Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 7
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 13
1.1. Гормончувствительная аденилатциклазная сигнальная система высших
эукариот 14
Рецепторы, функционально сопряженные с аденилатциклазой 15
Гетеротримерные ГТФ-связывающие белки 16
Аденилатциклаза 18
цАМФ-зависимая протеинкиназа 21
1.2. Гормональные сигнальные системы низших эукариот 23
1.2.1. Обнаружение у низших эукариот гормонов, сходных
с таковыми высших эукариот 25
1.2.2. Рецепторы 27
Рецепторы серпантинного типа.
Рецепторы, родственные рецепторам тирозинкиназного типа высших эукариот
1.2.3. G-белки 32
а-Субъединицы G-белков
/3- и /-Субъединицы G-белков
Аденилатциклаза и гуанилатциклаза - ферменты-генераторы вторичных посредников 40
цАМФ-зависимая протеинкиназа 47 1.3. Заключение 47
ГЛАВА 2. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 52
2.1. Экспериментальные животные 52
Химические реактивы 52
Получение гомогенатов и грубых мембранных фракций клеточных культур инфузорий 53
Получение фракций плазматических мембран с использованием ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы 54
Получение фракции сарколеммальных мембран гладких мышц ноги моллюска Anodonta cygnea
Получение фракций плазматических мембран сердца куриных эмбрионов
Получение фракций сарколеммальных мембран скелетных мышц крыс
Получение фракции плазматических мембран мембран стриатума мозга крысы
2.5. Определение активности 1У^2+-зависимой аденилатциклазы 56
2.5:1. Метод с использованием /а-32Р]АТФ в качестве субстрата
2.5.2. Метод с использованием [8-3Н/АТФ в качестве субстрата
Определение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы 57
Определение связывающих мест с помощью меченого 13Н]-дигидроальпренолола 58
Определение ГТФ-связывающей активности G-белков 59
Определение ростовой активности инфузорий 60
2.10. Проведение экотоксикологических опытов с моллюсками 60
2.И. Определение белка по методу Лоури 60
Статистическая обработка полученных результатов 60
Теоретические исследования первичной структуры белков 61
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 62
Описание объектов исследования и обоснование их выбора 62
Обнаружение и функциональная характеристика активности аденилатциклазы в гомогенатах инфузорий 63
3.2. J, Dileptus anser
3.2.2, Tetrahymena pyriformis
3.2.3. Сравнительная характеристика функциональной активности
АЦ в тканях высших эукар йот
3.3. Регуляция функциональной активности аденилатциклазы
в гомогенатах клеточных культур инфузорий биогенными аминами в сравнении с таковой в тканях высших эукариот
Dileptus anser
Tetrahymena pyriformis
Сравнительное исследование чувствительности к биогенным аминам активности АЦ во фракциях плазматических мембран тканей моллюска и крысы
3.4. Идентификация и характеристика адренергических рецепторов
в клеточных культурах инфузорий, а также регуляторного влияния
биогенных аминов на ГТФ-связывающую активность G-белков
Выявление и характеристика адренергических рецепторов в клеточных культурах инфузорий
Исследование влияния антагонистов адренергических рецепторов на активность АЦ с целью функциональной характеристики адренергических рецепторов в клетках инфузорий
Регуляция серотонином и адренергическими агонистами ГТФ-связывающей активности гетеротримерных G-белков
в клетках инфузорий.
