Введение к работе
Актуальность проблемы. Фотосистема 2 (ФС-2) - единственный в природе ферментативный комплекс, способный окислять воду, что позволяет растениям и цианобактериям использовать ее в качестве донора электронов при фотосинтезе. Окисление происходит на люменальной стороне ФС-2 в водоокисляющем комплексе (ВОК), в каталитический центр которого входит четыре атома марганца и атом кальция (МщСаОз-кластер). Лигандами атомов марганца и кальция являются белки D1 и СР43 [Umena et al., 2011], и в таком составе ФС-2 (вместе с белками D2, СР47, цитохромом Ь559 и Psbl) может окислять воду в экспериментальных условиях. Однако подобный комплекс не стабилен и быстро инактивируется. Для его устойчивой работы необходимо присутствие внешних белков ВОК, связанных с донорной стороной ФС-2 [Bricker et al., 2012]. У высших растений и зеленых водорослей такими белками являются PsbO, PsbP и PsbQ, функция которых заключается в регуляции и стабилизации работы Mn-кластера. Центральную роль при этом играет белок PsbO, который непосредственно влияет на состояние Мп-кластера.
Согласно эволюционным представлениям, белок PsbO - единственный белок ВОК, который есть у всех оксигенных организмов. Его включение в составе ВОК, по-видимому, произошло одновременно с возникновением у ФС-2 способности окислять воду, и у первых примитивных цианобактерий PsbO был единственным внешним белком, связанным с Мп-кластером [De Las Rivas et al., 2004]. При исследовании структуры и функции ВОК было установлено, что PsbO не образует связей с атомами марганца, однако его присутствие необходимо для нормального функционирования Mn-кластера в цикле окисления воды. Наиболее распространена гипотеза о том, что PsbO функционирует в качестве барьера между Мп-кластером и люменом хлоропластов, защищая каталитический центр от активных химических соединений (восстановители, металлы, ионы ОН" и пр.) [Williamson, 2008; Popelkova and Yocum, 2011]. Кроме того, из-за своего положения он может регулировать доступ ионов хлора, кальция, бикарбоната к ВОК и обеспечивать их удержание рядом с Мп-кластером, а также участвовать в отведении протонов из зоны реакции, формируя канал для их удаления. Тем не менее, несмотря на почти 30 лет исследований (с 1981 г.) функциональная роль белка PsbO в процессе фотосинтетического окисления воды остается неопределенной.
Один из подходов в решении данной проблемы - применение сайт-направленного мутагенеза. Важным фактором при этом является выбор модельной системы для исследования. В случае с PsbO наибольшее
распространение получил метод изучения мутаций в условиях in vitro [Motoki et al., 2002; Williamson, 2008]. Однако, при таком подходе при анализе эффекта отдельных мутаций приходится разрушать нативный комплекс ФС-2, а также невозможно проследить влияние мутации на биогенез ВОК. Получить ответ на эти вопросы можно только при работе с живыми организмами, исследуя эффект мутаций in vivo. До настоящего момента единственным объектом таких исследований были цианобактерии Synechocystis sp. [Вшпар et al., 1994; Eaton-Rye, 2005]. Однако, учитывая значительную разницу в белковом составе ВОК между растениями и цианобактериями, а также и определенное различие в функции PsbO у этих организмов, переносить полученные результаты на растения не совсем корректно. Так, для активности ВОК у прокариотических организмов важное значение имеет белок PsbV, вследствие чего у цианобактерии (в отличие от высших растений и водорослей) инактивация PsbO не приводит к прекращению выделения кислорода. При определенных условиях в клетках штамма цианобактерии скорость выделения 02 может составлять > 50% от клеток дикого типа и полностью подавить выделение кислорода можно только в случае двойной мутации: ApsbO:ApsbV. Поэтому особый интерес представляет работа с эукариотическими организмами.
Работа с растениями осложняется тем, что ApsbO мутант у них нежизнеспособен, и кроме того мутации в белке делают ФС-2 чувствительной к фотоинактивации [Yi et al., 2005]. Решить описанные выше проблемы можно при использовании в качестве объекта исследования одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. Как и высшие растения, хламидомонада является эукариотом с аналогичным белковым составом ВОК, и, в дополнении к этому, водоросль обладает уникальным метаболизмом. В отличие от высших растений, которые для роста нуждаются в свете (облигатные фототрофы), зеленая водоросль С. reinhardtii способна расти в темноте (гетеротрофно) на ацетате и в тоже время формировать зеленый активный хлоропласт [Harris, 2001]. Эта особенность позволяет изучать функциональное состояние и биогенез комплекса ФС-2 in vivo, исключая повреждение ВОК вследствие фотоинактивации.
