Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОСОМАЛЬНОЙ ГИДРОКСИЛИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ (Обзор литературы)
I. Распространенность системы и ее функции 9
2. Состав гидроксилирующей системы микросом печени и множественность форм цитохрома Р-450 15
3. Механизм действия гидроксилирующей системы микросом печени . 26
Постановка задачи 36
ГЛАВА II. МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТА
I. Исходные вещества 38
2. Методы выделения микросом, цитохромов Р-450 ЛМо, Р-450 ЛМ^, В^ и НАДШ-цитохром Р-450 редуктазы
1. Вьщеление микросом 40
2. Вьщеление и очистка цитохрома Р-450 ЛМг> из микросом печени кроликов получавших фенобарбитал натрия 41
3. Вьщеление и очистка цитохрома Р-450 ЛМд из микросом печени кроликов, получавших метилхолантрен 43
4. Вьщеление и очистка НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы . 45
5. Вьщеление цитохрома В^ 46
3. Иммунохимические методы .51
4, Вьщеление фосфолипидов и получение липосом и
протеолипосом . 56
5. Электрофоретические методы 57
6. Кинетические методы 58
7. Ингибиторный анализ 59
8. Методы анализа
I. Химические методы 60
2. Спектральные методы 61
9. Методы характеристики реакций 62
ГЛАВА III. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГИДРОКСИЛИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ.
I. Характер взаимодействия НАДФН-цитохром Р-450 редук-тазы и цитохрома Р-450 ЛМо.
1. Встраивание цитохрома Р-450 JMg в микросомальные мембраны .63
2. Иммунохимическое изучение каталитической активности цитохрома Р-450 Жг> 70
3. Реконструкция микросомальной гидроксилирующей системы, содержащей цитохром Р-450 ЛМ^ 80
2. Каталитические свойства системы, включающей цитохром Р-450 ЛМ4
1. Встраивание цитохрома Р-450 ЛМ^ в микросомальные мембраны 84
2. Иммунохимическое изучение каталитической активности цитохрома Р-450 ЛМ4 92
3. Сравнение каталитической активности цитохромов Р-450 ЛМ и Р-450 ЛМд в реконструированных системах 97
ГЛАВА ІV. РОЛЬ ЦИТОХРОМ В5 В ОКИСЛЕНИИ АНИЛИНА И ДИ МЕТИЛАНИЛИНА ШКРОСОМАМИ И РЕКОНСТРУИРОВАННШМ МИКРОСОМАЛЬ- НЫМИ СИСТЕМАМИ 102
ГЛАВА V. РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ОКИСЛЕНИИ ДИМЕТИЛАНИЛИНА И АНИЛИНА.
I. Суперокисный анион 0 как возможный активный агент при окислении диметиланилина цитохромом Р-450 117
I. Ингибирующее действие соединений меди на окислительное деметилирование диметиланилина микросомами печени . 121
4-2. Ингибирующее действие соединений меди при окислении диметиланилина гидроперекисью кумила с участием цитохрома Р-450 123
2. Вклад радикальных реакций в окисление диметиланилина и анилина с участием цитохрома Р-450 134
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 152
ВЫВОДЫ 157
ЛИТЕРАТУРА 159
- Распространенность системы и ее функции
- Методы выделения микросом, цитохромов Р-450 ЛМо, Р-450 ЛМ^, В^ и НАДШ-цитохром Р-450 редуктазы
- Характер взаимодействия НАДФН-цитохром Р-450 редук-тазы и цитохрома Р-450 ЛМо.
- РОЛЬ ЦИТОХРОМ В5 В ОКИСЛЕНИИ АНИЛИНА И ДИ МЕТИЛАНИЛИНА ШКРОСОМАМИ И РЕКОНСТРУИРОВАННШМ МИКРОСОМАЛЬ- НЫМИ СИСТЕМАМИ
- Суперокисный анион 0 как возможный активный агент при окислении диметиланилина цитохромом Р-450
Введение к работе
В организмы человека и животных постоянно поступают чужерод-тае вещества окружающей среды. К их числу относятся лекарственные зредетва, пестициды, канцерогены, пищевые и косметические добавки ї т.д. Метаболизм всех этих соединений является важнейшим звеном химической защиты организма. Превращения ксенобиотиков направлены m увеличение полярности молекул, уменьшение их растворимости в ли гадах и скорейшее выведение из организма. Ключевую роль в метабо-шзме инародных соединений и эндогенных субстратов играет микросо іальная мультиферментная гидроксилирутощая система печени, содержа \ая в качестве терминальной оксидазы цитохром Р-450. Для успешной юрьбы с отравлениями этими веществами необходимо знание молекуляр [ых механизмов окисления ксенобиотиков в организме. Перед современ [ой фармакологией и эндокринологией стоит проблема регуляции мета іолизма стероидных гормонов, в котором также принимает участие ци юхром Р-450. Кроме того, исследование цитохром Р-450-зависимых їистєм необходимо для разработки общей теории монооксигеназного :атализа.
