Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы.
Раздел 1. 1.1 Современные представления о липолитических ферментах 10
1.2 Липазы 13
1.3 Структурная организация липаз 18
1.4 Фермент - субстратный комплекс 20
1.5 Кинетика липолиза 22
1.6 Влияние жирных кислот 24
1.7 Термолабильность ферментов 26
1.8 Зависимость активности ферментов от рН среды 27
1.9 Влияние неорганических солей на липолиз 29
Раздел 2.
2.1 Современные аспекты иммобилизации ферментов 31
2.2 Иммобилизованные ферменты 32
2.3 Методы иммобилизации ферментов 34
Глава 2. Материалы и методы
Раздел 1. Материалы 39
Раздел 2.Методы 43
Раздел 3 Статистическая обработка 49
Глава 3. Результаты собственных исследований
Раздел 3.1 Изучение влияния факторов среды на липазы из различных источников 50
Раздел 3.2 Исследование влияния заряда полимерного окружения на липазы из различных источников 56
Раздел 3.3 Изменение активности ферментов в комплексе с одним полиэлектролитом и неорганическими солями 65
Раздел 3.4 Иммобилизация липазы из Pseudomonas fluorescens в смесь из двух полиэлектролитов 73
Раздел 3.5 Иммобилизация липазы из Hog pancreas в смесь из двух полиэлектролитов 84
Выводы 95
Рекомендации по использованию 97
Список литературы 98
Приложение 112
- Фермент - субстратный комплекс
- Современные аспекты иммобилизации ферментов
- Изучение влияния факторов среды на липазы из различных источников
- Иммобилизация липазы из Pseudomonas fluorescens в смесь из двух полиэлектролитов
Введение к работе
Ферменты и ферментативные системы широко применяются в самых различных областях практической деятельности: в пищевой, фармацевтической, текстильно-кожевенной, косметической и других отраслях промышленности, а также в медицине, сельском хозяйстве, органическом синтезе, биохимическом анализе и т. д. До сих пор развитие прикладной энзимологии сдерживается дороговизной многих ферментов, особенно их чистых препаратов. Возможность применения ферментов также осложнены по ряду причин: ферменты неустойчивы при хранении, при различных воздействиях, особенно тепловых, многократное использование ферментов затруднено из-за сложности их отделения от реагентов и продуктов реакции [4,5,21,30].
К настоящему времени накоплен значительный экспериментальный материал и развиты теоретические представления о методах иммобилизации различных ферментов, позволяющие решить указанные проблемы. Целью иммобилизации является повышение устойчивости ферментов к денатурирующим агентам и придание им заданных технологических свойств, включая возможность повторного использования и легкость выделения из реакционной смеси [21, 45].
Одними из наиболее широко использующихся ферментов являются липазы, которые относятся к третьему классу ферментов (гидролазам) и способны гидролизовать сложноэфирные связи в молекулах ряда липидов (главным образом - триглицеридов). По-нашему мнению, управление липолитической активностью будет играть важную роль в новых методах лечения нарушений жирового обмена и в контроле за сердечно-сосудистыми заболеваниям, поэтому изучение возможности изменения активности липаз является важным и актуальным.
Большой интерес представляет практическое использование липаз в пищевой и других отраслях промышленности. Липазы микроорганизмов в сочетании с другими ферментами применяются для биологической очистки сточных вод. Липазы, гидролизующие триглицериды с образованием глицерина и жирных кислот, входят в состав набора реактивов для определения содержания триглицеридов во всех биологических жидкостях[7,25 - 27, 29]. Возрастающие масштабы использования липаз в биохимии и биотехнологии вызывают необходимость поиска эффективных продуцентов ферментов данной группы, в связи с чем в настоящей работе проводилось сравнение липаз из разных источников: липазы из поджелудочной железы свиньи и бактериальной липазы из Pseudomonas fluorescens [ 25-27,29].
В настоящее время в биохимических лабораториях и научно-исследовательских институтах ведутся исследования, основанные на методах иммобилизации ферментов: сорбция на носителе, ковалентное связывание и включение в структуру гелей-носителей и отдельных полимеров [13,20,24, 47, 56, 57, 106]. Однако данных о регуляции ферментативной активности липаз в комплексах на основе двух противоположно заряженных синтетических полиэлектролитов до наших работ в литературе не было. Такие исследования позволяют глубже понять природу многих важных биохимических процессов, протекающих в живых системах, а также создавать новые материалы для биотехнологии и медицины.
