Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1.1 Суперсемейство ка'дгеринов 12
1.2 "Классические" кадгерины. Структура кадгеринового комплекса 15
1.3 Кадгерины в клетках сосудов 21
1.4 Механизмы регуляции проницаемости эндотелия 24
1.5 Регуляция кадгерин-опосредуемои межклеточной адгезии путем фосфорилирования 27
1.6 Влияние кадгеринового комплекса на активацию внутриклеточных сигнальных путей 30
1.7 Т-кадгерин опосредует внутриклеточную сигнализацию 35
1.8 Роль Т-кадгерина в сосудистой системе в норме и при патологии 36
1.9 Т-кадгерин регулирует пролиферацию клеток и опухолевый рост 40
1.10 Т-кадгерин опосредует сигнальные эффекты ЛПН в клетках сосудов 44
ГЛАВА II. Материалы и методы 48
2.1 Материалы 48
2.2 Культивирование эукариотических клеток 48
2.3 Трансфекция эукариотических клеток и селекция клонов 49
2.4 Приготовление лизатов клеток 52
2.5 Определение концентрации белка в лизатах клеток 52
2.6 Электрофорез белков и иммуноблоттинг 52
2.7 Метод измерения активности SRE 53
2.8 Метод выделения активных Rho ГТФаз (GST-pull-down assay) 54
2.9 Иммунофлуоресцентное окрашивание эндотелиальных клеток 55
2.10 Гиперэкспрессия Т-кадгерина в ЭК с использованием аденовирусной трансдукции 57
2.11 Подавление нативной экспрессии Т-кадгерина в ЭК методом siRNA с использованием лентивирусной трансдукции 57
2.12 Метод измерения проницаемости эндотелиального монослоя in vitro 58
2.13 Метод экстракции актина 59
2.14 Выделение и йодирование ЛНП 60
2.15 Определение поверхностного связывания І-ЛНП с клетками 61
2.16 Определение концентрации внутриклеточного Са 61
2.17 Миграция L929 клеток в микрокамере Бойдена 64
2.18 Статистическая обработка результатов 65
ГЛАВА III. Результаты 66
3.1 Т-кадгерин активирует Rho ГТФазы 66
3.2 Т-кадгерин активирует Racl и Cdc42, но не влияет на активность RhoA - 68
3.3 Т-кадгерин увеличивает содержание фосфорилированной LIMK1 и влияет на организацию микротрубочек в ЭК 70
3.4 Гиперэкспрессия Т-кадгерина увеличивает содержание стресс фибрилл актина в ЭК 74
3.5 Подавление экспрессии Т-кадгерина уменьшает содержание стресс фибрилл актина в ЭК 77
3.6 Т-кадгерин изменяет экспрессию Р-катенина, но не VE-кадгерина 80
3.7 Подавление экспрессии Т-кадгерина уменьшает проницаемость эндотелиального монослоя 86
3.8 Получение клонов клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин. Анализ экспрессии Т-кадгерина в клонах 88
3.9 Гиперэкспрессия Т-кадгерина увеличивает связывание 1251-ЛНП с мембранами клеток L929 и НЕК293 89
3.10 Введение ЛНП в среду культивирования клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, повышает концентрацию внутриклеточного кальция 93
3.11 ЛНП стимулируют миграцию клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин 102
ГЛАВА IV. Обсуждение результатов 104
Выводы 124
Список литературы 126
- Суперсемейство ка'дгеринов
- Трансфекция эукариотических клеток и селекция клонов
- Определение концентрации внутриклеточного Са
- Гиперэкспрессия Т-кадгерина увеличивает содержание стресс фибрилл актина в ЭК
Введение к работе
В нашей лаборатории было обнаружено, что на мембранах гладкомышечных клеток (ГМК) сосудов существует участок низкоафинного связывания липопротеидов низкой плотности (ЛНП), способный активировать системы внутриклеточной сигнализации (Bochkov et al., 1993; Bochkov et al., 1994). Связывание низкоафинного участка с ЛНП на мембранах ГМК стимулирует фосфоинозититидный обмен, активирует фосфолипазу С и вызывает мобилизацию внутриклеточного Са" (Bochkov et al., 1993). В отличие от хорошо изученного "метаболического" действия ЛНП, опосредуемого классическим рецептором ЛНП (апо В,Е-рецептором), механизмы сигнальных ("гормоноподобных") эффектов ЛНП неизвестны. Быстрота, насыщаемость и обратимость, характерная для "гормоноподобных" эффектов ЛНП, свидетельствует об участии специфического рецептора в передаче сигнала от ЛНП внутрь клетки, однако ни природа предполагаемого рецептора, ни механизмы его сопряжения с системами вторичных посредников до конца не выяснены.
