Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. О строении фотосистемы 2 10
2.2. О механизме фотосинтетического окисления воды 13
2.3. Об участии бикарбоната в функционировании донорной стороны фотосистемы 2 15
2.4. Об активности комплексов марганца с бикарбонатом в реакции разложении перекиси водорода 22
2.5. О каталазной активности фотосистемы 2 26
3. Методы и материалы 31
4. Результаты и обсуждение 37
4.1. Влияние бикарбоната, ацетата и формиата на реактивацию переноса электронов от Мп11 к реакционным центрам ФС-2 37
4.2. Определение состава комплексов Мп111 с бикарбонатом, ацетатом и формиатом при окислении Мп11 на платиновом электроде 40
4.3. Определение состава Мпп-бикарбонатных комплексов при восстановлении Мп11 на стационарном ртутном катоде 54
4.4. Каталазная активность МпП-бикарбонатных комплексов 61
4.5. Каталазная активность препаратов фотосистемы 2 76
4.6. Заключение 85
5. Выводы 88
Список использованной литературы 90
- О строении фотосистемы 2
- О механизме фотосинтетического окисления воды
- Влияние бикарбоната, ацетата и формиата на реактивацию переноса электронов от Мп11 к реакционным центрам ФС-2
- Определение состава комплексов Мп111 с бикарбонатом, ацетатом и формиатом при окислении Мп11 на платиновом электроде
Введение к работе
1. Введение 5
2. Обзор литературы
2.1. О строении фотосистемы 2 10
2.2. О механизме фотосинтетического окисления воды 13
2.3. Об участии бикарбоната в функционировании донорной стороны фотосистемы 2 15
2.4. Об активности комплексов марганца с бикарбонатом в реакции разложении перекиси водорода 22
2.5. О каталазной активности фотосистемы
2 3. Методы и материалы 31
4. Результаты и обсуждение
4.1. Влияние бикарбоната, ацетата и формиата на реактивацию переноса электронов от Мп11 к реакционным центрам ФС-2 37
4.2. Определение состава комплексов Мп111 с бикарбонатом, ацетатом и формиатом при окислении Мп11 на платиновом электроде 40
4.3. Определение состава Мпп-бикарбонатных комплексов при восстановлении Мп11 на стационарном ртутном катоде 54
4.4. Каталазная активность МпП-бикарбонатных комплексов 61
4.5. Каталазная активность препаратов фотосистемы 2 76
4.6. Заключение 85
5. Выводы 88
Список использованной литературы 90
О строении фотосистемы 2
Фотосинтез - одно из важнейших биологических явлений, при котором происходит запасание энергии солнечного света в форме углеродных соединений и выделение молекулярного кислорода. Эти вещества используются большинством живых организмов в качестве источника энергии, что определяет ключевую роль фотосинтеза в функционировании биосферы.
Фотосинтез растений происходит в клетках, содержащих зелёные пластиды - хлоропласты. Хлоропласт ограничен снаружи двумя слоями мембраны, составляющими оболочку хлоропласта. Внутреннее пространство хлоропласта занимает бесцветный матрикс, называемый стромой, в толще которой находится система замкнутых уплощённых мембран, называемых тилакоидами. Тилакоиды сгруппированы в стопки - граны, которые связаны между собой свободно расположенными мембранами - ламеллами стромы. Мембраны тилакоидов и ламелл стромы состоят из двойного липидного слоя и погружённых в него хлорофилл-белковых комплексов: фотосистемы 2 (ФС-2), цитохромов b f, фотосистемы 1 (ФС-1), АТФ-синтазы. Большинство комплексов ФС-2 расположены в областях межмембранных контактов тилакоидов. Комплексы ФС-1 и АТФ-синтазы расположены преимущественно в частях мембраны, обращенных к строме, т.е в краевых областях мембран тилакоидов, а также в мембранах, окружающих граны. В мембранах происходит преобразование световой энергии и транспорт электронов при фотосинтезе. Строма содержит ферменты цикла Кальвина, катализирующие темновые реакции восстановления СОг до углеводов. Цианобактерии, или сине-зелёные водоросли, не содержат хлоропластов. Фотосинтез у них происходит в расположенных параллельными слоями ламеллярных мембранах, пронизывающих всю цитоплазму [Холл, Рао, 1983]. Окисление воды и выделение Ог при фотосинтезе осуществляется в ФС-2 - пигмент-белковом комплексе, погружённом в тилакоидную мембрану. ФС-2 состоит из трёх основных функциональных частей: 1) светособирающего комплекса, улавливающего кванты света и передающего энергию возбуждения хлорофилла на реакционный центр ФС-2, 2) фотохимического реакционного центра, в котором происходит преобразование энергии возбуждённого хлорофилла в энергию разделённых зарядов, 3) водоокисляющего комплекса (ВОК), окисляемого реакционным центром и, в свою очередь, окисляющего воду с выделением 02.