Целью данной работы являлось исследование влияния разнозаряженных полиэлектролитов и условий протекания каталитической реакции на активность липаз из различных источников, а также определение оптимальных условий иммобилизации липаз в полимерное окружение. Научная новизна. Впервые получены стабильные комплексы на основе липазы и двух противоположно заряженных полиэлектролитов, проявляющие повышенную каталитическую активность. Предложена модель формирования таких двух- и трехкомпонентных комплексов.
Изучено влияние знака заряда полиэлектролита на активность липаз из поджелудочной железы свиней и из бактерии Pseudomonas fluorescens.
Проведено сравнительное изучение влияния полимерно-ионного окружения и др. факторов среды на ферментативную активность липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней.
Впервые подобраны оптимальные условия для иммобилизации различных типов липаз в трехкомпонентные комплексы с полиэлектролитами.
Практическая ценность работы. Полученные экспериментальные данные по иммобилизации липаз в комплексы с различными полиэлектролитами имеют практическую ценность для разработки новейших биохимических тест-систем и биотехнологических методов.
Установленное влияние полимерного окружения на фермент позволяет использовать полиэлектролиты как аллостерические модуляторы активности, а также стабилизаторы ферментов.
Сравнительное исследование активности липаз микробного и животного происхождения даёт возможность выбора подходящего фермента и условий иммобилизации для определённого вида липазы, в целях экономии средств, при производстве и использовании препарата в различных отраслях промышленности.
Результаты и основные научно-методические положения диссертации используются в лекционном курсе и лабораторном практикуме по курсу дисциплин: «Биохимия» (3 курс ВБФ), «Биоэнергетика. Энзимология», «Кинетика и термодинамика ферментативных реакций» и «Биохимия мембран» (4 курс ВБФ) при подготовке специалистов высшей квалификации по специальности 012300 - «Биохимия» в ФГОУ ВПО «МГАВМиБ им. К.И.Скрябина».
Положения выносимые на зашиту. данные по влиянию условий среды на каталитическую активность липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней; - данные по влиянию положительно заряженного полиэлектролита (ПАМА - полидиаллилдиметиламмоний галогенид) и отрицательно заряженного полиэлектролита (ПСС -полистиролсульфонат натрия) на каталитическую активность липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней; данные по влиянию неорганических солей на каталитическую активность липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней в комплексе с полиэлектролитами (двухкомпонентные комплексы); оптимальные композиции высокоэффективных препаратов иммобилизованной липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней на основе разнозаряженных полиэлектролитов (трехкомпонентные комплексы).
Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на Всероссийской научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии в Казани в 2002 г.; на Всероссийской научно-технической конференции в Мурманске в 2003 г.; на IX Международной конференции «The problems of solvation and complex formation in solutions», Plyos, 2004; на Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.И.Скрябина, Москва, 2004 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 8 печатных работ, из них 5 статей и 3 тезисов докладов на российских и международных конференциях.