Широкое распространение гидроксилирующей ферментной системы [ большой круг реакций, катализируемых ею, обусловили повышенный інтерес к ней ученых разных специальностей. Цитохром Р-450, как (читают специалисты, является в настоящее время одним из наиболее ;зучаемых ферментов. Его исследования интенсивно ведутся в ряде ла і ораторий США, Швеции, Японии, ФЕТ, ГДР и других странах. В СССР 'силия научных учреждений, изучающих механизм действия гидроксили іующих систем, объеденены Всесоюзной исследовательской программой Цитохром Р-450" и "Гидроксилаза".
Прошло более 20 лет со времени открытия цитохрома Р-450, но :есмотря на большие достижения в изучении свойств компонентов и ме- ханизма действия микросомалъной гидроксилирующей системы, остается нерешенным ряд важных вопросов. Во-первых, не выяснена структурная организация мулътиферментной гидроксилирующей системы макросом Литературные данные свидетельствуют о двух возможностях ее организации: с одной стороны, предполагается существование жестко-органи зованных "кластеров", состоящих из НАДШ цитохром P-45G редуктазы, дитохрома Р-450 и фосфолипидов; с другой стороны, возможна латераль іая подвижность компонентов мулътиферментной системы микросомалъно ?о гидроксилирования в мембране. Экспериментальные данные, получен ше нами, доказывают, что цитохромы Р-450 JDVU и Bg обладают высо-сой латеральной подвижностью в микросомах печени. Во-вторых, цито-сром Р-450 существует в виде разных форм с различной субстратной шецифичностыо. Нами впервые показана инертность цитохрома Р-450 Ш^ при окислении диметиланилина и анилина в отличие от цитохрома 3-450 JEMg, окисляющего оба субстрата с высокими скоростями. С при-іенением биоспецифического ингибиторного анализа антителами к цито :рому Р-450 Ш&о нами показано, что эта форма гемопротеида на Ю% )пределяет окисление диметиланилина и анилина микросомами печени :ролика. В-третьих, остается открытым вопрос об участии цитохрома ig в восстановлении цитохрома Р-450 вторым электроном. Наши данные называют на сложный характер влияния цитохрома Bg в процессах жисления. Роль цитохрома Bg определяется несколькими факторами: риродой цитохрома Bg и окисляемого субстрата, а также природой ци 'охрома Р-450. В-четвертых, не установлена природа гидроксилируто-іих агентов. Нами доказана неспособность суперокисного аниона окис сить диметиланилин. Показано, что деметилирование диметиланилина дет радикальным путем при его окислении микросомами, реконструиро ;анными системами и очищенным цитохромом Р-450 ЛТ^ и гидроперекисью умила.
Полученные результаты шлеют практическое значение. Работа выполнена в рамках Всесоюзных исследовательских программ "Цитохром Р-450" и 'Тидрокоилаза" и плановой темы, утвержденной Государствен им комитетом СССР по науке и технике (J Госрегистрации 81003788). 3 ней даны рекомендации по тестированию реакционной способности лекарственных соединений, содержащих третичный азот простыми системами, содержащими цитохром Р-450 или другой гемопротеид в сочета ши с гидроперекисями. Материалы диссертации использованы в монографиях Д.И. Метелицы "Активация кислорода ферментными системами", L: Наука, 1982, 256 с. и "Моделирование окислительно-восстановитель іьіх ферментов", Минск: Наука и техника, 1984, 293 с.
Основные положения, выносимые на защиту:
Организация мультиферментной гидроксилирующей системы мик-росом печени.
Субстратная специфичность форм цитохрома Р-450 Ж> и Р-450 Ш^ микросом печени кроликов.
Выяснение роли цитохрома Bg в окислении анилина и диметил-інилина в разных системах, содержащих цитохром Р-450.
Изучение возможного участия суперокисного аниона и кислород юдержащих радикалов в окислении диметиланилина и анилина в разных іистемах, включающих цитохром Р-450 и другие компоненты монооксиге сазного комплекса.