Рентгеноструктурный анализ препаратов ФС-2 из цианобактерии Thermosynechococcus elongatus [Ferreira et al., 2004] показал, что ФС-2 (без светособирающего комплекса) содержит 19 белковых субъединиц, 36 молекул хлорофилла, 7 молекул Р-каротина, марганцевый кластер ВОК состава Мп4СаОх, два гема, два пластохинона, два феофитина, один атом негемового железа и два иона бикарбоната, один из которых связан с негемовым железом, а другой предположительно является лигандом марганцевого кластера.
Реакционный центр (РЦ) ФС-2 состоит из двух интегральных белков Д1 (или PsbA, по названию кодирующего гена) и Д2 (PsbD), каждый из которых содержит 5 трансмембранных а-спиралей. На этих белках расположены кофакторы, участвующие в реакциях переноса электронов. Первичный донор электрона П680, состоящий из двух близко расположенных молекул хлорофилла а, после возбуждения светом теряет электрон и превращается в катион-радикал П680 . Электрон переносится на пластохинон QB через феофитин и пластохинон QA. После двухэлектронного восстановления и протонирования QBH2 заменяется другой молекулой пластохинона и уходит из ФС-2 в мембрану. Катион-радикал П680 + восстанавливается остатком тирозина-161 белка Д1 (Yz), который превращается в радикал Yz и служит окислителем для Mn-кластера ВОК. Все эти кофакторы, за исключением QA, связанного с белком Д2, расположены на белке Д1. Между QA и QB расположен атом негемового железа. Он лигандирован четырьмя остатками гистидина, два из которых принадлежат белку Д1, а другие два - белку Д2. Пятым лигандом является бикарбонат, влияющий на перенос электрона между QA и QB и, вероятно, облегчающий протонирование восстановленного QB.
Вблизи белков РЦ, по обе стороны от Д1 и Д2 расположены два белка антенны, именуемые СР43 (PsbB) и СР47 (PsbC), несущие 14 и 16 молекул хлорофилла, соответственно. СР43 и СР47 - интегральные белки, имеющие по 6 трансмембранных а-спиралей. Вблизи РЦ в мембране также находится белок цитохром Ь559, состоящий из двух субъединиц, и несколько низкомолекулярных белков с неизвестными функциями. Между цитохромом Ь559 с одной стороны, и РЦ и СР43 с другой стороны, находятся 7 молекул каротиноидов. Каротиноиды и цитохром Ь559, как предполагается, участвуют в циклическом переносе электронов в ФС-2 при нарушении функционирования ВОК. В тилакоидной мембране образуются димеры из двух близко расположенных одинаковых пигмент-белковых комплексов ФС-2.
Установлено, что местом окисления воды и выделения 02 в ФС-2 служит марганцевый кластер ВОК. Он состоит из четырёх атомов Мп, одного атома Са, которые связаны между собой кислородными мостиками, а также включает ионы СГ и, возможно, НСОз". К настоящему времени не сделано окончательных выводов о строении марганцевого кластера. С использованием рентгеноструктурного анализа ФС-2 из цианобактерии Thermosynechococcus elongatus с разрешением 3,0 A [Loll al., 2005] и 3,5 А [Ferreira et al., 2004] было показано, что в марганцевом кластере три из четырёх атомов Мп и атом Са вероятно расположены в форме треугольной пирамиды. В работе Ferreira et al. (2004) было предположено, что вместе с четырьмя связующими атомами кислорода и атомом Са марганцевый кластер образует форму искажённого куба. Четвёртый атом Мп находится вне куба и связан с одним из атомов О куба. Расстояния между атомами внутри куба были определены равными 2,7 А для Mn-Мп и 3,4 А для Mn-Са. Расстояние между атомами Мп вне куба с одной стороны и внутри куба с другой составляет 3,3 А. Марганцевый кластер лигандирован карбоксильными группами остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот белков Д1 и СР43, имидазольной группой гистидина Д1, и, возможно, концевой карбоксильной группой аланина Д1. В работе Ferreira et al. (2004) было предположено, что атомы Са и внекубического Мп лигандированы ионом бикарбоната, и что эти же атомы участвуют в связывании молекул воды в каталитическом цикле окисления воды. На люменальной стороне ФС-2 находятся три водорастворимых белка, называемых внешними белками ВОК: PsbO (марганец-стабилизирующий белок), PsbQ и PsbP у растений и PsbO, PsbU и PsbV (цитохром с55о) У цианобактерий.
