриями (Ichas et al., 1994; Ichas and Mazat, 1998). После ИФ₃ - индуцированного выхода Са²⁺в цитозоль происходит быстрое кратковременное перераспределение Са ⁺ из цитозоля в митохондрии. Перенос заряженных ионов в матрикс компенсируется выбросом протонов при работе дыхательной цепи. Это приводит к быстрому повышению в матриксе АрН и открытию поры. В свою очередь, пора рассеивает A^VP_M на внутренней мембране, и Са через пору экспортируется обратно в цитозоль. Выход ионов сопрвождается закислением матрикса и последующим ингибированием поры. Далее активность электрон-транспортной цепи восстанавливается, и ДЧ\, достигает исходных значений. В результате Са электрогенно с участием унипорта, вновь проникает в матрикс. Таким образом, цикл может повторяться бесконечно, вызывая «мерцание» поры и возникновение осцилляторных ионных потоков (Selivanov et al., 1998). Активность поры в субпроводящем состоянии регулируется изменением рН матрикса митохондрий (Ichas et al., 1997; Selivanov et al., 1998).

Однако, если транспорт Са в митохондрии протекает медленно и не превышает скорость электронейтрального перераспределения протонов электрон-транспортной цепью, сдвиг рН матрикса в щелочную область будет незначительным, что приведет к последующему накоплению Са²¹". В последнем случае насыщение Са²⁺-сенсоров поры может спровоцировать открытие «мегаканала», т.е. поры в высокопроводящем состоянии, когда в матрикс начинают проникать растворенные вещества массой до 1.5 кДа (Haworth and Hunter, 1979; Hunter and Haworth, 1979; Zoratti and Szabo, 1995; Crompton, 1999). Следствием этого процесса является нарушение осмотического баланса между матриксом и межмембранным пространством, матрикс набухает, внутренняя мембрана расправляется, а внешняя, площадь

которой меньше площади внутренней мембраны, разрывается. Это неизбежно ведет клетку к гибели по некротическому пути (Leist et al., 1997; Halestrap et al., 2002). Открытие мегаканала может привести к утечке цитохрома с и других проапоптических факторов, запускающих апоптоз (Petit et al., 1996; Skulachev, 1998b; Green and Reed, 1998; Skulachev, 2000).

Таким образом, переключение поры in vivo с низкопроводящей в высокопроводящую конформацию - необратимый процесс и зависит от концентрации Са²* в матриксе (Novgorodov and Gudz, 1996; Broekemeier et al., 1998; Ichas and Mazat, 1998; Kushnareva and Sokolove, 2000).

1.6.2. Некоторые аспекты регуляции функционирования поры Количество необходимого для индукции мегаканала Са²⁺ зависит от вида животного, ткани и от типа вещества, используемого в качестве дополнительного содействующего индуктора. Установлено, что в митохондриях печени, сердца, почек и адренального кортекса (Pfeiffer and Tchen, 1973; Chavez and Jay, 1987; Haworth and Hunter, 1979; Hunter and Haworth, 1979) индукция мегаканала возможна в присутствии одного Са²⁺, хотя другие агенты могут ускорить этот процесс. На изолирванных митохондриях было показано, что ЭГТА, связывая ионы Са²⁺, ингибирует пору (Zoratti and Szabo, 1995; Fontaine and Bernardi, 1999; Crompton et al., 1999). Блокирование Ca - унипорта рутением красным также предотвращает набухание митохондрий (Hunter and Haworth, 1979а; Altschuld et al., 1992; Crompton, 1999). Помимо Ca индукция поры возможна в присутствии ионов тяжелых металлов, таких как Cd²⁺, Hg²\ Pb²⁺ (Zoratti and Szabo, 1995; Belyaeva et al., 2002). Наоборот, другие двухвалентные металлы (Sr²⁺, Ва²⁺, Mn , Mg ) ведут себя как ингибиторы поры (Bernardi et al., 1992; Halestrap et al., 2002). Это обусловлено тем, что пора имеет два обособленных металлсвязывающих сайта: внешний и внутренний. Взаимодействие внешнего сайта с любыми ионами двухвалентных металлов снижает вероятность открытия поры. Связывание Са²⁺ с внутренним сайтом

модулирует активность поры, в то время как ионы других двухвалентных металлов оказывают противоположный эффект (Bernardi et al., 1993).

Накопление в матриксе Са²⁺ усиливается в присутствии Р, (Lapidus et al., 1994; Chavez et al., 1997). Объяснение эффективности Pj в качестве индуктора поры может быть двояким. Во-первых, Pj обладая высокой буферной емкостью, амортизирует изменение рН и ускоряет накопление Са *" в матриксе митохондрий, во-вторых, снижает концентрацию свободного внутримитохондриалыюго АДФ, одного из мощных ингибиторов поры (Zoratti and Szabo, 1995; Kowaltowski et al., 1996; Kushnareva et al., 1999; Havvort and Hunter, 2000), переводя его в АТФ. Кроме того, известно, что высокие концентрации Pj вызывают истощение пула адениновых нуклеотидов через активацию Р/АТФ-Mg - или Р/НАДФ " - антипортеров (Lapidus and Sokolove, 1994; Hagen et al., 2003). Это имеет большое значение при гипоксии, ишемии и реперфузии, когда митохондрии подвержены действию повышенного окислительного стресса (Hagen et al., 2003). В этом случае истощение пула адениновых нуклеотидов увеличивает вероятность открытия поры.

Среди других возможных провоцирующих факторов может быть снижение А^м (Zoratti and Szabo, 1995). С этой точки зрения разобщители не только разобщают дыхание и фосфорилирование, но и модулируют активность поры, рассеивая АЧ\, на внутренней мембране митохондрий. Однако, ряд авторов полагает, что деполяризация митохондрий per se, не является главным индуцирующим фактором неселективного канала. Судя по всему, снижение уровня АДФ и повышение Са²⁺ в цитозоле играют более важную роль в регуляции поры в присутствии разобщителей (Niemenen et al., 1995;Crompton, 1999).

