Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
Структурно-функциональная организация фотосистемы 2 7
Белки водоокисляющего комплекса фотосистемы 2 10
1.2.1. Белки PsbP и PsbQ высших растений и зеленых водорослей 11
Структура и взаимодействие с фотосинтетической мембраной 11
Функц ия 12
1.2.2. Белки PsbU и PsbV красных водорослей, цианобактерий
и зеленых оксиф ото бактерий 12
Структура и взаимодействие с фотосиптетической мембраной 12
Функция 13
Белки цианобактерий, гомологичные PsbP и PsbQ эукариот 14
Белок красных водорослей, гомологичный PsbP эукариот 15
1.3. Белок PsbO 15
1.3.1. Структура PsbO 16
Первичная структура белка 16
Структура PsbO, связанного с фотосистемой 2 19
Структура PsbO в растворе 21
Дисульфидиая связь 21
Кислотно-щелочной гистерезис буферных свойств белка 22
Взаимодействие PsbO с фотосинтетической мембраной 23
Функция PsbO 24
Эффекты, возникающие в отсутствие PsbO 24
Гипотезы о функциональном значении PsbO 25
Карбоангидразная активность, ассоциированная с фотосистемой 2 27
Карбоангидраза Cah3 одноклеточной зеленой водоросли
Chlamydomonas reinhardtii 30
Внутриклеточная локализация 31
Функциональное значение '. 32
1.6. Редокс-регуляция фото синтетических процессов 34
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36
2.1. Экспрессия PsbO в Escherichia coli, выделение
и очистка рекомбинантного белка 36
Конструирование плазмид для экспрессии PsbO 36
Экспрессия рекомбинантных белков 37
Выделение и очистка слитных белков trx-Hise-PsbO и trx-Hise-Xa-PsbO 37
Разделение слитного белка trx-His6-PsbO 38
Разделение слитного белка trx-His6-Xa-PsbO 38
2.2. Сайт-направленный мутагенез PsbO 39
2.3. Экспрессия СаЬЗ в Escherichia coli, выделение
и очистка рекомбинантного белка -. 40
Конструирование экспрессионного вектора 40
Экспрессия и очистка СаЬЗ 40
2.4. Получение препаратов ФС 2 из листьев шпината,
выделение и очистка PsbO шпината 41
Реконструкция usw-ФС 2 с помощью рекомбинантного PsbO 43
Получение препаратов ФС 2 из клеток С. reinhardtii 43
Реконструкция препаратов ФС 2 из мутанта С. reinhardtii сіаЗ
с рекомбинантной карбоангидразой cah3 44
2.8. Исследование взаимодействия ионов Са2+ и Мп2+ с PsbO методом
температурной зависимости собственной флуоресценции белка 45
2.9. Исследование взаимодействия ионов Са и Мп с PsbO
и рН-индуцируемых конформационных переходов PsbO
методом флуоресценции гидрофобного зонда АНС 46
2.10. Температурная и солевая обработка з\-ФС2 препаратов
на свету и в темноте 47
Электрофорез в градиенте мочевины 47
Расчет плотности межмолекулярных контактов в молекуле PsbO 48
Электрофорез и иммуноблоттинг 48
Определение концентрации белка 49
Определение концентрации хлорофилла 49
Определение карбоангидразной активности 49
2.17. N-концевое секвенирование и масс-спектрометрия 50
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 51
3.1. Экспрессия шпинатного PsbO в Escherichia coli, разработка методики
выделения и очистки рекомбинантного белка 51
Экспрессия PsbO в векторных плазмидах рЕТ28 и рЕТ32 51
Выделение и очистка рекомбинантного PsbO,
экспрессированного в векторной системе рЕТ32 55
3.1.3. Замена последовательности сайта узнавания энтерокиназы в
экспрессионном векторе pET32-PsbO на последовательность
сайта узнавания фактора Ха 58
3.1.4. Экспрессия PsbO в векторной плазмиде pET32-Xa-PsbO,
выделение и очистка рекомбинантного белка 58