В поисках рецептора, опосредующего сигнальные эффекты ЛНП, в нашей лаборатории
методом лигандного блоттинга был выделен, очищен и охарактеризован белок, имеющий
молекулярную массу 130/105 кДа. Анализ чувствительности к различным ингибиторам
показал, что р105/130 является новым ЛНП-связывающим белком, отличным от всех
известных рецепторов (Bochkov et al., 1996). Параметры связывания 1251-ЛНП с р 105/130
совпадают с параметрами ЛНП-опосредованной активации систем вторичных посредников
(Bochkov et al., 1996). Сиквенирование очищенного белка р105/130 показало, что его
аминокислотная последовательность соответствует последовательности Т-кадгерина; р105
представляет собой зрелую форму белка, а р130 - его предшественник (Tkachuk et al, 1998).
Было показано, что связывание Т-кадгерина с ЛНП ингибируется антителами против ЛНП
(антитела против апо В белка) и поликлональными антителами против Т-кадгерина, произведенными в нашей лаборатории (Bochkov et al., 1996). Однако эти данные лишь косвенно свидетельствуют о том, что Т-кадгерин, возможно, является низкоафинным участком связывания ЛНП, и возможно участвует во внутри клеточной сигнализации, опосредованной связыванием ЛНП с поверхностью клетки.
Т-кадгерин является уникальным представителем кадгеринового суперсемейства: внеклеточная часть Т-кадгерина, как и у всех "классических" кадгеринов, состоит из пяти Са2+-связывающих доменов (Ivanov et al., 2001), в то же время, Т-кадгерин не имеет ни трансмембранного, ни внутриклеточного доменов и заякорен на цитоплазматической мембране через гликозилфосфатидилинозитол (ГФИ) (Ranscht and Dourz-Zimmermann, 1991; Vestal and Ranscht, 1992). Межклеточные контакты, в состав которых входят "классические" кадгерины, формируются в результате взаимодействия гомологичных N-концевых внеклеточных доменов кадгеринов, расположенных на мембранах соседних клеток. Стабильность адгезивных контактов опосредуется взаимодействием внутриклеточных доменов кадгеринов с компонентами актинового цитоскелета (Angst et al., 2001). Кальций-зависимая гомофильная межклеточная адгезия играет важную роль при формировании органов и тканей в эмбриогенезе и в поддержании нормальной структуры тканей во взрослом организме (Perez-Moreno et al., 2003). Отсутствие трансмембранного и цитоплазматического доменов, а также локализация Т-кадгерина в липидных плотах (Philippova et al., 1998), в местах сосредоточения многих сигнальных путей (Src киназ, малых G белков, рецептора урокиназы и др.), предполагает участие Т-кадгерина во внутриклеточной сигнализации, а не в обеспечении прочной межклеточной адгезии.
Изначально Т-кадгерин был выделен из эмбрионов цыпленка, где он выполняет
функцию негативного регулирования прорастания аксонов по механизму гомофильного
связывания и контактного торможения (Ranscht et al., 1991; Fredette and Ranscht, 1994; Fredette
et al., 1996). Аналогичным образом Т-кадгерин выполняет навигационную функцию при неоангиогенезе, что было показано в нашей лаборатории на модели прорастания сосудов в матригель, вводимого мышам линии NUDE подкожно. При этом Т-кадгерин играет ингибирующую роль, подавляя начальные этапы ангиогенеза in vivo и миграцию эндотелиальных клеток (ЭК) in vitro (Rubina et al., 2007). Локализация Т-кадгерина на конусе роста прорастающих к своим мишеням аксонов мотонейронов (Fredettc et al., 1996), участие Т-кадгерина в прорастании мелких сосудов и капилляров при неоангиогенезе и опухолевом ангиогенезе (Wyder et al., 2000; Rubina et al., 2007), а также локализация Т-кадгерина на лидирующем крае мигрирующих эндотелиальных клеток (Ivanov et al., 2004), позволило сделать предположение о том, что Т-кадгерин является навигационным рецептором, участвующим в активации систем внутриклеточной сигнализации. В литературе имеются отдельные данные, подтвержадющие это предположение: в модельных экспериментах на культуре клеток in vitro было показано, что взаимодействие между молекулами Т-кадгерина на поверхности эндотелиальных клеток приводит к активации RhoA и Racl сигнальных путей, изменению организации актинового цитоскелета и смене клеточного фенотипа с нормального на промиграторный (Philippova et al., 2003; Philippova et al., 2005). Кроме того, способность эндотелиальных клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, прикрепляться и распластываться на субстрате, содержащем рекомбинантный Т-кадгерин, достоверно снижается по сравнению с контролем (Philippova et al., 2005). Тем не менее, следует отметить, что подавление активности RhoA и Racl сигнальных путей лишь частично снимает Т-кадгерин-зависимые изменения клеточного фенотипа, что позволяет предполагать осуществование дополнительных путей передачи сигнала с Т-кадгерина внутрь клетки.