Важную роль в регуляции поры играет электрон-транспортная цепь. Любой компонент дыхательной цепи потенциально может быть донором одноэлектронного восстановления кислорода, т.е. АФК. Стандартный

ингибиторный анализ показал, что генерация ЛФК с измеримыми скоростями происходит на уровне комплексов I и III (Degli Esposti et al., 1996; Fontaine et al., 1998a; Fontaine et al., 1998b; Vinogradov, 1998; Liu, 1999; Walter et al., 2000; Kowaltowski et al., 1995, 2001; Batandier et al., 2004). В последнем случае это происходит только тогда, когда естественный путь электронов в убихиноновом цикле нарушен специфическими ингибиторами. Таким образом, главный супероксид-продуцирующии компонент дыхательной цепи - комплекс I, гигантское образование, состоящее у высших позвоночных животных из 42-46 субъединиц (13 субъединиц у Рагасосст denitrificans, 19 — у одноклеточных эукариотов), несущих восемь индивидуальных редокс-компонентов (Виноградов, 2001; Kadenbach, 2003). Взаимодействуя с белками внутренней мембраны, АФК окисляют липиды и SH-группы белков, участвующих в образовании поры (Halestrap et al., 1997). Подобный окислительный стресс служит сигналом для открытия поры.

1.6.3. Структура поры

Молекулярная природа поры до сих пор остается загадкой для науки. Ее точный состав, несмотря на длительное изучение, не известен. Полагают, что в образовании поры принимают участие, главным образом, белки внутренней и внешней мембраны митохондрий.

А ТФ/ЛДФ- антипортер

Считают, что основным компонентом порового комплекса является АТФ/АДФ - антипортер (Hunter and Haworth, 1979; Zoratty and Szabo, 1995; Crompton, 1999; Halestrap et al., 2002). Оказалось, что пора чувствительна к лигандам транслоказы адениновых нуклеотидов, АДФ, АТФ, Катр и бонгкрековой кислоты (LeQuoc and LeQuoc, 1988). Транслоказа выполняет функцию заслонки поры. Транспортируя свои субстраты, обменник претерпевает структурные изменения, поочередно переходя в т- (matrix) и с-(cytosol) конформации. Связывание лиганда (бонгкрековой кислоты) с т-конформацией ингибирует пору, в то время как взаимодействие лиганда

(Катр, пиридоксальфосфата, адениновых нуклеотидов) с с-конформацией приводит к активации поры (LeQuoc and LeQuoc, 1988; Halestrap et al., 1997). Переход оконформации АТФ/АДФ - антипортера в /и-конформацию изменяет положение тиоловых групп переносчика. Такая перестройка делает транслоказу адениновых нуклеотидов не чувствительной к действию CsA (Kowaltowski et al., 1997).

Циклофіїлин D (CyP-D)

Очевидно, что транслоказа сама по себе не обуславливает открытие поры. Применение детергентов позволило выделить еще один белок, циклофилин D (CyP-D), участвующий в образовании и регуляции поры. СуР-D является митохондриальной изоформой из семейства белков циклофилинов и катализирует реакции цис- и транс - изомеризации пептидных связей в белках (Crompton, 1999). Клеточная функция циклофилинов окончательно не установлена. С точки зрения их каталитической активности предполагают, что они принимают участие в фолдинге белков. In vitro циклофилины ускоряют рефолдинг некоторых денатурированных белков (Lin et al., 1988). In vivo циклофилины катализируют фолдинг de novo протеинов, импортированных в органеллы (Matouschek et al., 1995). В свободном состоянии CyP-D может взаимодействовать со многими внутримитохондриальными белками, в том числе с транслоказой адениновых нуклеотидов. Такие факторы, как окислительный стресс, увеличение объема матрикса митохондрий и Са²⁺ повышают вероятность связывания CyP-D с АТФ/АДФ - антипортером и открытие поры (Halestrap and Davidson, 1990; Connern and Halestrap, 1996; Crompton, 1999). В начале 90-х годов стало ясно, что типичным ингибитором, блокирующим изомеразные реакции CyP-D и, соответственно, его активность, является иммунодепрессант CsA. В этой связи исследователи пришли к заключению, что пора требует обязательного взаимодействия транслоказы адениновых нуклеотидов и CyP-D.

Потенциал-зависимый анионный канал

Чуть позднее была установлена важная роль в образовании поры еще одного компонента, потенциал-зависимого анионного канала (voltage-dependent anion channel, VDAC), или порина (Crompton et al., 1998; Crompton, 1999), расположенного во внешней мембране митохондрий. АТФ/АДФ -антипортер и порин стыкуются друг с другом через CyP-D.

Идея, что порин и бензодиазепиновый рецептор могут быть интегральными компонентами поры была высказана Зоратти и Жабо (Zoratty and Szabo, 1995). Утверждение гипотетично, поскольку оно не основано на экспериментальных данных. Тем не менее, выдвинутая гипотеза не имеет контраргументов, опровергающих ее справедливость.

Литературные источники не исключают возможности участия в регуляции поры белков матрикса и цитозоля: гексокиназы, креатинкиназы, глицеролкиназы, ассоциированных с контактными сайтами внешней и внутренней мембраны митохондрий (Crompton, 1999; Halestrap et al., 2002). В настоящее время появляются данные о том, что некоторые про- (Вах и R-белок HIV-1 вируса) и антиапоптотические белки (Вс1-2 и белок vMIA цитомегаловируса) взаимодействуют с АТФ/АДФ - антипортером, запуская, таким образом, апоптоз (Marzo et al., 1998а, 1998b; Boya et al., 2001; Starkov et al., 2002). Однако некоторые аспекты этих работ следует трактовать осторожно. Существуют весомые доказательства, опровергающие эту точку зрения, несмотря на многочисленные данные об ингибирующем действии Вс1-2 на пору in situ (Kovvaltovvski et al., 2000; Yang et al., 2000).

Судя по всему, пора образуется в результате интегрированного взаимодействия белков мембран митохондрий и цитозоля клетки. Однако, бесспорно, стержневыми компонентами этой структуры следует считать белки митохондрий.