3.5. Регуляция функциональной активности АЦ инфузорий
глюкагоном в сравнении с таковой в сердце куриных эмбрионов
Dileptus anser
Tetrahymen a pyriformis
Регуляция активности АЦ во фракции плазматических мембра куриных эмбрионов глюкагоном в сравнении с таковой Tetrahymena pyriformis
3.6. Обнаружение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы
в гомогенатах инфузорий и ее регуляция гормонами в сравнении
с таковой высших эукариот 91
Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis
Высшие эукариоты
3.7. Влияние двухвалентных катионов тяжелых металлов на
функциональную активность АЦ инфузорий и моллюсков 93
Dileptus anser
Tetrahymena pyriformis
Влияние катионов тяжелых металлов на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы высших эукариот
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 102
ВЫВОДЫ 117
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
А.о. - аминокислотный остаток;
АКП - аминокислотная последовательность;
АТФ - аденозин-5'-трифосфат;
АЦ - аденилатциклаза;
АЦС - аденилатциклазная сигнальная система;
G-белок, 0-белок, Gj-белок - гетеротримерный ГТФ-связывающий белок
стимулирующего (Gs) или ингибирующего (Gj) типа;
ГДФ - гуанозин-5'-дифосфат;
Gpp(NH)p (ГИДФ) - гуанилилимидодифосфат (негидролизуемый аналог ГТФ);
ГН - гуаниновые нуклеотиды;
ГТФ - гуанозин-5'-трифосфат;
ГЦ - гуанилатциклаза;
ИФР-1 - инсулиноподобный фактор роста-1;
КТМ - катионы тяжелых металлов;
ПКА - цАМФ-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа А);
ИМ - плазматическая мембрана;
СКД - С-концсвой домен;
ТМД - трансмембранный домен;
цАМФ - циклический аденозин-3,5'-монофосфат;
ЦП - цитоплазматическая петля.
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одной из актуальных задач современной молекулярной эндокринологии является сравнительное исследование структурно-функциональной организации гормональных сигнальных систем у животных различного филогенетического уровня. Решение этой задачи позволит выявить основные закономерности эволюции эндокринных систем и механизмов их действия в филогенезе и на этой основе разработать новые подходы для регуляции функциональной активности компонентов сигнальных систем, что имеет первостепенное значение для практической медицины.
В настоящее время молекулярные механизмы функционирования гормональных сигнальных систем высших эукариот и, в первую очередь, высших позвоночных животных хорошо изучены. В то же время информация о гормональных сигнальных системах одноклеточных организмов (низших эукариот) крайне 'Скудна и противоречива. Отсутствие понимания того, каким образом функционируют сигнальные системы у низших эукариот, не позволяет проследить пути эволюции эндокринной системы на ранних этапах развития многоклеточных организмов и выявить ключевые этапы формирования гормонокомпетентности эукариотической клетки.
Одной из наиболее важных и широко распространенных сигнальных систем, опосредующих регуляторное действие различных по своей химической природе гормонов, является аденилатциклазная сигнальная система (АЦС), включающая три основных компонента, ассоциированных с плазматической мембраной клетки. Первый из них представляет собой рецептор серпантинного типа, семь раз
пронизывающий плазматическую мембрану, который специфически опознает сигнальную молекулу (гормон). Вторым, сопрягающим, компонентом является гетеротримерный ГТФ-связывающий белок (G-белок) стимулирующего или ингибирующего типа, передающий сигнал на третий, каталитический, компонент АЦС - фермент аденилатциклазу (АЦ). В свою очередь, АЦ, осуществляя синтез вторичного посредника цАМФ, регулирует, таким образом, функциональную активность эффекторного белка - фермента цАМФ-зависимой протеинкинзы (ПКА).
К настоящему времени значительный прогресс достигнут в изучении структурно-функциональной организации АЦС, а также молекулярных механизмов функционального сопряжения компонентов этой системы у высших позвоночных и. в меньшей степени, многоклеточных беспозвоночных животных. Так, показано, каким образом осуществляется функциональное сопряжение между сигнальными белками - компонентами АЦС, как регулируется функциональная активность этих белков. .Клонированы гены, кодирующие белки - компоненты АЦС, известны аминокислотные последовательности (АКП) этих белков, что позволяет выявить в их молекулах функционально активные сайты, определить пространственную структуру доменов, ответственных за их функциональную активность, создать модели белок-белковых комплексов, которые определяют процесс векторной передачи сигнала с активированного лигандом рецептора на эффекторные звенья АЦС.