Таким образом, целью данной работы было оценить влияние экспрессии Т-кадгерина на активацию систем внутриклеточной сигнализации, реорганизацию компонентов цитоскелета и проницаемость эндотелиального монослоя.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: оценить влияние экспрессии Т-кадгерина на
Активацию внутриклеточной сигнализации с участием Rho ГТФаз и реорганизацию цитоскелета.
Проницаемость эндотелиального монослоя.
Экспрессию и локализацию VE-кадгерина и р-катенина в межклеточных контактах.
Связывание І-ЛНП с поверхностью клеток.
Изменение концентрации внутриклеточного кальция в ответ на добавление ЛНП в среду инкубирования.
Миграцию клеток по градиенту ЛНП.
Суперсемейство ка'дгеринов
На основании происхождения, а также в соответствии с доменной и геномной организацией, суперсемейство кадгеринов делится на 5 больших групп (Nollet et al., 2000, Foty and Steinberg, 2004; Vincent et al., 2004; Gumbiner, 2005) (Рис. 1). 1. "Классические" кадгерины: Тип I. Кадгерины этого типа содержат 5-7 внеклеточных доменов, трансмембранную и цитоплазматическую часть. В составе аминотерминального ЕС1 домена есть аминокислотная последовательность His-Ala-Val (HAV), необходимая для гомофильного узнавания (кадгерины Е-, N-, Р-, R-, В-, К-, С-, ХВ-, Е, кадгерин DE дрозофилы и DN-кадгерин). Эти кадгерины внутриклеточной частью взаимодействуют с Р-катенином, а-катенином, белком р120 и актиновым цитоскелетом. Тип II. Кадерины этого типа также участвуют в гомофильной адгезии, но не содержат последовательности HAV (кадгерины VE-, ОВ-, F- и кадгерины 6, 7, 8, 10, 11, 12). Кадгерины 11 типа сосредоточены в местах адгезивных межклеточных контактов, где их внутриклеточный домен также взаимодействует с актиновым цитоскелетом посредством катенинов. 2. Десмосомальные кадгерины: десмоколлины, десмоглеины. Кадгерины этой группы формируют десмосомальные контакты, цитоплазматический домен которых взаимодействует с плакоглобином (у-катенином), десмоплакином и промежуточными филаментами. 3. Атипичные кадгерины: Т-кадгерин, LI-кадгерин. Кадгерины, не содержащие внутриклеточного и цитоплазматического доменов, и не взаимодействующие с катенинами и актиновым цитоскелетом. 4. Протокадгерины: CNRs кадгерины (а-протокадгерины), Р-протокадгерины, у-протокадгерины, кадгерины РАРС и АХРС. Имеют различные по строениею внеклеточные домены. Протокадгерины экспрессируются преимущественно в нервной системе, и цитоплазматической частью не связаны с катенинами. 5. Кадгериноподобные сигнальные белки: FAT, Dachous, Flamingo, RET тирозинкиназа. Белки имеют характерную для кадгеринов доменную организацию. Играют важную роль в эмбриогенезе, участвуют в подавлении роста опухолей, формировании полярности (в основном в эмбриогенезе у Drosophila). О функции этих белков мало что известно.
Суперсемейство кадгеринов. А - Классические кадгерины. Б - Протокадгерины. В Атипичные кадгерины. Г- Десмосомальные кадгерины. Д— Кадгериноподобные белки. Хорошо изучены кадгерины I и II группы, представляющие собой гликопротеиды, участвующие в Са"+-зависимой межклеточной гомофильной адгезии и опосредующие взаимодействия молекул кадгеринов с актиновым цитоскелетом, а также участвующие во внутриклеточной сигнализации (Foty and Steinberg, 2004). "Классические" кадгерины обычно состоят из пяти внеклеточных Са"+-связывающих доменов (ЕС1-ЕС5 домены), трансмембранного и цитоплазматического доменов (Angst et al., 2001; George and Beeching, 2006). Изначально кадгерины получили свое название соответственно ткани, из которой они были выделены. Так, N-кадгерин впервые был найден в нервной ткани (nerve), R-кадгерин - в сетчатой оболочке глаза (retina), VE-кадгерин - в эндотелии сосудов (vascular endothelial) (Vincent et al., 2003; Perez-Moreno et al., 2003). Однако позднее было показано, что некоторые кадгерины экспрессируются и в других тканях тоже (Angst et al., 2001; Gumbiner, 2005). Десмосомальные кадгерины экспрессируются преимущественно в эпителиальных клетках и кардиомиоцитах, кадгерины этого типа ассоциированы с промежуточными филаментами. Десмосомы формируются при взаимодействии целого ряда белков - десмосомальных кадгеринов (десмоглеины и десмоколлины), плакоглобина, плакофиллинов 1-3, десмоплакииа и др. При этом внутриклеточные домены десмосомальных кадгеринов связываются через десмоплакины с промежуточными филаментами (Angst et al., 2001).