Правомерен вопрос, каким образом неспецифическая проницаемость митохондрий может быть связана с явлением метаболической депрессии. Для

того чтобы ответить на него, мы должны вспомнить два обстоятельства. Во-первых, открытие поры может иметь не только патологическое, но и физиологическое значение для клетки. Как описывалось выше, пора может принимать две различные открытые конформации. В физиологических ситуациях пора функционирует в низкопроводящем состоянии, регулируя клеточный Са - гомеостаз. В таком состоянии пора открывается кратковременно и высвобождает избытки Са из митохондрий (Gunter and Pfeiffer 1990; Ichas and Mazat, 1998). В последнее время исследователи склоняются к мысли, что в такой конфигурации пора также обеспечивает терморегуляцию в живых организмах, которые лишены бурой жировой ткани (Zoratty and Szabo, 1995). Так, в митохондриях печени гнбернирующих белок {Citellus undulates) обнаружена Са - зависимая активация дыхания (Brustovetsky et al., 1993). Идея о том, что протопорфирин IX и гемин индуцируют пору, была высказана в группе Пасторино (Pastorino et al., 1994). Таким путем пора обеспечивает транспорт протопорфирина IX и гемина, синтез которых частично протекает в митохондриях. В физиологических условиях через пору также импортируются небольшие амфипатические пептиды, такие как мастопаран (Pfeiffer et al., 1995) и IV субъединица цитохром — с - оксидазы (Sokolove and Kinnally, 1996). Во-вторых, общепринятое мнение о том, что метаболическая депрессия встречается только в природных популяциях в силу простоты и несовершенства регуляторных механизмов организма, противоречит концепции зародившегося в 90-х годах нового научного направления — митохондриальной медицины. Сегодня нет сомнений, что метаболическая депрессия, вызванная митохондриальной дисфункцией - причина многих патофизиологических процессов. Такие заболевания, как митохондриальная энцефалопатия, сепсис, ишемия, инфаркт миокарда, канцерогенез (Gellerich et al., 2004), нейродегенеративные заболевания, а также старение (Luft, 1994; 1995; Beckman and Ames, 1998; Greenamyre et al., 2001) связаны с

нарушениями морфо-функциональных особенностей митохондрий. На молекулярном уровне клинические проявления многих патологических процессов характеризуются торможением транспорта электронов по дыхательной цепи, нарушением окислительного фосфорилирования, снижением концентрации адениновых нуклеотидов, а также возникновением неселективной проницаемости внутренней мембраны митохондрий, т.е. поры (Zoratti and Szabo, 1995; Fontaine et al., 1998; Gellerich et al., 2004). Нарушение энергопродукции приводит к угнетению, прежде всего, процессов, протекающих с участием АТФ, и развитию необратимых цитологических и биохимических изменений. Поразительным и загадочным фактом является то, что подобные морфо-функциональные изменения широко распространены в природе и, по всей видимости, реализуется у низших позвоночных животных в периоды метаболической депрессии. Изучению особенностей молекулярных механизмов энергообмена в тканях пойкилотермных животных в периоды гипометаболизма мы посвятим следующие разделы диссертации.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Экспериментальные животные

В работе использовали миног, лягушек и белых мышей. Миног вылавливали в октябре - ноябре в дельте Невы во время преднерестовой миграции из Балтийского моря в реку и содержали в ваннах с холодной (3-4С) хорошо аэрируемой водой. Лягушек вылавливали в неурбанизированных зонах Ленинградской области. Осенью и зимой лягушек содержали без кормления в террариумах при температуре 3 - 4С. Мышей содержали в виварии при регулярном кормлении и при комнатной температуре.

2.2. Измерение концентрации глюкозы в плазме крови

Образцы крови животных брали из сердца (лягушка) и брюшной вены (минога). Кровь центрифугировали в гепаринизированных микропробирках в течение 5 мин при 6000 об/мин при температуре 3-4 С.

Приготовление опытной пробы

К 0.05 мл плазмы крови миноги и лягушки добавляли 0.45 мл 3% трихлоруксусной кислоты, тщательно перемешивали и центрифугировали 3 мин при 6000 об/мин. Затем 0.25 мл супернатанта отбирали в пробику и нагревали с 2.25 мл орто-толуидинового реактива в кипящей водяной бане в течение 10 мин. Перед фотометрированнем пробы охлаждали в холодной проточной воде.

Приготовление калибровочного раствора глюкозы

К 0.1 мл стандартного раствора глюкозы (5мг/мл глюкозы в 0.2% растворе бензойной кислоты) добавляли 0.4 мл дистиллированной воды, так что конечная концентрация глюкозы составляла 5.56 ммоль/л. К 0.05 мл рабочего раствора глюкозы добавляли 0.2 мл дистиллированной воды и 2.25 мл орто-толуидинового реактива. Содержимое пробирки тщательно перемешивали и инкубировали в течение 10 мин в кипящей водяной бане. Опытную и калибровочную пробы фотометрировали против контрольной

(0.25 мл воды и 2.25 мл орто-толуидинового реактива). Концентрацию глюкозы определяли по формуле:

С=Еоп/Екх11.2, ммоль/л, где Eon — оптическая плотность опытной пробы, Ек — оптическая плотность калибровочной пробы, 11.2 = 5.56x2 - пересчетный коэффициент, равный концентрации глюкозы в калибровочном растворе (5.56 ммоль/л), умноженной на соотношение внесенных в реакционную среду объемов калибровочного раствора и крови.

2.3. Исследование жирнокислотного состава плазмы крови

Липиды плазмы крови животных экстрагировали по методу Фолча (Folch et al, 1957). Для выделения суммарных фосфолипидов, триацилглнцеридов и свободных жирных кислот проводили одномерную тонкослойную хроматографию в системе гексан - диэтиловый эфир -уксусная кислота (Чеботарева, 1979). Для достижения оптимального разделения липидов на пластинках определяли содержание липидного фосфора в экстракте по методу Лоури (Lovvry et al., 1974). На старт наносили липидный экстракт, содержащий 15-20 мкг фосфора.