О механизме фотосинтетического окисления воды
Фотосинтетическое окисление воды является одной из наименее изученных реакций фотосинтеза. Образование одной молекулы 02 требует отрыва четырёх электронов от двух молекул воды: 2Н20 — 02 + 4ё +4Н+. Окислителем воды служит водоокисляющий комплекс ФС-2, который подвергается четырём последовательным одноэлектронным реакциям окисления со стороны окисленного остатка тирозина Yz. Степени окисления ВОК называются S-состояниями и обозначаются символами S0, Si, S2, S3 и S4, начиная от низшей и заканчивая высшей степенями окисления. Переход S4— S0 происходит самопроизвольно и приводит к образованию молекулы 02. Остальные переходы S-состояний вызываются поглощением квантов света фотохимическим реакционным центром. Для завершения одного цикла S-состояний, называемого циклом Кока, требуется поглощение четырёх квантов света. В темноте устойчиво только состояние Si; состояния S2 и S3 восстанавливаются, a S0 окисляется в темноте до Si. Поэтому первый максимум выделения 02 при освещении микросекундными насыщающими вспышками света препаратов ФС-2, выдержанных в темноте, наблюдается на третью вспышку. При переходах S-состояний (S0— Si— S2—»S3— So) наблюдается выделение в раствор ионов ЕҐ в количестве 1-0-1-2. Источником ионов как предполагают, служит сеть водородных связей внутри ВОК, куда протоны попадают при окислении воды [Nelson, Yocum, 2006].
Установлено, что основным участником окислительно-восстановительных реакций внутри ВОК, приводящих к окислению воды и выделению 02, является марганцевый кластер, потому что марганец может изменять степень окисления. На основании данных спектроскопии и восстановительного титрования предполагается, что в состоянии S\ четыре атома Мп имеют степени окисления [Мпш-Мпш]-[Мп1У-Мп1У] [Renger, 2001]. Предполагается, что из четырёх атомов Мп два MnIV не меняют степени окисления. В соответствии с этим предложена следующая электронная конфигурация S-состояний: S0 L[Mnn-Mnin]-[MnIV-MnIV] S, L[Mnni-Mnm]-[MnIV-MnIV] 52 L[Mnni-Mnlv]-[MnIV-MnIV] 53 L0X[Mnni-Mn,v]-[MnIV-MnIV] или L[MnIV-Mnlv]-[Mnlv-MnIV], где L - неметаллический компонент ВОК, способный к окислительно-восстановительным реакциям (предположительно, остаток гистидина). Состояние S4 существует короткое время (ti/2 = 1,3 мс), поэтому о его электронной конфигурации нет данных. Предполагается, что в S4 образуется 0=Mnv [Nelson, Yocum, 2006]. Согласно другой гипотезе, S4 представляет собой YZ S3, в котором восстановление окисленного остатка тирозина Yz" происходит одновременно с образованием молекулы 02 [Renger, 2001]. Важная роль в цикле Кока принадлежит также ионам Са + и СГ. Удаление любого из них приводит к остановке цикла Кока на стадии S2, а ион СГ необходим также для перехода S4— S0 [Nelson, Yocum, 2006]. В настоящее время считается установленным, что субстратом окисления в ФС-2 служит вода, а не ион НС03" [Clausen et al., 2005; Hillier et al., 2006]. С помощью масс-спектрометрии с использованием 1 О было показано, что обе субстратные молекулы воды могут реагировать с ВОК в состояниях S0 и S3 [Hillier, Wydrzynski, 2000]. При этом скорости обмена двух молекул воды в состоянии S3 различались между собой на порядок [Hillier, Messinger, Wydrzynski, 1998]. Это может указывать на то, что окисление воды начинается не ранее состояния S3, и что при образовании О-О связи промежуточный продукт связан асимметрично внутри ВОК. Предполагается, что обратимое образование О-О связи возможно уже в состоянии S3 [Renger, 2001].