Гомозиготы -І- по гену десмоплакииа погибают на ранней стадии Е6.5 развития эмбриона (Gallicano et al., 1998). Подавление экспрессии гена десмоплакииа во взрослом организме путем РНК-интерференции (siRNA) ингибирует образование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками in vitro (Vincent et al., 2004). Другая группа кадгеринового суперсемейства - протокадгерины, также опосредуют слабую межклеточную гомофильную адгезию (Gumbiner, 2005; Frank and Kemler, 2002). Протокадгерины представляют собой одну из самых больших групп кадгеринов, свыше 70 протокадгеринов экспрессируются у млекопитающих. Известно, что в эмбриогенезе они участвуют в огранизации нервной системы. Во взрослом огранизме протокадгерины локализуются в местах межсинаптических контактов, где участвуют в формировании синаптических щелей (Frank and Kelmer, 2002). Группа кадгериноподобных сигнальных белков, также входящих в суперсемейство кадгеринов, состоит из белков FAT, Daschous и Flamingo. В отличие от "классических" кадгеринов, в состав которых входят 5-7 внеклеточных доменов, трансмембранная и цитоплазматическая часть, белки Flamingo имеют цитоплазматический домен, 7 раз пронизывающий мембрану, и 9 кадгерино-подобных повторов во внеклеточной части. Daschous состоит из 27 кадгериновых повторов и одного цитоплазматического домена. Эти белки имеют схожее строение у птиц и человека и ответственны за организацию эпителия и движение клеток при морфогенезе (Frank and Kemler, 2002; Saburi and McNeill, 2005).
Трансфекция эукариотических клеток и селекция клонов
Для гиперэкспрессии Т-кадгерина в НЕК293 клетках, использовали ко-трансфекцию плазмидой pcDNA3.1/T-cad, содержащей полноразмерную кДНК Т-кадгерина человека и ген пуромицина (плазмида создана ранее в нашей лаборатории (Philippova et al., 2003)), и плазмидой pcDNA3.1/GFP, содержащей ген зеленого флуоресцентного белка GFP. В качестве контроля клетки НЕК293 ко-трансфицировали плазмидами pcDNA3.1 (содержит фрагмент кДНК люциферазы в анти-смысловой ориентации) и pcDNA3.1/GFP. Селекцию клонов, экспрессирующих Т-кадгерин, проводили в среде, содержащей антибиотик пуромицин (GIBCO) в концентрации 10 мкг/мл, так же учитывая флуоресценцию зеленого белка GFP. Селекцию контрольных клонов проводили, учитывая экспрессию GFP. В работе использовали 2 клона НЕК293 клеток, ко-экспрессирующие Т-кадгерин и GFP (Th5 и Th8), и клон контрольных клеток, экспрессирующий GFP. Гиперэкспрессию Т-кадгерина в полученных клонах подтверждали методом электрофореза и последующим иммуноблоттингом с использованием клеточных лизатов. Клоны клеток L929, экспрессирующие ген Т-кадгерина человека (клон ТСЗ) и контрольную плазмиду (клон К9) были получены ранее в нашей лаборатории.