После разделения пластинки высушивали в течение 10-15 мин. Затем пластинку опрыскивали 50% раствором серной кислоты и помещали в термостат для проявления пятен. Идентификацию пятен проводили по свидетелям и цветным реакциям. Относительное содержание отдельных классов липидов определяли по профилю интегральной интенсивности изображения пятен с помощью программы анализа изображения Matrox Inspector (рис. 8). Абсолютные концентрации липидов (мг/мл плазмы) рассчитывали исходя из количества нанесенного на пластинку фосфора и относительному содержанию фосфолипидов и других липидов в липидном экстракте. Для определения содержания жирных кислот в разных классах

І!

І г і

Рис. 8. Профиль интегральной интенсивности изображения пятен разных классов липидов на тонкослойной хроматографической пластине. 1 - фосфолипиды, 2 - холестерин, 3 - свободные жирные кислоты, 4 - триглицериды, 5 - воска, 6 - эфиры холестерина

липидов, полученных тонкослойной хроматографией, пластинки опрыскивали 0.04% спиртовым раствором 2'-7^,-дихлорфлуоресцина. Для определения содержания жирных кислот в разных классах липидов снятые с пластинок пятна суммарных триглицеридов и фосфолипидов подвергали щелочному метилированию, а пятна свободных жирных кислот - кислому метилированию (Берчфилд и Сторрс, 1992).

Хроматографирование метиловых эфиров .жирных кислот Анализ метиловых эфиров индивидуальных жирных кислот проводился на газо-жидкостном хроматографе Руе 104 (модель 24) с пламенно - ионизационным детектором. Разделение велось на колонке (1.5м х 4 мм), покрытой хромосорбом W с размером частиц 80 - 100 мэш (Perkin Eimer, США) при температуре 192 С. В качестве жидкой фазы использавли 3% диэтиленгликольсукцинат. Газом - носителем служил гелий со скоростью потока 50мл/мин.

Пробу вводили в объеме 4-5 мкл. Идентификация жирных кислот осуществлялась по относительному времени удерживания известных стандартов жирных кислот. Количество отдельной жирной кислоты определяли по площади пика, вычисляемой как произведение высоты пика на его ширину при полувысоте, а содержание выражали в процентах от суммы.

2.4. Определение свободных аминокислот в плазме крови

Депротеинизирование образца

К 0.05 мл плазмы крови добавляли 0.5 мл 0.48 N хлорной кислоты, перемешивали, и центрифугировали 10 мин при 6000 об/мин 0.2 мл супернатанта отбирали в микропробирку и высушивали в вакууме.

Дансіширование образца

К высушенной аликвоте образца депротеинизированной плазмы добавляли 0.2 мл 0.04 М раствора карбоната лития, рН 12.2. Величину рН полученного раствора контролировали по индикаторной универсальной бумаге. При рН ниже 9.0 повторяли процедуру высушивания. При рН выше 9.0 в микропробирку добавляли 100 мкл раствора ДНС-С1 в ацетонитриле (с концентрацией 10 мг/мл) и выдерживали в темноте 40 мин при 40С, затем охлаждали в холодильнике при 4С и высушивали под вакуумом. Пробу помещали в морозильную камеру и хранили в темноте при -25 С до анализа.

Перед анализом к сухому остатку добавляли 0.02 мл 0.1 N НС1, перемешивали, центрифугировали и 1 мкл пробы вводили в колонку.

Система окислительного фосфорилирования. Метаболические состояния митохондрий по Чансу

Система окислительного фосфорилироваиия включает дыхательную цепь, состоящую из четырех энзиматических комплексов (НАДН -дегидрогензы, комплекса I; сукцинатдегидрогеназы, комплекса II; цитохром - с — редуктазы, комплекса III; цитохром - с — оксидазы, комплекса IV) и АТФ - синтетазы (комплекса V). Согласно хемиосмотической теории Митчелла синтез АТФ в митохондриях осуществляется АТФ - синтетазой за счет электрохимического потенциала протонов Ацц+, который генерируется на внутренней мембране в результате транспорта электронов вдоль дыхательной цепи и выброса протонов в межмебранное пространство протонными помпами (Mitchell, 1961; Николе, 1985) (рис. 4).

Проанализируем под углом зрения хемиосмотической теории Митчелла стационарные режимы работы изолированных митохондрий, известные как метаболические состояния по Чансу (табл. 1) (Chance and Williams, 1956).