Большой вклад в изучение молекулярных механизмов функционирования гормоночувствительной АЦС у позвоночных и беспозвоночных животных внесли и исследования, проводимые в лаборатории молекулярной эндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН. Эти исследования, начатые еще в конце 70-х годов и обобщенные в монографии М.Н. Перцевой (1989), направлены на сравнительное изучение АЦС животных различного филогенетического уровня и имеют своей целью выяснение путей эволюции этой системы. На основе обобщения полученных в лаборатории экспериментальных данных и сведений литературы, а также их всестороннего анализа и выявления ряда закономерностей в эволюции АЦС Перцевой М.Н. была выдвинута гипотеза о формировании гормональных сигнальных систем на самом раннем этапе развития эукариотической клетки - на уровне одноклеточных организмов (Pertseva et al., 1991). Подтверждение этой гипотезы, в значительной мере меняющей существующие представления в современной молекулярной эндокринологии и эволюционной биохимии, стало основной целью предпринятой нами работы.
Детальный анализ современного состояния проблемы структурно-функциональной организации сигнальных систем низших эукариот указывает на то, что роль АЦС в реализации регуляторного влияния гормонов и сигналов негормональной природы в клетках низших эукариот до сих пор практически не
исследована (Шпаков и др., 2003а). В то же время в последние годы в геноме ряда представителей низших эукариот обнаружены гены, кодирующие белки -компоненты АЦС. В клетках инфузории Tetrahymena pyriformis выявлены гормоны, характерные для высших эукариот, которые способны регулировать пищевое поведение инфузорий и метаболизм. Эти данные позволяют предположить наличие функционально активной АЦС у таких сравнительно примитивных организмов, как низшие эукариоты.
Цель и задачи исследования.
Цель работы состояла в обнаружении и структурно-функциональной характеристике гормоночувствительной АЦС в клетках представителей низших эукариот - инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis. Молекулярные механизмы функционирования АЦС инфузорий изучали в сравнении с таковой представителей позвоночных и беспозвоночных животных (высших эукариот), используя эволюционный подход.
Основные задачи работы состояли в следующем:
Функционально охарактеризовать АЦС инфузорий D.anser и Т.pyriformis с использованием веществ негормональной природы в сравнении с АЦС беспозвоночных (моллюск Anodonta cygnea) и позвоночных животных (крыса, куриные эмбрионы).
Исследовать чувствительность АЦС инфузорий к пептидному гормону высших эукариот глюкагону и биогенным аминам, выявить черты сходства и различия в их регуляторном действии на АЦС инфузорий и высших эукариот.
Исследовать включение рецепторов и гетеротримерных G-белков в процесс передачи гормонального сигнала через АЦС инфузорий.
Выявить активность цАМФ-зависимой протеинкиназы в клетках инфузорий и изучить ее регуляцию веществами гормональной природы.
5. В аспекте практического применения полученных данных, исследовать
чувствительность АЦС инфузорий к действию таких неблагоприятных факторов
внешней среды, как катионы тяжелых металлов, и разработать на этой основе
экотоксикологический тест.
Положения выносимые на защиту.
1. В клеточных культурах инфузорий D.anser и T.pyriformis присутствует
аденилатциклазная сигнальная система, функциональная активность которой
регулируется как агентами негормональной природы (фторид натрия, катионы
марганца, гуаниновые нуклеотиды, форсколин), так и; гормонами: биогенными
аминами и пептидным гормоном высших эукариот - глюкагоном.
Чувствительность аденилатциклазной сигнальной системы к негормональным и гормональным воздействиям зависит от уровня базальной активности аденилатциклазы в клеточных культурах инфузорий.
В мембранной фракции обеих инфузорий присутствуют, рецепторы, специфически связывающиеся с адренергическими лигандами и функционально сопряженные с гетеротримерными G-белками.
Эффекторным звеном АЦС инфузорий, также как и в случае высших эукариот. является фермент цАМФ-зависимая протеинкиназа.
АЦС инфузорий D.anser и T.pyriformis может служить тест-объектом для оценки степени загрязнения водных бассейнов катионами тяжелых металлов.
Основные результаты, научная новизна работы.