Для гиперэкспрессии Т-кадгерина в NIH3T3 клетках использовали плазмиду, pcDNA3.1/T-cad, или контрольную плазмиду pcDNA3.1. В эксперименте по измерению активности SRE (Serum Response Element) NIH3T3 клетки трансфицировали плазмидами pcDNA3.1/T-cad, pcDNA3.1, плазмидой для экспрессии b-галактозидазы pCMV-b-Gal (Clontech, USA), плазмидой для экспрессии люциферазы и SRE SRE.L (Stratagene, USA). В качестве положительного контроля при измерении активации SRE использовали плазмиду, содержащую ген pi 14RhoGEF, который является фактором обмена гуанина и активирует Rho ГТФазы. Для подавления активности Rho ГТФаз использовали плазмиды, несущие доминантно-негативные конструкты RhoN17, RacN17 и Cdc42N19 для RhoA, Racl и Cdc42, соответственно. При оценке активации Rho ГТФаз методом осаждения с использованием сефарозы (GST pull-down assay) NIH3T3 клетки трансфицировали плазмидами, содержащими гены постоянно активных форм ГТФаз: для RhoA - RhoV12, для Racl - RacV12, для Cdc42 -Cdc42V12. Для оценки влияния гиперэкспрессии Т-кадгерина на активацию LIMK.1 клетки NIH3T3 ко-трансфицировали плазмидами pcDNA3.1/T-cad и плазмидой myc-LIMKl, кодирующей LIMK1 и с-Мус эпитоп, для усиления эндогенной экспрессии LIMK1 и для контроля присутствия трансгена в трансфицированных клетках; контрольные клетки ко-трансфицировали плазмидами pcDNA3.1 и myc-LIMKl. Экспрессию Т-кадгерина, фосфорилированной L1MK1, с-Мус эпитопа, активных Rho ГТФаз анализировали с помощью электрофореза и последующим иммуноблоттингом с использованием клеточных лизатов.
Для оценки влияния гиперэкспрессии Т-кадгерина на организацию микротрубочек, HUVEC ко-трансфицировали плазмидой pcDNA3.1/T-cad и плазмидой, содержащей ген зеленого флуоресцентного белка GFP для визуализации трансфицированных клеток (pcDNA3.1/GFP). Для контроля ЭК трансфицировали плазмидами pcDNA3.1 и pcDNA3.1/GFP. Для подавления экспрессии Т-кадгерина методом siRNA, ЭК ко-трансфицировали малыми интерферирующими РНК (Dharmacon, USA) (siRNA/T-cad) и плазмидой pcDNA3.1/GFP для визуализации трансфицированных клеток; в качестве контроля использовали плазмиду pcDNA3.1/GFP. Для трансфекции использовали клетки, достигшие плотности 70% монослоя. Плазмиды (по 5 мкг на 35 мм лунку культуральной планшеты) или siRNA Т-кадгерина (50 нМ и 100 нМ для оценки дозозависимого эффекта) смешивали со 100 мкл бессывороточной среды Opti-МЕМ (GIBCO, USA). Через 5 мин в раствор добавляли 20 мкл реагента Lipofectamine2000 (Invirogen, USA) для NIH3T3 и НЕК293 клеток, или CytoPure-/mv (Qbiogen, USA) для HUVEC клеток, разведенного предварительно также в 100 мкл Opti-MEM. Полученную смесь плазмид и трансфекционного реагента инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, после чего раствор плазмиды (или siRNA/T-cad) и трансфекционного реагента добавляли в среду культивирования и инкубировали в течение 4-6 ч. После этого клеткам меняли среду на полноценную среду DMEM для NIH3T3 и НЕК293 клеток, или укомплектованную среду EGM-2 для HUVEC. В зависимости от целей эксперимента, трансфицированные клетки сразу использовали в эксперименте, или клонировали. Селекцию клонов проводили через 48 ч после трансфекции. Для этого клетки снимали трипсином, и в серии последовательных разведений высевали в 96-луночные культуральные планшеты и инкубировали в среде DMEM с 10% ФБС и раствором селективного антибиотика пуромицин (в концентрации 10 мкг/мл) для селекции клонов, несущих плазмиду. После отбора клонов, клетки наращивали в 100 мм культуральных чашках Петри. 2.4 Приготовление лизатов клеток
Клетки, растущие в культуральных чашках Петри, инкубировали на льду 30 мин, затем промывали холодным ФСБ 3 раза по 5 мин, далее клетки соскребали пластиковым шпателем и центрифугировали при 2000 об/мин при +4С в течение 5 мин. Осадок растворяли в лизирующем буфере (100 мМ Tris - НС1, рН8,1, 1% Triton Х-100, 20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCb, 1 мМ СаСЬ, ингибиторы протеиназ (Pierce, USA) 1:100, PMSF 1:100; рН7,5) и инкубировали 15 мин, периодически перемешивая. Для удаления нерастворимых клеточных компонентов, полученный лизат центрифугировали 30 мин при 12000 об/мин. Концентрацию белка в полученном лизате определяли методом Бредфорда с использованием БСА в качестве стандарта (Pierce, USA).
Определение концентрации белка в лизатах клеток Определение количества белка в лизатах проводили микрометодом Бредфорда (Bradford, 1976). Лизаты белков разводили в 10000 раз, после чего на 10 мкл пробы добавляли 90 мкл реагента Бредфорда и доводили объем раствора дистиллированной водой до 1 мл, затем тщательно перемешивали. Через 15 мин проводили измерения на спектрофотометре при длине волны 595 нм. В качестве стандарта использовали коммерческий БСА (Pierce, USA) с концентрацией 0,5 - 2 мкг/мл. Концентрацию белка в пробе определяли с использованием калибровочного графика и программы Sigma Plot 8.0 (USA).