Фермент - субстратный комплекс
Результаты исследований с различными синтетическими субстратами позволяют сделать важные выводы относительно структуры фермент-субстратного комплекса и объясняют поведение липазы в отношении фосфоорганических соединений [4,5,15,21]. Опыты с разветвленными субстратами ясно показали, что стерические эффекты, обусловленные спиртовыми и кислотными остатками, различны. «Ветвление» в углеводородной цепи жирной кислоты оказывает значительно большее ингибиторное действие, чем «ветвление» на таком же расстоянии в цепи, имеющей спиртовой остаток. Субстрат не может «вращаться» вокруг фермента; он должен быть «зафиксирован», по крайней мере, в двух точках [52]. Поскольку наличие жирнокислотной цепи — условие не обязательное, чтобы соединение служило хорошим субстратом, и поскольку при многообразных изменениях спиртового радикала (или замены его водородом) субстрат остается активным, «фиксация» должна происходить по сложноэфирной группе (—О—С=0). Прежде всего, «фиксируется» положение «карбонильного углерода», потому что фермент атакует именно в этом участке. «Карбонильный» кислород не может быть вторым пунктом фиксации, так как в таком случае субстратная молекула все же могла бы вращаться вокруг двойной связи. Возможно, и даже вероятно, что «карбонильный» кислород связан также водородной связью с ферментом, подобно тому, как связан аналогичный кислород в субстратах химотрипсина. По-видимому, направленная фиксация должна идти вдоль связи С—О. Было высказано предположение [39], что фиксация эфирного «алкоксильного» кислорода субстрата может являться следствием образования водородной связи с реакционноспособным остатком гистидина. При гидролизе сложных эфиров, катализируемом химотрипсином, протон водорода акцептируется уходящей R—С-группой, которая, как мощный нуклеофил, должна немедленно подвергаться нейтрализации во избежание обратной реакции. «Фиксация» сложного эфира по двум направлениям в активном субстрат-липазном комплексе, возможно, вытекает из необходимости поместить спиртовой кислород в пределах досягаемости протона [39.57]. Таким образом, «фиксация» субстрата является не «предпереходным» состоянием, а обязательным актом ориентации, обеспечивающим процесс ферментативного гидролиза субстрата.
Согласно основному постулату энзимологии, фермент и субстрат образуют комплекс, в котором протекает реакция и который затем распадается на фермент и продукты реакции:
E + S«-»ES-+E + P. Кинетические уравнения, выведенные на основании этого постулата, в целом, применимы также к реакциям липолитических ферментов с их субстратами. Действительно было показано, что гидролиз триглицеридов липазой поджелудочной железы подчиняется основному уравнению Михаэлиса-Ментен [2,15,21,28]. Однако это соответствие носит довольно формальный характер и не всегда проясняет существо липолитических реакций.
Ферментативный гидролиз липидов имеет одно существенное отличие: это гетерогенная реакция, происходящая на границе раздела фаз, поскольку фермент растворим в воде, а субстрат нет. Следовательно, фермент-субстратное взаимодействие должно также протекать на поверхности раздела между агрегированным субстратом и водой. Среди липолитических ферментов есть внутриклеточные фосфолипазы, которые связаны с мембранами и не отличаются в этом отношении от других мембранных ферментных комплексов. Однако типичные липолитические ферменты - липазы и фосфолипазы пищеварительных желез, ядов, жировой ткани и крови -функционируют прямо в противоположных условиях: субстрат практически «неподвижен» по отношению к ферменту. Такое поведение субстрата обусловлено его агрегацией, например в мицеллы. Во время липолиза, очевидно, фермент должен находить субстрат, а не наоборот; в этом случае под «субстратом» подразумевается не отдельная его молекула, а неводная фаза агрегированного липида (мицеллы). Тем не менее, липолиз и мембранная энзимология имеют то общее, что их кинетика ограничивается двумя измерениями вместо трех и что по крайней мере один из участников реакции - фермент или субстрат - частично иммобилизован на матрице большего размера.
Термин «суперсубстрат» был предложен для обозначения матрицы, в которую встроена молекула субстрата [5]. В липолитических реакциях такой матрицей может служить поверхность триглицеридной капли или фосфолипидной мицеллы, и тогда она представляет собой агрегат многих молекул субстрата. Матрица может быть поверхностью, модифицированной включением несубстратных участников реакций, таких, как амфифильные катионы или анионы. Необходимо, чтобы ферменты не только перемещались к «суперсубстрату» и связывались с ним, но чтобы при этом соблюдалась бы и правильная ориентация активных центров вблизи молекул субстрата, находящихся в «суперсубстратной» фазе.
Очевидно, что кинетика липолиза должна отличаться от обычной кинетики ферментативной реакции во многих отношениях.
Влияние жирных кислот Влияние структуры жирной кислоты на липолиз можно обсудить с точки зрения трех аспектов: 1) влияния «ветвления» или «объемных» заместителей, 2) влияния степени ненасыщенности и 3) влияния длины цепи. Изучению последнего фактора, который можно отнести также и к стерическим помехам, уделялось много внимания, главным образом в связи с его практическим значением при анализе триглицеридов.