Известно, что ионы бикарбоната необходимы для функционирования как донорной, так и акцепторной сторон ФС-2. Предполагается, что на акцепторной стороне есть два места связывания бикарбоната. Один ион бикарбоната является лигандом негемового железа в ФС-2 и, вероятно, имеет функцию поддержания третичной структуры в месте переноса электрона между QA И QB. Второй ион бикарбоната предположительно находится вблизи места связывания QB и обеспечивает протонирование QB [Van Rensen and Klimov, 2005].
В последнее время в работах лаборатории В.В. Климова были получены доказательства в пользу того, что бикарбонат необходим для функционирования донорной стороны ФС-2. Для выявления и усиления бикарбонатного эффекта были использованы следующие экспериментальные подходы: а) замещение бикарбоната в его возможном участке связывания ионом формиата; б) 100-1000-кратное разбавление концентрированной суспензии препаратов ФС-2 средой, из которой был удалён С02 кипячением или продуванием воздухом, пропущенным через аскарит и раствор NaOH; в) смещение водородного показателя (рН) среды в сторону значений, находящихся ниже pKai бикарбоната.
Влияние бикарбоната, ацетата и формиата на реактивацию переноса электронов от Мп11 к реакционным центрам ФС-2
Ранее было показано, что полное удаление марганца из мембранных фрагментов ФС-2 приводит к уменьшению фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла (АФ) в 15-20 раз (из-за прекращения переноса электронов от ВОК к реакционному центру ФС-2). АФ может восстанавливаться добавлением Мп11 в каталитических концентрациях (0,1-0,2 мкМ) [Климов с соавт., 1982]. Способность добавляемого Мп11 восстанавливать фотоиндуцированные АФ в препаратах ФС-2, лишённых функционального марганца, значительно увеличивается при добавках бикарбоната [Klimov et al., 1995; Allakhverdiev et al., 1997]. На рис. 2 показано (в согласии с предыдущими работами), что удаление функционального марганца водоокисляющего комплекса приводит к значительному уменьшению АФ (кривая 1), что связано с подавлением переноса электронов на реакционный центр и далее на QA, по сравнению с исходными ВВУ (пунктир). Восстановление АФ в присутствии 0,2 мкМ Мп11 (4 Мп/реакционный центр ФС-2), вызываемое переносом электронов от Мп11 на реакционный центр ФС-2, наблюдается только при добавлении бикарбоната (кривая 4), что отмечалось и ранее [Klimov et al., 1995b]. 0,2 мкМ Мп11 (кривая 2) или 5 мМ бикарбонат (кривая 3) каждый в отдельности не вызывали значительного восстановления фотоиндуцированных АФ. Концентрация бикарбоната, необходимая для насыщения эффекта в присутствии марганца, составляла 1-2 мМ, а для 50% эффекта - 0,1-0,2 мМ. В отличие от бикарбоната, сходные по структуре анионы 5 мМ формиат (кривая 5) или 5 мМ ацетат (кривая 7) не способствовали переносу электронов от Мп к ФС-2. При совместном добавлении бикарбоната с формиатом (кривая 6) или с ацетатом (кривая 8) наблюдалось восстановление АФ, что указывает на избирательность изучаемой реакции к бикарбонату.