Использование не содержащего PsbO мутанта С. reinhardtii также могло бы помочь решить один из вопросов, связанный с участием белка PsbO в формировании стабильного комплекса ФС-2, и теми различиями, которые наблюдаются в биогенезе ФС-2 для прокариотических (цианобактерии) и эукариотических организмов (растения и зеленые водоросли). Так, у
цианобактерий ФС-2 собирается и в отсутствие белка PsbO, тогда как у высших растений и зеленых водорослей инактивация гена, кодирующего белок PsbO, приводит к потере комплекса ФС-2 и отсутствию роста клеток в фотоавтотрофных условиях [Mayfield et al, 1987; Philbrick et al, 1991].
Цели и задачи. Целью работы было исследование роли белка PsbO и некоторых его аминокислотных остатков (Lys223 и Lys226, расположенных на обращенной в люмен стороне белка, которые могли бы участвовать в формировании канала, соединяющего Мп-кластер с внутритилакоидным пространством) в стабилизации и функциональной активности ВОК фотосистемы 2 в клетках С. reinhardtii.
В процессе исследования решались следующие задачи:
-
Характеристика ApsbO мутанта С. reinhardtii, в том числе структурно-функционального состояния ФС-2, с выяснением возможности образования фотохимически активного комплекса ФС-2 в клетках темновой (гетеротрофной) культуры С. reinhardtii в отсутствие белка PsbO.
-
Разработка генетической системы для сайт-направленного мутагенеза белка PsbO фотосистемы 2 in vivo в эукариотических организмах с использованием зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii.
-
Внесение направленных аминокислотных замен К223Е и К226Е в структуру белка PsbO фотосистемы 2 и исследование влияния этих мутаций на стабильность и функциональную активность ВОК в клетках С. reinhardtii.
Научная новизна работы. Разработана генетическая система для сайт-направленного мутагенеза белка PsbO фотосистемы 2 in vivo с использованием эукариотического оксигенного организма - зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii, что позволяет выращивать клетки мутантов по белку PsbO в темноте и изучать биогенез ФС-2, избегая повреждений в результате фотоинактивации. С использованием этой системы получены мутантные штаммы С. reinhardtii с одиночными заменами в белке PsbO (К223Е и К226Е -LGAKPPK) консервативных аминокислотных остатков, которые могут участвовать в формировании канала, соединяющего Мп-кластер с внутритилакоидным пространством. Впервые показано, что эукариотические фотосинтезирующие организмы способны формировать стабильный комплекс ФС-2 в отсутствие белка PsbO, что подтверждается результатами определения содержания белка D1 и пигментного состава клетки. Несмотря на отсутствие фотосинтетического выделения кислорода, в клетках темновой культуры
ApsbO штамма С. reinhardtii выявлена фотохимическая активность, анализ которой показывает, что отсутствие выделения кислорода может быть связано с нарушениями в организации марганцевого кластера ВОК. Впервые показано, что в результате одиночной аминокислотной замены К226Е происходит нарушение стабильности белка, что приводит к развитию ApsbO фенотипа со значительно сниженным содержанием белка в клетке. Показано, что мутация в позиции К223Е вызывает снижение скорости выделения кислорода и отношения Fv/Fm, что, по-видимому, связано с изменением структуры белка, приводящем к увеличению доступности Mn-кластера для эндогенных восстановителей.
Практическая значимость работы. Разработанная генетическая система является удобной основой для изучения роли белка PsbO в эукариотических организмах и, кроме того, расширяет представления о механизме функционирования водоокисляющего комплекса ФС-2: позволяют лучше понять механизм биогенеза ФС-2, а также роль внешних белков в обеспечении стабильности и функциональной активности каталитического центра ВОК.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции "Light Energy Conversion in Photosynthesis" (Пушино, 2008); на итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 г. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008); на VII съезде общества физиологов растений России, международной конференции «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); на VI съезде Российского фотобиологического общества (пос. Шепси, Краснодарский край, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них: 2 в реферируемых российских научных журналах (из списка ВАК), и 4 в сборниках тезисов конференций.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.
Диссертация изложена на страницах текста и включает 27 рисунков и 8
таблиц. Список литературы содержит 236 источников.
Похожие диссертации на Изучение влияния мутаций в белке PsbO на активность водоокисляющего комплекса в Chlamydomonas reinhardtii