Ингибирующее действие «ветвления» углеродной цепи было впервые обнаружено у эфиров изомасляной кислоты, затем у эфиров а,а-диметилстеариновой кислоты; эти соединения не расщеплялись липазой. Ингибирование, которое является почти полным при наличии а-заместителя постепенно исчезает, по мере того как цепь удлиняется до шести углеродных атомов. При наличии нескольких «ветвлений» стерические помехи усиливаются.
Современные аспекты иммобилизации ферментов
В последнее время большие перспективы открылись перед прикладной энзимологией в результате создания способов иммобилизации ферментов при сохранении их функциональной активности [21].
Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ, при использовании их в прикладных целях по сравнению с нативными предшественниками.
Во-первых, гетерогенный катализатор легко отделить от реакционной среды, что дает возможность: а) остановить в нужный момент реакцию;
б) использовать катализатор повторно; в) получать продукт, не загрязненный ферментом. Последнее особенно важно в ряде пищевых и фармацевтических производств.
Во-вторых, использование гетерогенных катализаторов позволяет проводить ферментативный процесс непрерывно, например, в проточных колоннах, и регулировать скорость катализируемой реакции, а также выход продукта путем изменения скорости потока.
В-третьих, иммобилизация или модификация фермента способствует целенаправленному изменению свойств катализатора, в том числе его специфичности (особенно в отношении к макромолекулярным субстратам), зависимости каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды и, что очень важно, его стабильности по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям.
В-четвертых, иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность путем изменения свойств носителя под действием некоторых физических факторов, таких, как свет или звук. На этой основе создаются механо- и звукочувствительные датчики, усилители слабых сигналов и бессеребряные фотографические процессы. В результате внедрения нового класса биологических катализаторов — иммобилизованных ферментов, перед прикладной энзимологией открылись новые, ранее недоступные пути развития. Важно отметить, что успех практического использования препаратов иммобилизованных ферментов в значительной степени определяется подготовительным этапом работы — выбором подходящего носителя и метода иммобилизации, а также знанием кинетико-термодинамических особенностей катализа иммобилизованными ферментами [21,22,116,122].
Модифицирование ферментов для повышения их устойчивости и поиск оптимальных условий катализируемых ферментами реакций -это главные задачи ферментной инженерии. Пока самый успешный способ обеспечить высокую устойчивость и другие полезные свойства ферментов - это их иммобилизация.
Разработка методов иммобилизации белков в полимерные комплексы и исследование их свойств являются важной и быстро развивающейся областью биохимии к биотехнологии [21,70,72,78,79,85,89]. Такие исследования позволяют глубже понять природу многих важных процессов, протекающих в живых системах, а также создавать новые материалы для биотехнологии и. медицины. Основы этого направления были заложены в многочисленных работах В. А. Кабанова и А. Б. Зезина с сотрудниками [74, 20,24], в которых были детально исследованы механизмы электростатического взаимодействия между синтетическими полиионами и условия образования полиэлектролитных комплексов. Под иммобилизацией биокатализаторов понимают фиксирование ферментов или микроорганизмов в некоторой фазе, чаще всего нерастворимой, отделенной от другой фазы (раствора), в которой находятся молекулы субстрата или продукта, причем возможен перенос этих молекул между фазами.
Иммобилизованные ферменты имеют следующие преимущества в сравнении со свободными: 1. Возможность повторного или непрерывного использования. 2. Высокая устойчивость к денатурирующим агентам. 3. Простота выделения продукта с высокой степенью чистоты. 4. Возможность воздействовать на ход реакции, изменяя метод иммобилизации.
Изучение влияния факторов среды на липазы из различных источников
Одним из важных факторов, влияющих на активность липаз при гидролизе триглицеридов, является введение в систему неорганических солей. Например, NaCl в небольших концентрациях необходим для липолиза малорастворимых с длинной и короткой цепью триглицеридов, а также активирует гидролиз растворимых триглицеридов с короткой цепью [5].
Поэтому, в первую очередь исследовали изменение активности липаз, приготовленных в растворах неорганических солей: NaCl, КН2Р04, NaH2P04 от 0,0ЇМ до ЇМ (данные приведены в табл. 1, 2, 3).