Сразу после внесения митохондрий в среду инкубации наблюдается вспышка дыхания, обусловленная фосфорилированием внутримитохондриального АДФ, которая быстро переходит в медленное дыхание, свойственное высокоэнергизованному состоянию 4. В состоянии 4 (дыхание митохондрий в присутствии субстратов и исчерпании экзогенной АДФ в среде инкубации) электрохимический потенциал протонов Ацц+ на внутренней мембране митохондрий достигает максимальных значений (180-230 мВ). Наблюдается термодинамическое равновесие между свободной энергией Гиббса АТФ-синтетазной реакции, называемой также фосфатным потенциалом (АТФ/АДФхРі), и Дцц+. Поток электронов в дыхательной цепи должен быть приостановлен. Небольшое дыхание в состоянии 4 происходит потому, что внутренняя мембрана митохондрий не абсолютно непроницаема для протонов. Они могут переноситься в матрикс даже в отсутствии синтеза АТФ. Одним из факторов, определяющих утечку протонов в состоянии 4, может быть циклический перенос Са в обмен на Н (Николе, 1985). При внесении в среду инкубации АДФ митохондрии переходят в активное метаболическое состояние (состояние 3). В результате обмена эндогенной АТФ на экзогенную АДФ транслоказой адениновых нуклеотидов в митохондриях снижается энергия Гиббса системы АТФ/АДФхР;. АТФ-синтетаза начинает работать в сторону синтеза АТФ. В состоянии 3 синтез АТФ скоррелирован с оттоком протонов по каналу протонной АТФ - азы, что влечет за собой спад Лцц+ на 10 - 30%. Как следствие, наступает разбалансирование равновесия между Лцц+ и окислительно-восстановительными потенциалами переносчиков дыхательной цепи. Усиленный транспорт электронов вдоль дыхательной цепи и выброс протонов в межмебранное пространство сопровождается «вспышкой» дыхания. Окисление субстратов и фосфорилирование АДФ в митохондриях прочно сопряжены. Скорость использования АТФ регулирует скорость потока электронов по дыхательной цепи. Если АТФ не используется и его концентрация в клетках возрастает, то прекращается и поток электронов к кислороду. С другой стороны, расход АТФ и превращение его в АДФ увеличивает окисление субстратов и поглощение кислорода. Соотношение скорости синтеза АТФ к скорости его потребления, называется дыхательным контролем (ДК). Количественно ДК определяется как отношение скорости дыхания в состоянии 3 к скорости дыхания в состоянии 4. Мерой стехиометрической эффективности окислительного фосфорилирования является коэффициент окислительного фосфорилирования АДФ/О, что эквивалентно Р/О - отношению количества фосфорной кислоты, использованной на фосфорилирование АДФ, к атому кислорода, поглощенного в процессе дыхания. Вот уже три десятилетия вопрос о принципах регуляции энергетики митохондрий в периоды гипометаболизма остается открытым. Ранние источники содержат противоречивые данные относительно проблемы метаболической депрессии (Roberts and Chaffee 1971, 1976; Roberts et al., 1972; Genrich and Aprille, 1988). Такое расхождение представлений можно объяснить методическими сложностями и выбором объектов исследований. В настоящее время в литературе все чаще встречаются данные о том, что при неблагоприятных условиях среды: гипотермии, гипоксии, недостатке еды, и отстуствии воды, животные обратимо супрессируют систему окислительного фосфорилирования. Митохондрии позвоночных в периоды метаболической депрессии обнаруживают низкие значения мембранного потенциала, скоростей дыхания и фосфорилирования (Bishop and Brand, 2000; St-Pierre et al., 2000b; Bishop et al., 2002). Однако молекулярные механизмы супрессии энергетического метаболизма до сих пор остаются малоизученными. Скорость синтеза АТФ строго соответствует энергетическим потребностям клетки. Это достигается согласованной регуляцией всех этапов заключительного пути катаболизма, включающего превращение пирувата в ацетил-КоА, цитратный цикл и электрон-транспортную цепь. Увеличение скорости утилизации АТФ для совершения различных видов работы увеличивает концентрацию АДФ, что ускоряет окисление НАДН в электрон-транспортной цепи и, следовательно, повышает скорость реакций, катализируемых НАД - зависимыми дегидрогеназами.

Определение свободных аминокислот в плазме крови

Для фиксации гликогена использовали 2.5% глутаральдегид на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2-7.4). Небольшие кусочки ткани фиксировали в течение 1.5-2 ч при 3С, промывали в 0.2 М растворе сахарозы на 0.1 М фосфатном буфере в течение 2 часов. Обезвоживание кусочков печени проводили спиртами постепенно нарастающей крепости: 50% , 70%, 96%, 100% этанолом и абсолютным ацентоном. Ткань пропитывали перед заливкой смесью ацетона и эпона (1:1) в течение нескольких часов и на ночь переносили в свежеприготовленную смесь эпона, чтобы обеспечить удаление остатков ацетона. Обезвоженные препараты переносили в полиэтиленовые капсулы и полимеризовали заливочной смесью эпона в течение дня при 37С, в течение ночи при 45С и двое суток при 60С. Готовые срезы на 1.5 ч помещали в 0.8% раствор периодата калия на 0.23% азотной кислоте. Окисленные препараты промывали в проточной воде, затем помещали на 1.5 ч в реактивный раствор красителя Ay-S02 (Кудрявцева и др., 1970) или обычный реактив Шиффа. Окрашенные таким образом препараты ополаскивали в двух сменах дистиллированной воды, проводили через сернистые воды (3 смены по 3 мин), промывали в проточной воде (15 мин) и проводили через спирты возрастающей крепости. Препараты, обработанные Ay-SC 2, после 100% спирта заключали в глицерин, а препараты, обработанные обычным реактивом Шиффа в канадский бальзам. Выявление липидов

Для выявления липидных включений фиксацию ткани проводили по методу Идельмана (Idelman, 1965) в модификации для световой микроскопии. Температуру при этом поддерживали не выше 3С и лишь по окончанию обезвоживания поднимали до уровня комнатной. Кусочки печени толщиной 2-3 мм в течение 30 мин фиксировали в 4% глутаральдегиде, приготовленном на буфере Миллонига (Millonig, 1961). Затем ткань промывали 3 раза по 5 мин в фосфатном буфере и обезвоживали в спиртах с возрастающей крепостью: 15 мин в 30%, и в две смены по 30 мин в 70% этаноле. Обезвоженные кусочки ткани пропитывали смесью эпона в течение ночи, предварительно проинкубировав в 70% этаноле в смеси с эпоном в равных частях, 30 мин при 22 С и 30 мин при 37 С. Через сутки кусочки ткани переносили в полиэтиленовые капсулы, заливали свежей заливочной смесью эпона и пропитывали в течение часа при 37С. Дальнейшая полимеризация проводилась 12 ч при 22 С и трое суток 60 С. Срезы окрашивали метиленовой синью. Препараты заключали в канадский бальзам. Фотографии с препаратов сделаны с помошью фотокамеры Leica DFC 300FX (Германия).

Митохондрии из печени всех животных выделяли методом дифференциального центрифугирования при температуре не выше 2С. Применяли среды выделения, содержащие (мМ): 1) 250 сахарозы, 0.5 ЭГТА, 3 трис-HCl (рН 7.3) или 2) 250 сахарозы, 0.5 ЭГТА, 0.05 совкаина, 0.5 MgCl2 и 25 ед гепарина/мл, 3 трис-HCl (рН 7.3). Кусочки печени тщательно измельчали ножницами и гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком в выше указанных средах. Гомогенаты центрифугировали в течение 5 мин при 700 g на центрифуге с охлаждением марки «Janetzki К24». Супернатант фильтровали через 2 слоя марли и центрифугировали 10 минут при 10000 g. Митохондриальный осадок дважды промывали средой, содержащей (мМ): 250 сахарозы, 3 трис - НО, рН 7.3 и центрифугировали в течение 10 мин при 10000 g. При первой промывке для удаления свободных жирных кислот в среду вносили БСА 1мг/мл. Полученный в конечном итоге осадок митохондрий разводили в 0.4-0.8 мл среды без БСА. Концентрацию белка митохондрий определяли методом Лоури (Lovvry et al., 1951). Митохондриальпая суспензия содержала 15-25 мг белка/мл для миноги и лягушки и 60-80 мг/белка для мышей.