3.1.5. Исследование структурно-функциональных свойств
рекомбинантного PsbO 60
3.2. Экспрессия карбоангидразы СаЬЗ в Escherichia coli, разработка
методики выделения и очистки рекомбинантного белка 64
3.3. Изучение влияния рН на конформацию PsbO in vitro и на
способность белка взаимодействовать с ионами кальция и марганца 68
3.3.1. Исследование взаимодействия ионов кальция и марганца с PsbO
методом температурной зависимости собственной флуоресценции белка 68
3.3.2. Исследование взаимодействия ионов кальция и марганца
с PsbO и рН-индуцируемых конформационных переходов
PsbO с использованием гидрофобного красителя АНС 74
3.4. Влияние освещения на экстракцию PsbO и
ионов марганца из препаратов ФС 2 78
3.5. Сайт-направленный мутагенез аминокислотных
остатков PsbO, предположительно ответственных за
рН-индуцируемые конформационные изменения белка 84
3.6. Реконструкция препаратов ФС 2 из мутанта С. reinhardtii сіаЗ
с рекомбинантной карбоангидразой СаЬЗ 90
3.6.1. Влияние рекомбинантной карбоангидразы СаЬЗ на скорость
выделения кислорода у препаратов ФС 2 из мутанта сіаЗ 90
3.6.2. Влияние рекомбинантной карбоангидразы СаЬЗ на
фотоиндуцируемые изменения выхода флуоресценции
хлорофилла ФС 2 мутанта сіаЗ 93
3.6.3. Связывание СаЬЗ с комплексами ФС 2 из мутанта 93
3.7. Исследование влияния окислителей и восстановителей
сульфгидрильных групп на структуру и функцию
белков СаЬЗ и PsbO 96
3.7.1. Влияние окислителей и восстановителей сульфгидрильных
групп на активность СаЬЗ 97
3.7.2. Влияние дисульфидной связи на стабильность структуры PsbO 102
3.8. Заключение: белки PsbO и СаЬЗ как необходимые компоненты
водоокисляющего комплекса фотосистемы 2 108
ВЫВОДЫ 111
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 113
Введение к работе
Важнейший для энергетики биосферы процесс фотосинтетического окисления воды осуществляется во встроенном в мембрану тилакоидов пигмент-белковом комплексе, называемом фотосистемой 2 (ФС 2). Собственно реакция окисления воды происходит в энзиматическом центре, расположенном на люменальной стороне ФС 2 и состоящем из четырех атомов марганца и атома кальция. Лигандами для атомов марганца и кальция активного центра являются аминокислотные остатки интегральных белков Д1 и СР43 [Ferreira et al., 2004]. Однако для стабильности и оптимальной работы каталитического центра, осуществляющего окисление воды, необходимо присутствие ряда периферических белков, ассоциированных с ФС 2 на донорной стороне. Эти белки называют также внешними белками водоокисляющего комплекса (ВОК). У высших растений и зеленых водорослей это белки PsbO, PsbP, PsbQ, а у красных водорослей, цианобактерий и зеленых фотобактерий PsbO, PsbU, PsbV. Однако исследования последних лет показывают, что белковый состав ВОК вероятно более разнообразен. Недавно в составе высокоочищенных комплексов ФС 2 Synechocystis 6803 были обнаружены белки, гомологичные PsbP и PsbQ эукариот [Thornton et al., 2004]. У красной водоросли Cyanidium caldarhim в составе ВОК обнаружен белок, гомологичный PsbQ зеленых растений [Enami et al., 1998]. Кроме того, показано, что с донорной стороной ФС 2 одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii ассоциирована карбоангидраза СапЗ [Karlsson et al., 1995; Park et al., 1999; Villarejo et al., 2001]. Полученные данные позволяют расширить традиционные представления о белковом составе водоокисляющего комплекса.