Распространенность системы и ее функции
Эндоплазматический ретикулум печени (ЭР) является органеллой всех эукариотических клеток и представляет собой мембранную систему сообщающихся каналов, вакуолей, цистерн. ЭР переходит в клеточные и ядерные мембраны, тесно связан с аппаратом Гольджи и митохондриями. Такая взаимосвязь способствует объединению клеточных органелл в единое целое [Ї] .
Использование методов дифференциального центрифугирования го-могенатов клеток позволило получить фракцию субклеточных частиц — микросом, содержащую мембраны ЭР, что сделало возможным изучение его молекулярной организации и химического состава. Исследование состава клеток печени показало, что микросомы содержат 20% белка, 40-50% РНК, 34-47% фосфолипидов и холестерина от сухого веса всей печеночной клетки [2]. Белки и липиды являются основными стркутур-ными компонентами мембран ЭР. 85% липидного состава микросом составляют фосфолипиды, из которых на долю фосфатидилхолина приходится 50-60%, фосфатидилэтаноламина — 20% и фосфатидилинозитола — 10% Фосфолипиды играют важную роль в липид-белковом и белок-белковом взаимодействиях, а значит и в молекулярной организации мембран ЭР. [3,4] .
Белковый компонент мембран ЭР представлен в основном ферментами, среди которых оксидоредуктазы, трансферазы и гидролазы. Общее число белков в микросомах печени достигает 98 [5-7J. В микро-сомальной фракции локализована гидроксилирующая ферментная система монооксигеназного типа, использующая в качестве доноров электронов НАДВД или НАДН. Эта система ускоряет множество реакций, характеризуемых стехиометрией [З-б] : AH + 02 + НАДФН + H+ — - A-OH + H0 + НАДФ+, где АН - окисляемый субстрат, а А-ОН - продукт реакции. Как видно, один из атомов кислорода внедряется в субстрат, а второй — восстанавливается до воды, т.е. монооксигеназы выполняют одновременно две функции — оксигеназную и оксидазную. На этом основании монооксигеназы иногда называют оксидазами со смешанной функцией [3,5] .
Микросомальная гидроксилирующая система печени представляет собой мультиферментный комплекс, в состав которого входят цитохром Р-450 (КФ. І.І4.І4.І.), НАДФН-цитохром Р-450 редуктаза (КФ. 1.6.2. 4.) и фосфолипиды, и требует для своего функционирования присутствия НАДФН и 0g [5,8] . У человека и млекопитающих эта система выпол няет важнейшие функции, связанные с биотрансформацией стероидов, простагландинов, лекарств, канцерогенов, анестетиков и многих других ксенобиотиков [3,5,6,9] .
Сходные гидроксилирующие системы широко распространены во мно гих органах и тканях животных и в растительном мире. Они обнаружены в микросомах легких [і0-12], коры надпочечников [13,14], плацен ты [іб] , тонкого кишечника [іб] , мозга [l7], почек [18] млекопитающих. Иммунохимический анализ показал, что гемопротеиды из микросом легких, почек, яичек, селезенки, сердца, тонкого и толстого кишечника желудка и мозга иммунохимически сходны с основными формами ци тохрома Р-450 из микросом печени [19]. Гидроксилирующая активность микросом найдена в органах холоднокровных. В частности, у рыб и на секомых обнаружены НАДФН- и НАДН-специфические редокс-цепи, содержащие цитохром Р-450 в качестве терминальной оксигеназы. Р-450, выделенный из микросом печени рыб и некоторых видов насекомых, схо ден по своим физико-химическим свойствам с гемопротеидом печени млекопитающих [20-21] .
Методы выделения микросом, цитохромов Р-450 ЛМо, Р-450 ЛМ^, В^ и НАДШ-цитохром Р-450 редуктазы
Микросомальную фракцию получали по общепринятой методике [I35J Микросомы получали из печени беспородных белых крыс-самцов весом 120-200 граммов или кроликов породы Шиншилла весом 2,5-3,0 кг. Жи-вотных забивали декапитацией. Извлеченную печень помещали в охлажденный 1,15% раствор KCI,измельчали и отмывали от крови. Перед гомогенизацией печень продавливали через пресс. Гомогенизацию проводили в 5 объемах 1,15% раствора KCI в течение 1,5 мин в гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком. Полученный 20% гомогенат центрифугировали 20 мин при 20000g в центрифуге VAC-60I (ГДР). Осадок отбрасывали, а супернатант центрифугировали при 105000 g в течение 60 мин. Для полного удаления гемоглобина и белков цитоплазмы осадок микросом суспендировали в 1,15% растворе KCI и вторично центрифугировали 60 мин в том же режиме. Микросомы хранили при -20С и использовали в течение двух недель, при этом никаких изменений в ферментативной активности препарата не отмечалось.