Регистрацию скорости дыхания митохондрий проводили при 26С на полярографе LP-7 с использованием платинового электрода типа Кларка. Концентрация белка митохондрий в полярографической ячейке составляла приблизительно 1 мг/мл. Среды инкубации для митохондрий пойкилотермных животных содержали (мМ): 20 КО, 50 сахарозы, 6 MgCl2, 6 КН2Р04, 20 трис - НО (рН 7.3) или 250 сахарозы, 3 MgCl2, З КН2Р04, 3 трис -НО (рН 7.3); для митохондрий мышей - 100 КО, 3 MgCl2, 3 КН2Р04, 20 трис - НО (рН 7.3) или 250 сахарозы, 3 MgCl2, З КН2Р04, 3 трис - НО (рН 7.3). Для энергизации митохондрий в ячейку добавляли следующие субстраты (мМ): 5 пирувата и 1 малата, 5 глутамата и 1 малата, 5 сукцината ± 0.005 ротенона и олигомицин 4.5 мкг/мл. Для определения участия АТФ/АДФ - и аспартат/глутаматного - антипортеров в разобщающем действии жирных кислот использовали ингибиторы этих переносчиков: Катр и Глут, соответственно.

При соблюдении перечисленных условий на митохондриях печени изучались разные метаболические состояния митохондрий: базальное дыхание (в присутствии субстратов), состояние 3 (субстрат и экзогенный ЛДФ), состояние 4 (в присутствии субстратов и исчерпании экзогенного ЛДФ в среде инкубации), разобщенное дыхание в присутствии искусственных (ДНФ, FCCP) и естественных (лаурат) разобщителей.

Скорости дыхания, дыхательные контроли (скорость дыхания в состоянии 3/ скорость дыхания в состоянии 4), АДФ/О, скорости фосфорилирования были рассчитаны из полярографических кривых. Концентрации добавляемой АДФ определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Значения ресопрягающих эффектов (ослабление разобщающего действия жирной кислоты) рассчитывали по формуле (Ju - Jup)/(Ju - Jo), где Jo и Ju - скорости дыхания митохондрий соответственно до и после добавления лаурата, Jup - скорость дыхания в присутствии Катр и лаурата или Глут и лаурата.

Набухание митохондрий (0.5 мг белка/мл) исследовали в пластиковой кювете при комнатной температуре по изменению оптической плотности митохондриальной суспензии при длине волны 540 нм на спектрофотометре СФ-46. В экспериментах использовали две среды инкубации, содержащие (мМ): 1) 125 NR,N03, 5 трис-NOj, рН 7.3; 2) 250 сахарозы, 3 трис-HCl, рН 7.3. Для измерения энергизованного набухания в среду вносили субстраты (мМ): 5 пирувата и 1 малата, 5 сукцината ± 0.005 ротенона, олигомицин 4.5 мкг/мл. Для исследования неспецифической митохондриальной проницаемости применяли различные индукторы (мМ) - 0.02 - 0.04 СаСЬ, 1-2 КН2Р04, 0.03-0.1 лаурата и ингибиторы (мМ) - 0.001 CsA, 1 ДТТ, 0.5 ЭГТА, 0.3. АДФ, 0.5 MgCl2, 25 ед гепарина /мл и БСА 10 мг/мл.

Содержание отдельных классов липидов и индивидуальных жирных кислот

У лягушек, как уже подчеркивалось, все липиды плазмы крови в абсолютных значениях многократно ниже, чем у миног, однако в процентном отношении суммарное содержание холестерина и его эфиров колеблется от 48 до 77%.

Что касается свободных жирных кислот и триглицеридов, то в крови миног в самом начале преднерестовой миграции (октябрь, ноябрь) и в крови лягушек в этот же период они обнаружены в следовых количествах. В декабре содержание триглицеридов и свободных жирных кислот в плазме миног составляет 9.7 и 3.8% соответственно. В марте содержание триглицеридов и свободных жирных кислот в плазме миног заметно увеличивается на 14.2 и 2.3% в сравнении с данными, полученными в декабре. У лягушек на протяжении гибернации концентрация триглицеридов постепенно снижается от 17.4% в декабре до 4.2% в мае. Уровень свободных жирных кислот заметно увеличивается с марта по апрель (8.4 - 10.5%).

Перейдем к анализу жирных кислот - неэстерифицированных и входящих в состав триглицеридов и фосфолипидов. Начнем с рассмотрения жирнокислотного состава триглицеридов (табл. 6). Обращает на себя внимание то, что процент насыщенных жирных кислот примерно одинаков у миног и лягушек в разные периоды голодания (17.6 - 36.9%). У всех животных преобладающей кислотой является С 16:0 - пальмитиновая. То же самое можно сказать и в отношении моноеновых кислот: границы колебания их составляют 22 - 44%. Преобладающей моноеновой кислотой и у миног и лягушек С 18:1 — олеиновая кислота. Что касается полиеновых кислот о 6 и о)-3 рядов триглицеридов плазмы крови, то здесь наблюдается диаметрально противоположная картина при сравнении круглоротых с амфибиями. У миног со-3 полиеновые кислоты, среди которых лидирует С 20:5, представлены высоким процентным содержанием (30 - 54%), у лягушек же их процентное содержание колеблется в пределах 3 - 8%. Однако, полиеновые кислоты ряда о 6 преобладают в триглицеридах лягушек (13-23%о), а у миног их в 2-4 раза меньше (6 - 7%). Лидирующей кислотой у всех перечисленных позвоночных является линолевая - С 18:2, со-6. Что касается индекса ненасыщенности, то у миног он колеблется от 226.5 в зимний период до 328 - в весенний. У лягушек во все сезоны он представлен близкими величинами 120 - 140 двойных связей на 100 молекул жирных кислот.