PsbO - единственный белок ВОК, который встречается у всех оксигенных организмов, он, по-видимому, появился одновременно с возникновением способности окислять воду [De Las Rivas et al., 2004]. Этот белок не принимает непосредственного участия в реакции окисления воды, однако он является минимальным внешним компонентом ВОК необходимым для оптимального осуществления этой реакции. Другие люменальные белки ФС 2 - PsbU, PsbV, PsbP и PsbQ эволюционно возникли позднее и служат для оптимизации работы ВОК в разных экологических условиях [De Las Rivas et al., 2004]. Несмотря на интенсивные исследования структуры и функции PsbO на протяжении вот уже тридцати лет, молекулярный механизм участия этого уникального белка в оптимизации функции окисления воды до сих пор не выяснен. Наиболее распространена гипотеза об участии PsbO в связывании ионов кальция, являющегося ключевым кофактором фотосинтетического окисления воды [Zhang et al., 1996; Heredia and De Las Rivas, 2003; Kruk et al., 2003; Murray and Barber, 2006]. Кроме того, существует предположение о том, что PsbO принимает участие в отводе протонов от каталитического центра и/или в транспорте к нему молекул воды [Shutova et al., 1997; Rutherford and Faller,
6 2001; De Las Rivas and Barber, 2004]. Уникальным свойством PsbO является кислотно-щелочной гистерезис буферных свойств, предположительно связанный с существованием двух устойчивых протон-зависимых конформаций белка [Шутова с соавт., 1992; Shutova ct al., 1997]. In vivo функционирование PsbO осуществляется в условиях изменяющегося рН: при освещении происходит подкисление люмена в результате выделения протонов при окисления воды, в темноте рЫ люмена близок к нейтральному [Siggel, 1975; Kramer et al., 1999]. В связи с этим можно предположить, что обнаруженные протон-зависимые конформационные состояния PsbO могут иметь место in vivo и играть функциональную роль. Целью данной работы было изучение влияния рН на конформацию PsbO in vitro и in vivo, а также на его способность связывать ионы кальция и марганца.
Первоначально предполагалось, что роль карбоангидразы СаЬЗ, обнаруженной на люменальной стороне ФС 2 С. reinhardtii, не связана с функцией окисления воды, а заключается в поставке субстрата (СОг) для стромального фермента рибулозобифосфаткарбоксилазы [Karlsson et al., 1995; Karlsson et al., 1998; Park et al., 1999]. Впоследствии в работе Вилларехо с соавт. было проведено сравнение функциональных свойств ФС 2 у мутанта сіаЗ, лишенного СаЬЗ, и дикого типа С. reinhardtii; и были получены данные, свидетельствующие о непосредственном участии карбоангидразы СаЬЗ в работе ВОК [Villarejo et al., 2002]. Однако для более прямого доказательства необходимости СаЬЗ для функционирования ВОК, а также для выяснения механизма участия этого белка в оптимизации функции окисления воды, необходимы эксперименты по реконструкции препаратов ФС 2 из мутанта сіаЗ изолированной карбоангидразой СаЬЗ, что и является целью данной работы.
За исключением одного из белков свето-собирающего комплекса, LHCbll [Balmer et al., 2006], белки PsbO и СаЬЗ являются единственными белками ФС 2, имеющими парные остатки цистеина. Известно, что два цистеина в молекуле PsbO образуют дисульфидную связь [Tanaka and Wada, 1988]. Однако в вопросе о влиянии дисульфидной связи на структуру и функцию белка до сих пор существует противоречие [Tanaka and Wada, 1988; Irrgang et al., 1992; Burnap et al., 1994; Betts et al., 1996; Wyman and Yocum, 2005]. Обнаружение у люменального белка иммунофилина FKBP13 дисульфидной связи, необходимой для активности [Gopalan et al., 2004], дало начало новому направлению в изучении фотосинтеза - редокс-регуляции в люмене [Buchanan and Luan, 2005] и привело к активному поиску других белков люмена, которые могут регулироваться за счет окислительно-восстановительных превращений. Наличие у белков СаЬЗ и PsbO парных остатков цистеина дает возможность рассматривать их как потенциальные мишени для редокс-регуляции в люмене. В связи с этим целью данной работы было исследование влияния окисления и восстановления сульфгидрильных групп на структуру и функцию белков СаЬЗ и PsbO, в свете возможной редокс-регуляции их активности.