За контроль принималась активность фермента, приготовленного в дистиллированной воде.
Характерно, что у всех видов липаз каталитическая активность несколько выше в растворах фосфатов, поскольку растворы фосфатов, вследствие диссоциации, высвобождают достаточное количество анионов. Это в итоге способствует установлению оптимального значения поверхностного натяжения на границе раздела фаз, а это, в свою очередь, облегчает взаимодействие активного центра фермента с субстратом. Это объясняет наблюдаемое в эксперименте увеличение активности липаз на 22 % у препарата 2 и на 29 % у препарата 3 в 0,01 М растворе КН2РО4 (Табл.1 и 2).
Однако при повышении концентрации соли до 0,05 М раствора, активность липаз падает по сравнению с предыдущим опытом (100 % у препарата 2, 114% у препарата 3), по-видимому, повышенная ионная сила растворов неблагоприятно сказывается на конформации активного центра липазы, особенно у бактериальной липазы (Табл. 1 и 2). Ионная сила большинства физиологических жидкостей равна 0,15 [33]. В приготовленном рабочем растворе ионная сила равна 0,2. Введение в систему дополнительных ионов увеличивает ионную силу раствора в лучшую или худшую сторону. Катионы уменьшают градиент рН на поверхности раздела и понижают кажущуюся рКа жирных кислот, которые в таком случае могут быть оттитрованы более количественно. Они действуют как противоионы одновалентных анионов жирных кислот, аккумулирующихся на поверхности раздела фаз. И добавление катионов выбранных солей в систему не препятствует, а даже способствует липолизу (Табл.3). Изучение влияния рН среды на ферментативную активность липаз имеет очень важное значение и было одной из первых задач исследования.
Показано существенное изменение активности липаз из Pseudomonas fluorescens и Hog pancreas при изменении рН среды, для сравнения измеряли активность липазы того же вида в стандартных условиях (Табл. 4).
Активность препарата 2 и препарата 3 при рН=5 составила 73 % и 63 % соответственно. Указанное уменьшение каталитической активности липаз объясняется значениями рН, близкими к изоэлектрической точке (липаза из Pseudomonas fluorescens pi = 4,46, липаза из Hog pancreas pl=5,18).
При рН, находящемся в зоне рН-оптимум (7-9) для данных видов липаз активность ферментов возросла до 127% и 120% соответственно (Табл.4).
При рН 9-11 (выше рН-оптимум) активность липаз понизилась, что соответствует литературным данным [100, 101].
Изучение термолабильности липаз также является необходимым для оптимизации условий работы.
Результаты опытов по измерению активности липаз из Pseudomonas fluorescens и Hog pancreas при t от 25С до 70С сравнивали с активностью липазы того же вида в стандартных условиях и выражали в соответствующих процентах.
При температуре 60 С ферментативная активность липазы из Pseudomonas fluorescens немного повысилась и составила 111% по отношению к контролю. Дальнейшее повышение температуры до 70С приводит к падению ферментативной активности и инактивации липазы из Pseudomonas fluorescens. Активность липазы из Hog pancreas уже при 50С снижалась до 68%. Таким образом, эти результаты свидетельствуют о термостабильности препарата 2 и термолабильности препарата 3.
Иммобилизация липазы из Pseudomonas fluorescens в смесь из двух полиэлектролитов
В работах ученых химического факультета МГУ (В.А. Кабанов, А.Б. Зезин и др.) [20,24] были детально изучены механизмы электростатического взаимодействия между синтетическими полиионами и условия образования полиэлектролитных комплексов, а также взаимодействия фермент - полиэлектролит. Нами изучены активность липаз при ассоциации с двумя заряженными полимерами. Комплекс между поликатионом, полианионом и белком образуется за счет взаимодействия сильно ионизированных групп, т.е. вдали от изоэлектрической точки белка. Образование такого комплекса происходит при низких значениях рН при смешивании белка и поликатиона с раствором полианиона, а при высоких рН - при смешении белка и полианиона с раствором поликатиона.
Образование комплекса происходило при мольном соотношении второго полимера к первому полимеру, равном 0,6 -коэффициент мольного соотношения ПСС к комплексу липаза / ПАМА при низких значениях рН или ПАМА к комплексу липаза / ПСС при высоких значениях рН.