Электрофорез белков проводили в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия (SDS, sodium dodecyle sulphate) с использованием реактива Лемли (Laemmli). На дорожку геля наносили одинаковое количество белка (15-30 мкг). Анализируемый образец смешивали со стандартным буфером Лемли (0,5 mMTris-HCl рН 6,8, глицерин, SDS, р-МЕ, бромфеноловый синий) и вносили в лунку 1 мм ПААГа (полиакриламидный гель) при концентрации геля 7-10%. Для определения молекулярных масс белков использовали стандартную коммерческую смесь белков (BioRad, USA). Перенос белков из геля на PVDF мембрану (Millipore), предварительно смоченную буфером для электропереноса (Tris-Glycine, 10% SDS, 20% метанол), осуществляли методом полусухого электроблоттинга (напряжение 25V, 30 мин). После переноса белков мембрану проинкубировали в 5% растворе обезжиренного молока на ФСБ и 0,05% Tween 20 (Pierce, USA) в течение ночи при температуре +4С. Далее проводили последовательную инкубацию с первыми и вторыми антителами (конъюгированными с пероксидазой хрена) при комнатной температуре в течение 60 мин. Между первыми и вторыми антителами проводили троекратную отмывку в буфере Tween 20, содержащем обезжиренное молоко, 3 раза по 15 мин при комнатной температуре. После вторых антител мембрану троекратно отмывали от молока и Tween 20 в растворе ФСБ. Визуализацию связывания антител проводили с помощью 2-х компонентной ECL системы (Pierce, USA) с последующей экспозицией на рентгеновской пленке "Bio Max" (Kodak, USA). Анализ полученного изображения проводили с использованием программы Scion Image 4.0 (USA).
Определение концентрации внутриклеточного Са
Для измерения [Са ],„ клетки высаживали на покровные стекла, которые предварительно были покрыты поли-Ь-лизином (Sigma, USA), для улучшения клеточной адгезии. Эксперименты проводили при достижении клетками 70-80% монослоя. За сутки до начала проведения эксперимента в клетках меняли среду на бессывороточную. Измерение [Ca"+]in проводилось методом флуоресцентной микроскопии с использованием
Клетки инкубировали в этом растворе 15 61 минут в темном месте для полной деэтерификации молекул зонда (Grynkewicz et al., 1985). Затем стекло с клетками приклеивали к перфузионной камере (объём — 0,2 мл), смонтированной на столике инвертированного микроскопа (Axiovert 200 "Zeiss", Germany). Микроскоп был совмещен со спектрофлуориметром ("Spex", USA). Система для анализа изображения представлена на рисунке 5. При освещении попеременно двумя лучами света с разными длинами волн система позволяет одновременно регистрировать флуоресценцию от нескольких клеток (система анализа изображения "Имидж", Диаморф, Россия). Источником света служит ксеноновая лампа мощностью 450 Вт, работающая от стабилизированного источника питания. Экспозиция (фаза чоппера) длилась 0,5-2 сек, с интервалом (темновая фаза) в 10 сек во избежание "выгорания" зонда. Интенсивность флуоресценции регистрировали, используя соответствующий для Fura-2AM фильтр, пропускающий свет с длиной волны (эмиссия) 510 нм. Видеокамера (CoolSnapfX CCD camera, RoperSci Inc, USA) регистрировала изображение от клеток, а компьютерная программа Analy Sys позволяла получать цифровую запись эксперимента и ее обрабатывать.
Для измерения [Са +]ш клетки инкубировали 40 мин в ССЬ инкубаторе при 37С в присутствии 4 мкМ ацетоксиметильного эфира высокоаффинного зонда Fura-2AM в конечной концентрации 5 мкМ с константой диссоциации 225 нМ (Grynkewicz et al., 1985). Спектр флуоресценции этого липофильного зонда смещается в более коротковолновую область при увеличении связывания молекул зонда с Са"+ (Рис. 6). Для возбуждения флуоресценции использовали волны длиной ех= 340 и 380 нм, для эмиссии - 505 нм. В тех случаях, когда приведена шкала [Са2+];, калибровку проводили по формуле: [Са2+]; = [(R-Rmin)/(Rmax-R)] х Kd х S (Kiedrowski et al., 1994), где R - это найденное отношение интенсивностей флуоресценции зонда при 340 нм и 380 нм F340/F380 в каждой точке кривой; Kd — это константа диссоциации комплекса FURA-2AM-Ca"+, равная 225 нМ; S - отношение интенсивности флуоресценции зонда в свободном и связанном от Са виде при 380 нм (S = Fm;n (при 380 HM)/Fmax (при 380 нм)).
