Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
[.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Роль митохондрий в регуляции Са21" гомеостаза клетки.
Митохондриальные Са ^транспортирующие системы 8
1.1.1, Митохондриальные системы входа Ca2f 9
1.1.2. Митохондриальные системы выхода Са2+ 11
1.2. Митохондриальные Ca2f-зависимые поры 13
Циклоспорин А-чувствительная митохондриальная пора 15
Циклоспорин А-нечувствительная митохондриальная пора. Жирные кислоты как индукторы Са f-зависимой ЦсА-нечувствительной поры 25
Апоптоз и некроз - два варианта клеточной гибели. Участие митохондрий в развитии клеточной смерти 28
Пальмитиновая кислота как природный индуктор апоптоза 33
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 36
Выделение митохондрий из печени крыс 36
Оценка функциональных параметров митохондрий 36
Электронная микроскопия 37
Электрофорез и иммуноблотинг 37
Формирование однослойных липосом 38
Измерение проницаемости липосом, загруженных сульфородамином Б 38
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 40
Открытие ЦсА-нечувствительной пальмитат/Са^-активируемой митохондриальной поры зависит от Са '-связывающей способности пальмитиновой кислоты 41
Свойства пальмитат/Са2^активируемой поры 43
Влияние циклоспорина А на пальмитат-активируемуто пору 43
Пальмитат/Са2+-активируемая пора обладает способностью самопроизвольно закрываться 44
V:
3.3. Влияние известных модуляторов ЦсА-чувствительной поры,
индуцируемой Са2+ и Pi, на пальмитат/Са2+-активтируемую пору 49
Влияние неорганического фосфата на пальмитат-активируемую пору 49
Влияние адениновых нуклеотидов на пальмитат-активируемую и ЦсА-чувствительную митохондриальные поры 50
Влияние Mg2+и Sr2* на пальмитат-активируемую пору 59
3.4. Открьгше пальмитат/Са -индуцированной поры приводит к выходу
из митохондрий цитохрома с 65
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: 71
ВЫВОДЫ 74
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 75
Список сокращений
ADP - аденозин-5'-дифосфат;
АТР - аденозин-5'-трифосфат;
AMP -аденозин-5'-монофосфат;
Pi - неорганический фосфат;
ПК - пальмитиновая кислота;
ЦсА - циклоспорин А;
MPT - mitochondrial permeability transition - классическая циклоспорин А-чувствительная митохондриальная пора;
ЭГТА - этиленгликоль - бис - (2-аминоэтиловый эфир) - N, N, N', N' -тетрауксусная кислота;
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;
Трис - трис-(оксиметил)аминометан;
ДНФ - 2,4-динитрофенол;
Hepes - N-2- гіодюксготилпшіеразин-К'-2-зтансульфоновая кислота;
ПЭГ - полгатиленгликоль;
ДЧ* - разность электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий.
Введение к работе
Ионы кальция, как известно, являются универсальным внутриклеточным регулятором. Считается, что их эффекты в клетке опосредуются через связывание иона специальными Са2*-связывающими белками (Carafoli, 1987; Пермяков, 1993). Однако недавно в нашей лаборатории был обнаружен новый внутриклеточный небелковый сенсор на ионы кальция, которым оказались насыщенные длинно цепочечные жирные кислоты, а именно пальмитиновая и стеариновая. Было показано, что эти жирные кислоты связьгеают Са2+ со сродством, которое по крайней мере на 1.5-2 порядка выше, чем сродство ненасыщенных жирных кислот и других лштидов, и сравнимо со сродством ряда белков к этому иону (Mironovaetal.,2001).
Известно, что свободные жирные кислоты функционируют в клетке как субстраты дыхания (Скулачев, 1989), разобщители окислительного фосфорилирования (Skulachev, 1998а; Самарцев, 2000, Мохова и Хайлова, 2005), вторичные мессенджеры (Saltarelli et al., 1990) и др. В последнее время жирные кислоты, а именно насыщенная жирная кислота — пальмитиновая, стали рассматриваться как природные активаторы апоптоза (Kong and Rabkin, 2000; Sparagna et al,, 2000). Предполагается, что пальмитиновая кислота обладает этим действием благодаря способности индуцировать открытие Са "-зависимой неселективной поры во внутренней мембране митохондрий (Kong and Rabkin, 2000).