В клеточных культурах представителей одноклеточных организмов инфузорий D.anser и T.pyriformis впервые выявлена и охарактеризована АЦС. Показано, что фактором, определяющим уровень базальной активности АЦ T.pyriformis, является доля делящихся инфузорий (стадия развития культуры). Обнаружено, что АЦ инфузорий стимулируется такими активаторами фермента, как Mn2+, NaF, гуаниновые нуклеотиды (ГН), форсколин, причем величина их стимулирующего эффекта определяется уровнем базальной активности фермента.
Впервые показано, что гормоны высших эукариот 'глюкагон и серотонин (у D.anser также адреналин и изопротеренол), действующие через рецепторы серпантинного типа, способны стимулировать активность АЦ в культурах D.anser и T.pyriformis. Свое максимальное стимулирующее влияние на активность АЦ эти гормоны оказывают в концентрациях, которые наиболее эффективны в тканях высших эукариот. Выявлено также ингибирование адреналином АЦС T.pyriformis.
Величина и направленность гормонального эффекта определяются уровнем базальной активности АЦ: чем она выше, тем менее" выражена гормональная стимуляция и тем в большей степени проявляется ингибирующее влияние гормонов. Действие гормонов частично или полностью снимается антагонистами серотониновых и Р-адренергических рецепторов (р-АР). В клетках инфузорий впервые охарактеризованы рецепторы, специфично связывающие р-АР лиганды и сходные по ряду своих показателей с Р-АР высших эукариот. Показано, что биогенные амины стимулируют ГТФ-связывающую активность G-белков, что указывает на их участие в процессе передачи гормонального сигнала. В клеточных культурах D.anser и T.pyriformis впервые обнаружена активность ПКА и исследована ее регуляция гормонами. Действие гормонов на активность ПКА и АЦ было однонаправленным, что указывает на функциональную связь между этими ферментами подобно тому, как это наблюдается у высших эукариот. Таким образом, доказано, что в клетках инфузорий присутствует функционально активная гормоночувствительная АЦС, обладающая чертами сходства с таковой высших эукариот.
Показано, что катионы тяжелых металлов (КТМ) нарушают функционирование АЦС инфузорий в условиях in vitro и снижают их выживаемость в условиях in vivo. г3ти данные указывает на возможность использования АЦС D.anser и T.pyriformis в качестве высокочувствительного экотоксикологического тест-объекта для оценки состояния водных бассейнов.
Теоретическое и практическое значение работы.
Обнаружение гормональной регуляции АЦС инфузорий, как представителей низших эукариот, является очень важным для понимания эволюции гормоночувствительных сигнальных систем эукариот в целом и формирования молекулярных механизмов функционирования цАМФ-зависимых сигнальных путей в частности. Полученные данные дают материал для дальнейших исследований регуляторной роли гормонов высших эукариот как у инфузорий, так и у других представителей ешзших эукариот (дрожжевых грибов, трипаносом и др.). Разработанная стратегия изучения АЦС инфузорий может быть использована для
исследования регуляции гормональными и негормональными агентами жизненно важных функций паразитических форм одноклеточных, возбудителей многих заболеваний человека. Изучение чувствительности АЦС инфузорий к воздействию КІМ позволяет разработать новый экотоксикологический тест для мониторинга водных экосистем. В перспективе этот тест можно использовать для тестирования и других вредных химических веществ.
Апробация работы.
Обсуждение работы проходило на заседании секции молекулярных основ эволюции функций ИЭФиБ им.И.М.Сеченова РАН. Результаты работы были доложены на SEB Annual Meeting, Lancaster, England (1996), 22th Conference of European comparative endocrinologists, Bonn, Germany (2002), FEBS Meeting on Signal transduction, Brussels, Belgium (2003), XI Всероссийском симпозиуме «Мембранный транспорт и функции клетки» (1994), Конференции молодых физиологов и биохимиков России «Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций» (1995), Международной конференции «Инфузории в биотестировании» (1997) и на научных семинарах Лаборатории молекулярной эндокринологии ИЭФБ им. И.М. Сеченова РАН.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа, в том числе 11 статей в рецензируемых журналах.
Объем, структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, результатов исследования и их обсуждения, выводов. Работа изложена на 133 страницах, включает 19 рисунков и 9 таблиц, список литературы составляет 167 источников.