Рисунок 5. Схема установки для измерения [Са ],„ в клетках. 1 - Источник света (ксеноновая лампа); 2 - шторка (shutter), регулирующая время экспозиции (30-50 мсек через каждые 10 сек); 3 -колесо с фильтрами, пропускающими возбуждающий флуоресценцию свет с длинами волн Лех = 340 и Хех = 380 (excitation filter wheel); 4 - объектив (х20); 5 - объект (перфузионная камера с приклеенным стеклом с культурой клеток); 6 - днхроический луче-расщепитель (dichroic beam-splitter); 7 - колесо с фильтром для эмиссии Хет = 510 нм (emission filter wheel). 8 - видеокамера для анализа изображеііия (CCD camera); 9 - монитор ЭВМ (Chiesa et al, 2001).
Измерение минимального (Rmin) и максимального (Rmax) уровня свечения производилось путем последовательной инкубации клеток в следующих калибровочных растворах: для измерения Rmax - 130 мМ КС1, 5 мМ NaCl, 5 мМ СаСЬ, 5 мМ HEPES, 5 мМ Са2+/Н+ ионофора иономицина, для измерения Rmin - бескальциевый буфер HBSS, содержащий 5 мМ ЭГТА. Результаты обрабатывали с использованием статистических программ: Graph Pad Prism 3.00 и Statistica 6.0. Ern = 510nm
Спектр возбуждения индикатора для Са - Fura-2AM в растворе с различной концентрацией свободного Са (от О до 39,8 мкМ). При связывании с Са2 спектр смещается в более коротковолновую область. По оси абсіпісс: длина волны возбуждающего света в нм; по оси ординат: изменение интенсивности свечения в усл.ед. (fluorescence excitation). Длина волны = 360 нм — изобестическая точка, в которой свечение не зависит от концентрации Са и определяется только концентраг/ией индикатора. Эмиссия — 510 нм.
Изучение миграции клеток проводили с использованием микрокамеры Бойдена. За 24 ч до начала эксперимента клетки L929 (ТСЗ или К9), переводили на бессывороточную среду DMEM. В нижние ячейки микрокамеры Бойдена помещали раствор ЛНП в концентрации 60 мкг/мл. В качестве контролен использовали среду DMEM, содержащую ЛНП (60 мкг/мл), которые были предварительно инкубированные с антителами против Т-кадгерина (Fab, 1 мкг/мл), а также DMEM, содержащую Fab (1 мкг/мл) Для отрицательного контроля использовали бессывороточную DMEM, содержащую 1% БСА. Верхние и нижние ячейки камеры разделяли мембраной (Neuro Probe Inc., USA) с размером пор 8 мкм. Камеру помещали в СОг-инкубатор на 4 ч. Непромигрировавшие клетки счищали шпателем с верхней стороны мембраны. Промигрировавшие клетки на нижней стороне мембраны фиксировали в 96% этаноле в течение 5 мин, и окрашивали красителем DIFF-QUICK. Далее мембрану сканировали и анализировали при помощи программы Image-J (National Institute Of Health, USA). Эксперименты проводили в 5-6 параллелях и повторяли 3 раза. Данные представлены как среднее + стандартная ошибка среднего, р 0,05.
Гиперэкспрессия Т-кадгерина увеличивает содержание стресс фибрилл актина в ЭК
Наши результаты свидетельствуют о том, что гиперэкспрессия Т-кадгерина проводит к активации Racl и Cdc42 сигнальных путей, к фосфорилированию LIMK1 киназы и деполимеризации микротрубочек в HUVEC; подавление экспрессии Т-кадгерина наоборот, увеличивает полимеризацию микротрубочек в HUVEC. Известно, что активация Rho ГТФаз вызывает не только деполимеризацию микротрубочек, но также усиливает полимеризацию актина, входящего в состав стресс фибрилл (Gorovoy et al., 2005).