Что касается жирнокислотного состава фосфолипидов (табл. 7), то в противоположность триглицеридам, содержание насыщенных кислот у миног (20.3 - 35.1%) несколько ниже, чем у лягушек (31.2 - 41.9%), а моноеновых кислот, наоборот, больше (45.4 - 49%). У всех животных преобладающей моноеновой килотой также является олеиновая С 18:1. Что касается полиненасыщенных кислот семейств со-З и со-6, то в фосфолипидах плазмы миноги их количественные различия несколько сглажены в сравнении с таковыми триглицеридов, хотя кислоты со-З ряда являются преобладающими.

Анализ свободных жирных кислот (табл. 8) показывает, что в осенний период и у миног, и у лягушек они представлены лишь следовыми количествами в зимний период их удельный вклад составляет 2 - 3% и лишь весной возрастает до 5 - 10%. Насыщенные и моноеновые кислоты составляют 75 - 90% от общего состава свободных жирных кислот. Нивелируются различия в содержании полиеновых кислот со-З и со-6 семейств, столь отчетливо выраженные в триглицеридах и фосфолипидах. Индекс ненасыщенности представлен очень низкими величинами (исключение составляет лишь минога в зимний период).

Данные по суммарному пулу аминокислот обнаруживают противоположную динамику у миног и лягушек на протяжении "голодного" периода. У миног в ноябре суммарный пул аминокислот составляет 1118 ± 91 мкмоль/л, в феврале он возрастает на 32% и составляет 1486 ± 87 мкмоль/л, а в апреле пул достигает максимального значения 1943 ± 91 мкмоль/л, т.е. увеличивается на 74% в сравнении с осенью (табл. 9). У лягушек в октябре пул аминокислот составляет 1401 ± 47 мкмоль/л, в ноябре, декабре-январе он снижается на 27 - 20% и составляет, соответственно, 1030 ± 89 и 1133 ± 90 мкмоль/л. Весной в апреле пул свободных аминокислот достигает минимального значения — 827 ± 112 мкмоль/л, т.е. в сравнении с осенними величинами уменьшается более чем на 40% (табл. 10).

Сезонный анализ разветвленных аминокислот показывает, что процентное содержание лейцина и изолейцина в плазме крови миног с ноября по апрель стабильно — 10 - 12%, несмотря на количественное изменение суммарного пула аминокислот за этот период. То же самое можно сказать о валине, его сезонные колебания составляют 5 - 7.5%. У лягушки содержание в плазме крови разветвленных аминокислот выше — от 11 до 18% лейцина + изолейцина и от 7 до 12% валина. В октябре аминокислотный пул в плазме лягушек почти на 30 % представлен разветвленными аминокислотами. Далее по удельному вкладу в общий пул аминокислот следует аланин (а - и Р - формы). У миноги в плазме крови с ноября по апрель а - аланин составляет 8 - 10% от суммарного пула, а р - аланин - 10 - 12%, у лягушек - 7 - 9% и 3 - 6%, соответственно. Существенный вклад в аминокислотный пул крови миног и лягушек вносят такие аминокислоты как треонин (7 - 11% от суммарного пула для миног и 6 -9% - для лягушек) и лизин (6 - 11% - миноги и 4 - 7% - лягушки). Уровни глицина и серина, из которого образуется глицин, достаточно высоки. В плазме миног в ноябре глицин составляет 7% от суммарного пула, а в феврале и апреле - 9 - 11%. Колебания содержания серина составляют 3.5 - 5%. У лягушек глицин осенью и весной составляет 5 - 6% от суммарного пула, а в зимние месяцы - 9 - 12%. Содержание серина колеблется от 3 - 5% осенью и весной до 6 - 8% - в зимний период.

Метаболизм глюкозы, липидов и свободных аминокислот в тканях миног и лягушек в разные сезоны года

Качественный состав свободных жирных кислот удивительно похож у круглоротых и амфибий и разительно отличается от состава эстерифицированных жирных кислот (табл. 8). И у тех, и у других, большая часть (до 90%) свободных жирных кислот предствлена насыщенными и моноеновыми кислотами.

Относительное содержание фосфолипидов более или менее стабильно в плазме миног и лягушек на протяжении экспериментальных исследований (табл. 4, 5). В плазме миног Mordacia mordax весовой процент фосфолипидов составляет 34.5 при общем содержании липидов в липопротеинах крови 10.7 ± 0.5 мг/мл (Fellows and Mclean, 1982). У высших позвоночных количество фосфолипидов колеблется от 1.5 до 2.5 мг/мл, а в процентном отношении они составляют 37-53% (Maldonado et al., 2002). Таким образом, можно заключить, что ни эволюционный статус животного, ни его физиологическое состояние (стадия многомесячного голодания) не оказывают существенного влияния на удельное содержание фосфолипидов в плазме крови.

Что касается жирнокислотного состава фосфолипидов (табл. 7), то здесь жидкостность у миног связана с более высоким содержанием моноеновых кислот (45.4-49%) и полиеновых кислот со-3 типа (8.9-17%) по сравнению с лягушкой, у которой содержание моноеновых кислот ниже (26.3-37%), а полиеновых кислот w-6 типа существенно выше (24.6-27.6%).

Из представленных данных можно видеть, что у филогенетически более древней миноги жидкостность фосфолипидов плазмы крови, идущих на образование клеточных мембран, определяется высоким содержанием моноеновых кислот (около 50%) в сочетании с невысоким (15%) содержанием «низкоплавких» жирных кислот со-3 типа. Тогда как у стоящей на более высоком эволюционном уровне лягушки используется другой способ: сниженное содержание моноеновых кислот (30%) при более высоком содержании «тугоплавких» со-6 кислот. Следует отметить, что у всех обследованных млекопитающих полиеновые кислоты со-6 ряда многократно преобладают над таковыми со-3 ряда, так же как и в случае триглицеридов (Maldonado et al., 2002). С этой точки зрения, амфибии занимают позицию более близкую к млекопитающим. В процессе эволюции с выходом на сушу поикилотермных животных и развитием гомоиотермин содержание кислот типа со-3 снижалось, а содержание кислот со-6 возрастало (Крепе, 1981). Травяная лягушка, у которой часть жизни проходит в водной среде, по характеру поленовых кислот принадлежит уже к сухопутным животным. Мембраны, состоящие из жирных кислот типа со-6 более стабильны.