С целью выяснения природы стимулирующего действия бикарбоната на перенос электронов от Мп" к реакционному центру ФС-2 и отсутствия такого эффекта при добавлении формиата и ацетата были проведены электрохимические исследования состава и термодинамических свойств комплексов Мп11 и Мпш с этими потенциальными лигандами. В литературе отсутствуют сведения о комплексах Мп111 с этими ионами, а данные о комплексах Мп11 с бикарбонатом противоречивы [Сычёв с соавт., 1981]. Измерение потенциала окисления Мп11 до Мпш вольтамперометрическим методом при изменении концентрации лиганда в среде позволяет определить стандартный окислительно-восстановительный потенциал (Е ), состав и константу устойчивости ((3) образующегося комплекса между ионом Мп и лигандом. В случае обратимой электродной реакции, а также если количество свободного лиганда достаточно велико для того, чтобы его концентрация у поверхности электрода равнялась концентрации в растворе, можно определить состав и константу устойчивости комплекса, образующегося по реакции Мп" - ё + рХ МпшХр, определяя зависимость потенциала окисления от логарифма концентрации лиганда [Гейровский, Кута, 1965]: в котором Е /,мет и Е /2К0М — потенциалы полуволн окисления водного комплекса Мп в отсутствии и в присутствии лиганда X соответственно; /? — полная константа устойчивости комплекса Мп111; Сх — концентрация лиганда X в растворе; р и q — число лигандов в комплексе Мп11 и Мп111, соответственно; п — число электронов, участвующих в реакции. В случае предварительного образования комплекса Мп11, уравнение реакции окисления следующее: Мп% - ё + (р - q)X МпшХр. В этом случае изменение потенциала окисления Мп зависит от отношения констант устойчивости комплексов Мпш (fiox) и Мп11 (J3RED) а также от логарифма концентрации лиганда (уравнение II) [Гейровский, Кута, 1965]: Е -Ev = \n- --(p-q) -\nCx (II). у2жт у2кои пр p D пр В обоих случаях число лигандов в комплексе может быть определено из наклона зависимости потенциала окисления от \gCx. Экстраполяцией зависимости к \gCx - О определяется стандартный потенциал окисления (Е) комплекса и его константа устойчивости: 111 мет акпм ,-, ШР 5 пг или El,n - El, = \gfi (III), при T= 298 К.
Вольтамперные кривые, получаемые на платиновом электроде, имеют вид волны с максимумом, характеризуемым значением потенциала пика, Ер. Для обратимой одно- или двухэлектронной реакции разность между Ер и Е./2 равна 28 и 14 мВ, соответственно [Бонд, 1983]. В нашей работе были использованы экспериментальные значения Ер вместо Еу2 для построения графиков зависимостей и расчётов по уравнениям.
Мпп(Н20)б - ё - Мпш(Н20)б (1). Эта реакция характеризуется значением Е=1,51В [Liang, Bard, 1973]. Показатель константы гидролиза (рКа) Мп111 близка к 0, поэтому при рН О протекает гидролиз Мп111 с образованием МпП(ОН)2+ [Liang, Bard, 1973]. Дальнейший гидролиз приводит к образованию в растворе Мп2Оз(Р) -предшественника нерастворимого Мп20з(кр), согласно следующим уравнениям: 2Mn" - 2ё + 2H20 ++ 2МпПІ(ОН)2+ + 2БҐ (2) 2Мпш(ОН)2+ + 2Н20 - MnIV(OH)4 + Мп" + 2НҐ (3) Mn" + MnIV(OH)4 - MnnMnIV03 + Н20 + 2Н+ (4) 2Мпи - 2ё + ЗН20 - MnuMn v03 + 6КҐ (5) Благодаря реакциям гидролиза волна окисления Мп при рН О соответствует уравнению 5 и имеет максимум при 1,18 В. Вследствие гидролиза реакция окисления Мп11 необратима. Однако, в присутствии лигандов, которые связываются с Мп111 сильнее, чем вода, реакции гидролиза Мп111 подавляются. Следовательно, в присутствии лигандов окисление Мп осуществляется подобно реакции 1. При этом потенциал окисления сдвигается от 1,51 В в сторону уменьшения. На рис. 3 показаны циклические вольтамперные кривые окисления MnS04 (5x10" М) (кривая 1) на фоне 0,1 М L1CIO4 в воде (кривая 0). Волна окисления водного комплекса Мп с максимумом при 1,18В видна на анодной ветви кривой (в соответствии с предыдущими измерениями потенциала окисления Мп11 в водном растворе [Козлов с соавт., 1997]). Малая катодная волна при 1,12 В и два дополнительных максимума при 0,96 и 0,28 В, наблюдаемые при обратном сканировании, отражают протекание реакций 1-5 при окислении Мп11. При добавлении 134 мМ ацетата натрия анодная волна окисления Мп11 сдвигается к более низким значениям потенциала (0,82 В вместо 1,18 В), а анодные пики при обратном сканировании наблюдаются при потенциалах 0,76 В и 0,59 В. Разность между анодным (Epd) и первым катодным (Ерк) пиками для Мп равна 60 мВ как в присутствии, так и в отсутствии ацетата, указывая на обратимый перенос одного электрона в расчёте на один ион Мп на стадии окисления. Максимальный ток катодного пика значительно ниже анодного, указывая на превращение продукта окисления в иной продукт. Образование этого продукта (пик при 0,59 В) происходит в реакции диспропорционирования по уравнению 3. Похожая картина наблюдается в присутствии формиата, оксалата и бикарбоната (не показано).