Данные по активности препарата 1 и 2 (в процентах) в комплексах фермент - полимеры различного состава, в системе (дисперсии) и в супернатанте (после центрифугирования дисперсии) приведены в таблицах 11-14. Высокая активность в супернатанте может рассматриваться как степень включения липазы в комплексы, т.е. высокая эффективная активность будет мерой успеха проведенного опыта [20,24]. Показано, что активность липазы, иммобилизованной в полианион - поликатионные комплексы, существенно зависит от следующих параметров: рН среды, молекулярного соотношения полиэлектролит - фермент и молекулярной массы полимеров.
В таблице 11 приведены результаты опытов с препаратом 1 (липаза из бактерий Pseudomonas nuorescens), при изменении рН фактора и массового отношения полиэлектролиты / липаза.
При рН = 3,0 препарат 1 почти полностью терялась каталитическая активность (ПЭЛК 1-5 %), поэтому данное значение рН было исключено для дальнейших исследований.
Принимая во внимание величину изоэлектрической точки для каждого вида липазы, где у нее нет избыточного заряда для электростатического взаимодействия, все дальнейшие эксперименты проводились при значениях рН 9,0 или 11,0 (но не при нейтральном рН, где структурные параметры полученных сложных комплексов не стабильны [58,59]).
При увеличении рН до 9,0-11,0 липаза активируется в поликатион - полианионной системе, вследствие образования крупных частиц комплекса, что подтверждает способность липаз активироваться вблизи поверхности раздела фаз.
Наивысшая активность липазы (ПЭЛК 4 - 62 %) наблюдалась при образовании комплекса при рН 9,0, что согласуется с рН-оптимум липазы (рН 8,0-9,0). Хотя общая активность в системе была явно выше при рН 11,0, но активность в супернатанте также была чрезвычайно высока, что в результате привело к низкой эффективной активности (Табл. 11, Рис. 3). Эти результаты были несколько неожиданны, поскольку липаза, заряженная отрицательно при высоких значениях рН, должна была бы полностью включиться в полиэлектролитную систему, чего на самом деле не произошло.
Соотношение полиэлектролит : липаза также играет важную роль при приготовлении активного комплекса; так, наилучшие результаты (ПЭЛК 6-62 %) были получены при относительно низкой концентрации белка в системе (100 : 1). Вероятно, это связано с тем, что при эквимолярном соотношении липаза : полиэлектролит происходит конкуренция между белком и полианионом, в результате которой белок вытесняется из полиэлектролитной системы. Именно соотношение (100 : 1) дает наилучшие результаты как по структурным параметрам комплекса, так и по связыванию липазы в эти комплексы (Табл. 12, ПЭЛК 4). Этот эффект можно объяснить способностью фермента лучше иммобилизоваться в поликомплексы с избытком полимеров и увеличением его активности в составе такого поликомплекса. Причина высокой каталитической активности состоит, по-видимому, в стабилизирующем действии мицеллярной матрицы, поскольку при этом подвижность групп активного центра оказывается минимальной. Дальнейшее уменьшение относительной концентрации липазы ведет к уменьшению эффективности иммобилизации липазы и агрегации комплексов. Подобные эффекты были обнаружены также и при иммобилизации различных липаз в полиэлектролитные гидрогели (Зубов В.П. и др.).
Вопрос о том, произошли ли в белке конформационные изменения при иммобилизации, решается исследованием структуры иммобилизованных ферментов физическими методами. Для этой цели мы применяли лазерное светорассеяние. Данные представлены в таблице 12.
В результате иммобилизации пространственная структура фермента может либо существенно измениться, либо незначительно измениться, либо остаться неизменной. Конформационные изменения могут быть обусловлены присоединением белка к полиэлектролиту (поликатиону), защитить молекулу фермента от инактивации на стадии иммобилизации позволяет второй полиэлектролит (полианион). Между ферментом и полиэлектролитами возникают в этом случае неспецифические взаимодействия (электростатические, гидрофобные, водородные связи). С помощью двух разнозаряженных полиэлектролитов, по-видимому, возможно «стабилизировать» каталитически «выгодную» конформацию липазы.
