Введение к работе
Актуальность проблемы. Рибосомные белки являются структурными элементами рибосомы - многокомпонентной клеточной органеллы, осуществляющей биосинтез белков. Известно, что наряду с функциями, связанными со сборкой рибосомы и трансляцией мРНК, многие из этих белков обладают так называемыми «внерибосомными» функциями (Wool et al., 1996), иначе говоря, они участвуют в различных клеточных процессах, находясь в свободном состоянии, т.е. вне рибосомы. Точная регуляция биосинтеза рибосомных белков является необходимым условием для полноценной жизнедеятельности как отдельной клетки, так и целого организма, а нарушение этой регуляции может приводить к различным критическим изменениям. Согласно современным представлениям регуляция экспрессии генов рибосомных белков эукариот происходит на стадиях транскрипции, сплайсинга и трансляции, а также за счет изменения скорости деградации вновь синтезированных белков. Регуляция экспрессии генов рибосомных белков эукариот на стадиях транскрипции и трансляции происходит координировано, по принципу «все сразу». Такая регуляция достигается благодаря наличию общих регуляторных элементов как в генах рибосомных белков, так и в мРНК, кодирующих эти белки. Регуляция экспрессии генов рибосомных белков на уровне сплайсинга изучена хуже, но в большинстве известных случаев показано, что регуляция на этой стадии осуществляется по принципу «обратной связи», т.е. через взаимодействие рибосомного белка с кодирующей его пре-мРНК (Иванов и др., 2006). Такой механизм регуляции обеспечивает необходимый уровень каждого рибосомного белка в клетке, независимо от количества остальных рибосомных белков, что может являться исключительно важным для выполнения рибосомными белками функций, не связанных с процессом трансляции. Таким образом, изучение роли рибосомных белков в регуляции сплайсинга кодирующих их пре-мРНК и особенностей РНК-белковых взаимодействий, лежащих в основе этого процесса, имеет важное значение для понимания молекулярных механизмов регуляции биосинтеза рибосомных белков.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение регуляции экспрессии генов рибосомных белков S13 и S16 человека на стадии сплайсинга. Внерибосомные функции этих белков пока не известны, однако имеются данные о возможном участии rpS13 в подавлении апоптоза, индуцированного лекарствами против рака желудка. Основными задачами являлись:
создание экспрессирующих плазмидных конструкций, несущих кДНК рибосомных белков S13 и S16 человека, и получение препаратов рекомбинантных рибосомных белков S13 и S16, пригодных для использования в структурно-функциональных тестах;
выявление с помощью компьютерного анализа наиболее консервативных интронов в составе пре-мРНК, кодирующих рибосомные белки S13 и S16;
изучение связывания рибосомных белков S13 и S16 с фрагментами их пре-мРНК, содержащими наиболее консервативные интроны, и исследование влияния данных белков на сплайсинг этих фрагментов;
определение нуклеотидов фрагмента пре-мРНК рибосомного белка S13, меняющих свою доступность действию ферментов в присутствии кодируемого белка, и выявление их роли в регуляции сплайсинга этого фрагмента.
Научная новизна и практическая ценность. В настоящей работе представлены результаты исследования, направленного на изучение регуляции экспрессии генов рибосомных белков S13 и S16 человека на стадии сплайсинга. В рамках настоящей работы впервые получены рекомбинантные рибосомные белки S13 и S16 человека, описаны процедуры их выделения, очистки и ренатурации и охарактеризована их вторичная структура. Показано, что рибосомные белки S13 и S16 человека способны специфично связываться с фрагментами своих пре-мРНК, содержащими первый интрон, фланкированный экзонами, и ингибировать сплайсинг этих фрагментов in vitro. Выявлены нуклеотидные остатки фрагмента пре-мРНК rpS13, меняющие свою доступность действию РНКаз в присутствии кодируемого белка. Установлено, что большинство этих остатков расположено вблизи 5'- и З'-сайтов сплайсинга. Показано, что мутации в районах, содержащих эти остатки, уменьшают ингибирующий эффект rpS13 на сплайсинг фрагмента его пре-мРНК, содержащего первый интрон. Предложен механизм регуляции экспрессии генов рибосомных белков S13nS16Ha уровне сплайсинга, основанный на принципе «обратной связи». Полученные в настоящей работе данные имеют принципиальное значение для понимания молекулярных механизмов не только регуляции сплайсинга пре-мРНК рибосомных белков, но и других процессов, в основе которых лежат РНК-белковые взаимодействия.
Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: «Chemical & Biological problems of proteomics», Новосибирск, 2004; «International Conference on Chemical Biology», Новосибирск, 2005; «Biosphere Origin and Evolution», Новосибирск, 2005; «30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference», Венгрия, 2005; «FEBS Forum for Young Scientists», Венгрия, 2005; «8th International Engelhardt Conference on RNA-protein interactions», Сергиев Посад, 2006; на конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, 2006; XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, Москва, 2007; III Российском симпозиуме «Белки и пептиды», Пущино, 2007; IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008.
Личный вклад автора. В диссертационную работу включены материалы исследований, выполненных автором лично.
Структура работы. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы и содержит 2 таблицы и 47 рисунков.