Определение состава комплексов Мп111 с бикарбонатом, ацетатом и формиатом при окислении Мп11 на платиновом электроде
Высота волны увеличивалась пропорционально концентрации Mn , а её потенциал увеличивался. Изучение смещения Ер для кривых 1-6 выявило линейную зависимость Ер от \gCMn с наклоном 120 мВ, после которого следовал более пологий участок с наклоном около 60 мВ (кривые 7-9). При концентрации Мп11 около 0,5 мМ появляется новая волна окисления Мп с потенциалом около 0,9 В (кривая 7), которая сдвигается в положительную сторону с наклоном 180 мВ при увеличении логарифма концентрации Мп (кривые 7-12). В этой области Мп окисляется по реакции: Мп" - ё + ЗНСОз" Мпш(НСОз)3. Добавление ацетата, формиата или оксалата к воде приводит к постепенному подщелачиванию раствора до рН 8,5. Растворение бикарбоната в использованной области концентраций давало раствор с постоянным рН, равным 8,3. Контрольные измерения для выяснения влияния рН на окисление MnSO. проводились в небуферной среде добавлением НС1 или КОН. Было обнаружено, что потенциал окисления Мп11 не зависит от рН в области рН от 5,0 до 8,5 (изменение потенциала составляло менее 10 мВ). При рН выше 9 начинается сдвиг потенциала из-за образования комплекса с гидроксо-анионом, что согласуется с известной для Мп11 рКа= 10,5. Следовательно, при рН 8,5 ионы Мп11 существуют преимущественно в виде водного 0-4 комплекса Мп(Н20)б" Характеристика электрохимического окисления Мп11 позволяет предложить возможные объяснения избирательности по отношению к бикарбонату стимулирования переноса электронов от ионов Мп11 к безмарганцевым препаратам ФС-2. Потенциал окисления Мп11 до Мп111 уменьшается с 1,18 В в отсутствие лигандов до менее положительных значений при образовании комплексов Мп с оксалатом, ацетатом, формиатом и бикарбонатом: Мп11 - ё + 2СН3СОО" - Мпш(СН3СОО)2+; Е = 0,69 В, р = 7,9x1013 М"2 Мп11 - ё + 2НСОО" - Мпш(НСОО)2+; Е = 0,775 В, р = 2,86x1012 М"2. Мп11 - ё + С2042" - МпшС204+; Е = 0,92 В, р = 1,0х1010 М-1. Mn11 - ё + ЗНСО3" - МпІП(НС03)з; Е = 0,67 В, р = 1,73x10м М"3. Снижение потенциала окисления позволяет ионам Мп" быть окисленными остатком тирозина Yz", имеющим окислительно-восстановительный потенциал, равный 0,95-1,0 В [Renger, 2001]. Но, как было показано в главе 3, ацетат и формиат, в отличие от бикарбоната, не способствуют переносу электронов от Мп11 к безмарганцевым препаратам ФС-2, что позволяет предполагать важность (наряду с понижением потенциала окисления Мп ) иных особенностей бикарбоната для взаимодействия с ФС-2.
Только в присутствии бикарбоната осуществляются две дополнительные реакции электрохимического окисления легкоокисляемых Мпп-бикарбонатных комплексов, имеющих предполагаемый вид: Мпп(НС03)2 (комплекс I) - ё + НС03" - МпП1(НС03)з; Е = 0,61 В. МппНС03+ (комплекс II) - ё + 2НСОэ" -+ Мпш(НС03)з; Е = 0,52 В. Образование комплексов Мп11 с бикарбонатом приводит к самому сильному снижению потенциала окисления Мп , что может быть важным для их окисления безмарганцевыми препаратами ФС-2. Несмотря на то, что используемых концентраций ацетата и формиата было достаточно для образования комплексов с Mn" (lg/?=l,2 для комплекса МппСН3СОО+ [Лурье, 1971]), нами не было обнаружено дополнительных волн окисления, соответствующих этим комплексам. Это может означать, что комплексы Мп11 с ацетатом и формиатом электрохимически неактивны, или что они неустойчивы вблизи поверхности положительно заряженного электрода. С другой стороны, появление отдельной волны окисления Мпи-бикарбонатных комплексов может свидетельствовать о низкой скорости разложения/образования комплекса, так как при быстром установлении химического равновесия между водным ионом металла и комплексом удаление из среды водного иона в результате окисления на электроде приводит к одновременному исчезновению комплекса [Россотти, 1965].