Больше половины общего содержания липидов в плазме миног и лягушек представлено холестерином и его эфирами, что сравнимо с млекопитающими, которые питаются круглый год. Возникает вопрос, каким образом на протяжении многомесячного голодания низшим позвоночным, в частности, миноге удается поддерживать высокие уровни липидных компонентов липопротеинов в плазме крови. У млекопитающих холестерин синтезируется на 50% в печени и на 15 - 20% - в тонком кишечнике. Миноги и лягушки в зимний период вообще не питаются, а гепатоциты находятся в низкоэнергизованном состоянии и не способны к биосинтезам (Savina and Gamper, 1998; Савина и др., 1992). Единственное предположение это то, что миноги в период анадромной миграции расходуют запасы липидов (холестерина и фосфолипидов в том числе), которые были сделаны в морской период активного питания. Так, в мышцах миног Mordacia mordax было обнаружено огромное количество холестерина (свободного и этерифицированного) - 380 мг на 100 г влажной массы мышц (Fellows and Mclean, 1982). Поддержание высоких уровней холестерина и фосфолипидов в плазме крови миног на протяжении анадромной миграции, в частности, необходимо для синтеза половых продуктов. По нашим данным лягушки на протяжении всего периода голодания расходуют липидные компоненты очень экономно для поддержания минимальных скоростей метаболизма.

Существенный вклад в общее содержание липидов в плазме крови пойкилотермных позвоночных вносят также воска, которых нет в плазме крови млекопитающих. Панкреатическая липаза млекопитающих не обладает субстратной специфичностью по отношению к воскам — эфирам длинноцепочечных (14-36 атомов углерода) насыщенных и ненасыщенных жирных кислот и длинноцепочечных спиртов (16-30 атомов углерода). Однако, воска широко представлены в пищевых цепочках миног и амфибий (планктон, беспозовночные животные).

В заключении следует подчеркнуть, что круглоротые и амфибии имеют принципиальные различия в использовании энергетических субстратов: миноги потребляют, главным образом, липиды, а лягушки - гликоген. Печень у миног является депо жировых запасов, а у лягушек - гликогена. Также важно отметить, что в процентном отношении липидные компоненты плазмы крови у позвоночных разного эволюционного статуса находятся примерно в одних границах. Наличие же воска в плазме скорее отражает эколого-физиологические особенности этих животных. Жидкостность триглицеридов и фосфолипидов у миног определяется, главным образом, моноеновыми кислотами и полиеновыми кислотами со-3 типа, тогда как у лягушек - также моноеновыми кислотами и полиеновыми кислотами оо-6 типа. Свободные жирные кислоты представлены в основном насыщенными и моноеновыми кислотами

В исследовании аминокислотного состава плазмы крови пойкилотермных животных прослеживаются не только сезонные закономерности, но межвидовые различия, которые тесным образом связаны с физиологическими особенностями животных. Как отмечалось выше, у миног в период естественного голодания суммарный пул аминокислот в плазме крови существенно увеличивается. Наоборот, у лягушек он уменьшается почти наполовину на протяжении 6-7 - месячного голодания. Описанное различие связано со своеобразием жизненных циклов этих животных. Миноги на протяжении зимнего периода готовятся к нересту и гибели весной - в начале лета. Лягушки, жизнь которых будет продолжена после пробуждения, обнаруживают плавное снижение пула, т.е. потребление аминокислот из крови преобладает над поступлением их из органов в кровь. Для сравнения приведем данные для млекопитающих. Диапозон концентраций аминокислот плазмы крови у здоровых людей составляет 2432-10259 мкмоль/л (Уайт, 1981), у крыс - 2581 ± 126 мкмоль/л (Holecek et al., 2001). Таким образом, у голодающих пойкилотермных позвоночных свободных аминокислот в плазме крови примерно в 2 раза, а у весенних лягушек даже в 3 раза, меньше в сравнении с млекопитающими. Однако, у миног весной аминокислотный пул количественно приближается к нижней границе, известной для млекопитающих (1943 ± 91 мкмоль/л).

Для ответа на вопрос, каким образом у длительно голодающих животных контролируется протеолиз в тканях, следует обратиться к сезонному анализу разветвленных аминокислот - лейцина, изолейцина и валина в плазме крови миног и лягушек.

Похожие диссертации на Энергообеспечение и биоэнергетические характеристики митохондрий печени миноги (Lampetra fluviatilis) и лягушки (Rana temporaria) в периоды метаболической депрессии и активности

Механизмы обратимой метаболической депрессии и гибели гепатоцитов миноги речной (Lampetra fluviatilis L.) в период преднерестовой миграцииКоновалова, Светлана Александровна

Транспорт одновалентных катионов через мембрану эритроцитов лягушек RANA TEMPORARIA и RANA RIDIBUNDAАгалакова, Наталья Ивановна

Характеристика пептидазной активности тонкой кишки цыплят Таврид Ирена Леоновна

Клинико-биохимическая характеристика изменений активности перекисного окисления липидов и лизосомальных ферментов в оценке эффективности комплексной терапии сахарного диабетаЧугунова, Лариса Геннадьевна

Сравнительная характеристика антирадикальной активности различных классов антиоксидантных средств в условиях окислительного стрессаБасов Александр Александрович

Клонирование, экспрессия и характеристика L-аспарагиназы Helicobacter pylori с противоопухолевой активностьюГладилина Юлия Алексеевна

Активность и экспрессия генов некоторых ферментов энергетического и углеводного обмена и размерно-весовые характеристики рыб семейств лососевые (Salmonidae) и сиговые (Coregonidae)Чурова, Мария Викторовна

Биоэнергетические характеристики митохондрий летательных мышц шмелей (Bombus terrestris L.)Сыромятников Михаил Юрьевич

Изучение механизмов регуляции разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени крысМарчик, Евгений Игоревич

Циклоспорин А-чувствительное, кальций-независимое разобщающее действие жирных кислот в митохондриях печени крысРыбакова, Снежана Рафаиловна