Для оценки влияния Т-кадгерина на состояние актинового цитоскелета мы использовали HUVEC, в которых гиперэкспрессировали Т-кадгерин методом аденовирусной транедукции, а также HUVEC, в которых экспрессию Т-кадгерина подавляли методом лентивирусной транедукции с использованием коротких олигонуклеотидов шпилечной структуры, направленных против мРНК Т-кадгерина (shRNA/T-cad). Состояние актинового цитоскелета оценивали методом иммунофлуоресцентного окрашивания на F-актин с использованием флуоресцентно меченного фаллоидина, с дальнейшим анализом с помощью конфокальной микроскопии и обработкой изображения. Кроме того, методом экстракции мы выделяли полимеризованный актин для последующего анализа методом иммуноблоттинга. На основе коммерческой системы AdEasy (USA) был создан аденовирус, позволяющий с высокой степенью эффективности гиперэкспрессировать Т-кадгерин в HUVEC (pAd-cad), а также контрольный аденовирус (pAd). Анализ гиперэкспрессии Т-кадгерина в клетках, трансдуцированных вирусом pAd-cad и контрольным вирусом pAd, проводили методом иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием антител против Т-кадгерина. Т-кадгерин F-актин наложение
Иммунофлуоресцентное окрашивание актиновых филаментов в HUVEC с использованием флуоресцентно меченного фаллоидина (красная флуоресценция). HUVEC 2 пассажа трансдуцировали аденовирусной конструкцией, гиперэкспрессирующей Т-кадгерин (pAd-cad), или контрольной (pAd). Гиперэкспрессию Т-кадгерина оценивали методом иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием антител против Т-кадгерина (зеленая флуоресценция). Масштаб - 30 мкм. Трансдукция аденовирусной конструкцией pAd-cad вызывала усиление нативной экспрессии Т-кадгерина в HUVEC (Рис. 13). В контрольных клетках (pAd) F-актин преимущественно локализуется в кортикальном слое, а при гиперэкспрессии Т-кадгерина наблюдается усиление сборки фибрилл актина, который преимущественно организован в виде стресс фибрилл (красная флуоресценция) (Рис. 13, нижняя панель) по сравнению с контрольными клетками (Рис. 13, верхняя панель). При полуколичественной оценке интенсивности флуоресценции с использованием программы Meta Morph было подтверждено, что в HUVEC, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, интенсивность флуоресценции фаллоидина достоверно выше (р 0,05), чем в контроле (Рис. 14).
Полуколичественный анализ интенсивности флуоресценции фаллоидина в HUVEC. HUVEC второго пассажа трансдуцировали аденовирусной конструкцией, гиперэкспрессирующей Т-кадгерин (pAd-cad), или контрольной (pAd), р 0,05. 3.5 Подавление экспрессии Т-кадгерина уменьшает содержание стресс фибрилл актина в ЭК
Для подавления нативной экспрессии Т-кадгерина в HUVEC использовали лентивирусную конструкцию, содержащую короткие РНК олигонуклеотиды шпилечной структуры (т.н. shRNA), направленные против мРНК Т-кадгерина. В качестве маркера трансдукции в лентивирусную плазмиду был встроен ген зеленого флуоресцентного белка copGFP. Были получены два лентивируса, способных эффективно подавлять экспрессию Т-кадгерина (shRNA/T-cad 1 и shRNA/T-cad2), а также два контрольных лентивируса, один из которых содержал только copGFP (copGFP), а другой - copGFP и shRNA люциферазы (shRNA/Luc). HUVEC copGFP shRNA/Luc shRN A/T-cad 1 shRNA/T-cad2 Рисунок 15. Анализ экспрессии Т-кадгерина в ЭК методом иммуноблоттинга. HUVEC 2 пассажа трансдуцировачи лентивирусными конструкциями, подавляющими экспрессию Т-кадгерина (shRNA/T-cadl и shRNA/T-cad2), и контрольными (copGFP и shRNA/Luc). Через 72 ч после трансдукции экспрессию Т-кадгерина определяли методом иммуноблоттинга; 130 кДа - предшественник Т-кадгерина, 105 кДа - зрелый Т-кадгерин. Данные нормировали по экспрессии a-GAPDH. Подавления экспрессии Т-кадгерина в HUVEC оценивали через 72 ч после трансдукции лентивирусными конструкциями методом иммуноблоттинга. На рисунке 15 показан анализ экспрессии Т-кадгерина методом иммуноблоттинга лизатов клеток: в HUVEC, трансдуцированных вирусами shRNA/T-cadl и shRNA/T-cad2, регистрируется эффективное подавление экспрессии Т-кадгерина (как зрелой формы с молекулярной массой 105 кДа, так и предшественника с молекулярной массой 130 кДа). Экспрессия Т-кадгерина в HUVEC, трансдуцированных контрольными лентивирусами, copGFP и shRNA/Luc, не изменялась и соответствовала экспрессии Т-кадгерина в нетрансдуцированных HUVEC. Результаты нормировали по экспрессии a-GAPDH (глицеральдегидфосфат дегидрогеназа), экспрессия которой, как и ожидалось, не изменялась.