В качестве индукторов микросомальной гидроксилирующей системы использовали фенобарбитал натрия и 3-метилхолантрен. Индукторы вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг веса животных в сутки для ФБ и 20 мг/кг для 3-МХ. Раствор 3-МХ готовили в оливковом масле и вводили в течение 3 суток, а водный раствор ФБ вводили 5 суток. Перед употреблением микросомы оттаивали и суспендировали в трис-HCI буфере, рН 7,4. Микросомы, используемые для выделения белков, суспендировали в калийфосфатном буфере, рН 7,25, содержащем 20% глицерина.
Выделение и очистка цитохрома Р-450 ЛМг, из микросом печени кроликов, получавших фенобарбитал натрия.
Цитохром Р-450 ЛМо получали по ранее предложенной методике [іЗб] . Микросомы (2-3 г белка) суспендировали в 1000 мл 0,1 М фосфатного буфера, содержащего 0,001 М дитиотреитола, 0,001 М ЭДТА, 0,6% холата натрия и 20% глицерина. После 30 мин солюбилизации сус пензию центрифугировали при 105000 g І час. Супернатант наносили на колонку с оО-аминогексил-сефарозой 4В (4 х 35 см), уравновешенную 3 объемами того же буфера. Адсорбированные на сефарозе белки промывали 3 объемами уравновешивающего буфера, содержащего 0,5% холата натрия. Цитохром Р-450 элюировали 1500 мл исходного буфера, содержащего 0,4% холата натрия и 0,08% тритона Х-100. Фракцию ге-мопротеида с удельным содержанием 10-12 нмоль/мг белка собирали и разводили в 3 раза 20% глицерином. Разведенный белок наносили на колонку (3 х 15 см) с гранулированным гидроксиапатитом, приготовленным по методике [l37j.
Характер взаимодействия НАДФН-цитохром Р-450 редук-тазы и цитохрома Р-450 ЛМо.
Встраивание Р-450 Ж2 в микросомальные мембраны.
Кинетический анализ процессов окисления микросомальными мембранами, обогащенными высокоочищенным Р-450 Ж2, является простым экспериментальным приемом, позволяющим исследовать структурную ор ганизацию монооксигеназ. Предполагается, что формы Р-450, входящие в "кластер", восстанавливаются редуктазой быстрее, чем ветра -64-иваемый цитохром Р-450. Экзогенный Р-450 не имеет возможности вой ти в "кластер", так как в "кластерах" микросомальной мембраны уже существует оптимальная пропорция между редуктазой и Р-450. Если в мембране нет "кластеров", то экзогенный и эндогенный Р-450 будут восстанавливаться редуктазой с близкими скоростями.
Поэтому нами изучена каталитическая активность микросом, обогащенных высокоочищенным Р-450 ЛМр в окислении субстрата перво го типа - ДМА и субстрата второго типа — анилина. В первую очередь, дана количественная характеристика обогащения микросом чистой формой Р-450 ЛМг . Оптимальные условия включения Р-450 ЛМр определяли по каталитической активности гемопротеида. В окислении ДМА максимальная каталитическая активность достигалась при концен трации Р-450 ЛМр, в 2 раза превышающей содержание цитохрома Р-450 в микросомах. Скорости окисления анилина максимальны при соотноше нии встроенного Р-450 Mg и микросомального цитохрома Р-450 ЛМо, равном 1:1. Оптимальное время обогащения микросом Р-450 ЛМ составляло 20 мин при 30РС.
Изучение зависимости скорости окисления ДМА и анилина от начальных концентраций субстратов с участием контрольных и обогащен ных Р-450 ЛМо микросом при 8 и ЗбС. Во всех случаях полученные зависимости описаны уравнением Михаэлиса-Ментен и трансформированы по методу Лайнуивера-Берка (рис. 12-14). Важно отметить, что при ЗбС процесс окисления ДМА обогащенными микросомами характеризуется двумя значениями максимальных скоростей (рис. 14).