Открытие митохондриальной Са *-зависимой поры является одним из ключевых процессов в индукции клеточной смерти, так как при этом из митохондрий выходят проапоптотические белки. К ним относятся цитохром с, фактор, индуцирующий апоптоз (apoptosis-inducing factor, AIF), второй митохондриальный фактор, активирующий апоптоз (second mitochondrial apoptosis-activating factor, Smac/Diablo), прокаспазы 2, 3, 9 (Liu et al., 1996, Susin et al., 1999a, b; Verhagen et al., 2000). Однако, несмотря на то, что известно множество индукторов, в число которых входят жирные кислоты, а также ингибиторов Са'^-зависимой митохондриальной поры, природа поры до конца не установлена. Согласно
общепризнанной точке зрения, митохондриальная пора (Mitochondrial Permeability Transition роге - MPT пора) является белковым мегаканалом, состоящим из аденилаттранслокатора, порина, циклофилина Д и ряда других мембранных митохондриальных белков. Открытие этой поры ингибируется субмикромолярньши концентрациями иммунодепрессанта -циклоспорина Л (Zoratti and Szabo, 1995; Halestrap et al., 2002).
Однако недавно было показано, что пальмитиновая кислота способна индуцировать открытие Ca2f-зависимой митохондриальной поры, нечувствительной к циклоспорину A (Sultan and Sokolove, 2001а). Открытие этой поры, в связи с проапопотическим эффектом пальмитиновой кислоты, может иметь непосредственное отношение к механизму активации апоптоза. Что касается циклоспорин А-чувствительной митохондриальной поры, то недавно в лаборатории Кромптона было установлено, что ее открытие приводит скорее к активации некроза, чем апоптоза (Li et ai., 2004).
В то же время, механизм образования пальм итат/Са2+-активируемой поры не ясен. Возможно, что пальмитиновая кислота индуцирует открытие митохондриальной поры, механизм образования которой отличен от общепризнанного. В нашей лаборатории высказано предположение, что в основе этого механизма может лежать процесс, протекающий непосредственно в липидном бислое, и что таким процессом является образование комплекса жирной кислоты с Ca2f в митохондриальной мембране. Было обнаружено, что способностью индуцировать неспецифическую проницаемость искусственных липидньгх мембран (бислойной липидной мембраны (БЛМ)) обладают только те жирные кислоты, которые связывают Са с высоким сродством, а именно насыщенные длинноцепочечные жирные кислоты (Mironova et al., 2001).
Целью настоящей работы является изучение механизма образования пальм итат/Са ^-активируемой ЦсА-нечувствительной митохондриальной поры, выяснение свойств этой поры и ее участия в выходе из .митохондрий проапоптотического белка - цитохрома с.
В диссертации были поставлены и решены следующие задачи:
Определить роль комплексообразования жирной кислоты с Са " в процессе открытия митохондриальнои пальмитат/Са2 ^-активируемой поры.
Изучить основные свойства пальмитат/Са2+-активируемой поры.
Определить влияние известных модуляторов циклоспорин А-чувствительной митохондриальнои поры на пальмитат/Са *-активируемую пору.
4. Исследовать возможность выхода цитохрома с в процессе открытия
пальмитат-активируемой поры.
Научная новизна работы.
Впервые показано, что в основе механизма открытия пальмитат/Са2+-индуцируемой митохондриальнои циклоспорин А-нечувствительной поры лежит способность жирной кислоты образовьшать комплекс с Са f в липидной мембране. Изучены и объяснены, исходя из этой способности, основные свойства пальмитат/Са +-индуцируемой митохондриальнои поры. Показано, что в процессе открытия этой поры происходит выход из митохондрий цитохрома с, что может быть индикатором участия пальмитат-активируемой поры в апоптозе.
Научно-практическое значение работы.
Полученные результаты развивают представления о механизмах функционирования митохондрий в норме и патологии. Они могут быть использованы для исследований в области биоэнергетики, клеточной патофизиологии и медицины, поскольку в настоящее время показано, что жирные кислоты и митохондриальная пора вовлечены в индукцию ряда патофизиологических явлений: апоптоз, ишемия и др.