В присутствии ацетата и формиата электрохимическое окисление Мп11 приводит к образованию положительно заряженных комплексов состава Mn L2 . Только бикарбонат образует электронейтральный комплекс Мпш(НСОз)з. Уменьшение положительного заряда может способствовать увеличению концентрации ионов Мп" вблизи места взаимодействия Мп с апо-ВОК и таким образом обеспечивать продолжение реакции светозависимого окисления Мп11 и формирования Мп-кластера ВОК.
Поляризующее влияние иона Мпш может способствовать разложению ионов бикарбоната в составе комплекса Мпш(НС03)з, что может привести к образованию комплексов другого вида: Мп (НСОз)2(ОН) + С02 или Мпш(НСОз)(СОз) + С02 + Н20. Образование этих комплексов может облегчать включение атомов Мпш в Mn-кластер ВОК при его реконструкции. Такую возможность подтвержают термодинамические данные: энергия диссоциации ОН" из бикарбоната (8,9 ккал/моль) ниже, чем энергия диссоциации ОН" из воды (21,4 ккал/моль) [Dismukes et al., 2001].
При фотоокислении ионов Мп" остатком тирозина Yz" в апо-ВОК ФС-2 происходит выделение протона на первой и последующей стадиях [Ananyev et al., 2001]. Формиат и ацетат, имеющие рКа равные 3,76 и 4,78, соответственно [Гороновский с соавт., 1974], не могут связывать ионы Н при рН 6,5 (используемом в экспериментах с ФС-2). Бикарбонат имеет рКа1 = 6,4, поэтому он может участвовать в связывании ионов Н"1", тем самым ускоряя фотоокисление Мп .
Таким образом, показано, что все изученные анионы вызывают значительное (на 0,5-0,6 В) снижение потенциала окисления Мп" до Мпш, причём этот эффект наиболее выражен для ионов бикарбоната. В отличие от ацетата и формиата, бикарбонат способен образовывать электронейтральный комплекс Мпш(НСОз)з, тогда как формиат и ацетат формируют с Мп положительно заряженные комплексы Мпш(НСОО)2+ и Mnin(CH3COO)2+. 4.3. Определение состава комплексов Мп с бикарбонатом, ацетатом и формиатом при электрохимическом восстановлении Мп11.
Добавление к раствору 0,5 мМ MnSC 4 ионов ацетата или формиата, начиная с концентрации 0,02 М, приводит к сдвигу потенциала восстановления Мп11 с наклоном -30 мВ/lgC, что указывает на образование комплекса вида МппХ+ (рис. 9). Константы устойчивости комплексов Мп11 с ацетатом и формиатом равны соответственно 11 М"1 и 34 М"1. В присутствии ацетата и формиата не были обнаружены комплексы вида МппХ2.
Основываясь на наших данных по изменению окислительно-восстановительных свойств ионов Мп в результате образования комплексов с бикарбонатом, в недавней работе [Khorobrykh et al., 2008] было показано, что комплекс Мпи(НСОз)2 способен донировать электроны от Мп11 на реакционный центр аноксигенных пурпурных бактерий (потенциал которого составляет около 0,5 В), тогда как ацетатный и формиатный комплексы Мп11 не проявляли такой активности. Эти данные могут служить подтверждением гипотезы об участии Мп -бикарбонатных комплексов в эволюционном возникновении ВОК [Dismukes et al., 2001].
Как было показано в нашей работе, константа устойчивости бикарбонатного комплекса для Мп111 выше, чем для Мп11, на 12 порядков. Эти данные были использованы для объяснения усиления бикарбонатного эффекта на фотовыделение кислорода у тилакоидов при переводе ВОК в «отрицательные» S-состояния в результате гидразин-индуцированного восстановления марганцевого кластера [Shevela et al., 2006].