Роль цитохром в5 в окислении анилина и диметиланилина шкросомами и реконструированншм микросомальными системами
В обзоре литературы отмечено, что первый электрон поступает к фермент-субстратному комплексу из НАДШ-специфичной цепи транспорта электронов, в то время как второй электрон передается тройному комплексу "субстрат - Р-450 - О2" из НАДН-специфичной це пи транспорта электронов. Только после восстановления молекулы Og двумя электронами один атом кислорода внедряется в субстрат, а второй восстанавливается до воды. Участие НАДН-зависимой цепи переноса электронов в микросомальном окислении предполагает важную роль компонента этой цепи — цитохрома В — в процессах гидрокси-лирования. Роль этого гемопротеида изучали в процессах гидрокси-лирования микросомами [96,174,177,179,180] и реконструированными системами [60,94,113,164,175,176,181-186] . Сведения о влиянии цитохрома В на окисление различных субстратов противоречивы: цито-хром Вс существенно ускоряет окисление в микросомах и реконструированных системах бенз [а]пирена [175,180,184] , нафталина [l74] , ацетанилида [184], 4-ипомеанола [179] , окислительное N -деметили-рование бензфетамина [l8l] и ДМА [l8l] , О-деалкилирование 7-эток-сикумарина [lI3,I64,I80] и пара-нитроанизола [бо] , а также селекти вное гидроксилирование ІТ-метилкарбазола [і7б] . С другой стороны, цитохром Bf- не влияет на окисление анилина микросомами печени мышей [l80] и не является обязательным компонентом при окислении в реконструированной системе бензфетамина, циклогексана, лаурата, хлорбензола, ДМА и анилина [9,18б] . Наконец, экзогенный цитохром Вс, встроенный в микросомы ингибирует Ж -деметилирование аминопи-рина [187], а цитохром Bg в некоторых реконструированных системах заметно замедляет окисление бензфетамина при участии трех форм цитс хрома Р-450 - ЛМ2, ЛМ3в, ЛМ4 из микросом печени кроликов [l84]. Причины столь противоречивых данных о влиянии цитохрома Bg на окисление различных субстратов окончательно не выяснены.
Целью нашей работы было систематическое кинетическое изучение влияния цитохрома Bg на окисление микросомами печени кроликов и реконструированными микросомальными системами ДМА и анилина, пер вый из которых принадлежит к числу субстратов I типа, а второй — к немногочисленной группе субстратов II типа. Мы встраивали цито хром Вк в микросомальные мембраны, обогащая их этим гемопротеидом и в реконструированные системы, содержащие цитохром Р-450 ЛМ. НАДШ-Р-450 редуктазу и суммарные фосфолипиды микросом печени, а затем изучали влияние возрастающего содержания цитохрома Bg в обе их системах на скорости окисления ДМА и анилина.
Из рис. 29 следует, что цитохром Bg эффективно встраивается в ФБ-микросомы и восстанавливается в них различными восстановите лями — дитионитом натрия, НАДН, НАДФН. При больших концентрациях цитохрома BR в микросомах становится заметным уменьшение каталитической активности НАДЩ-Р-450 редуктазы, что связано с ее учас тием в восстановлении встроенного цитохрома Bg.
Окисление анилина при различных концентрациях субстрата и НАДФН микросомами, обогащенными цитохромом Bg, характеризуется небольшим снижением скорости реакции (рис. 30, 31 и таблица 8), т.е. цитохром Bg, внесенный в мембрану, замедляет окисление субстрата второго типа. Введение в систему второго кофактора — НАДН — совершенно не влияет на скорость окисления анилина микросомами обогащенными цитохромом Bg, и даже несколько снижает скорость ре акции в случае контрольных микросом (рис. 32).
Суперокисный анион 0 как возможный активный агент при окислении диметиланилина цитохромом Р-450
В механизме действия микросомальной гидроксилирующей системы не выяснена природа гидроксилирующего агента. В качестве гидрок-силирующих частиц могут выступать активные формы кислорода, восстановленного одним или несколькими электронами. В полной микросомальной системе в присутствии НАДФН и 0 возможно образование нескольких таких форм: суперокисного аниона Оо, радикалов НОД и НО" и оксеноида FeO . В шунтированной системе, состоящей из Р-450 и органической гидроперекиси, образуются радикалы Ш и ROo и возможно образование оксеноида FeO .
Для выяснения роли перечисленных активных форм кислорода в окислении ДМА и анилина цитохромом Р-450 мы применяли ингибитор-ный анализ. Для выяснения возможного участия суперокисного аниона в окислении ДМА использовали комплексы двухвалентной меди с лизином и тирозином, обладающие дисмутазной активностью. Соединения меди дисмутируют суперокисные анионы и выводят из сферы реакции окисления одну из возможных форм активированного кислорода — 0р, замедляя скорость процессов гидроксилирования. Для изучения вклада радикальных реакций в окисление ДМА и анилина использовали известные антиоксиданты — маннитол и 1-нафтол.
