Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Гистидиндекарбоксилаза и катализа (обзор литературы) 12-51
1.1. Гистидиндекарбоксилаза 12
Гистидин и гистамин 12
Кофакторы и субстратная специфичность гистидиндекарбоксилази 15
Выделение и очистка гиотидиндекарбоксидаз 16
Структура и свойства гиотидиндекарбоксидаз 22
Каталаза 33
Выделение и очистка каталазы 37
Структура и свойства каталаз 40
Глава II. Методы исследования 52-68
П.І. Микробиологический материал 52
П І.І. Условия выращивания 52
П.2. Определение активности гистидиндекарбоксидазы .52
П.2.1. Измерение активности гистидиндекарбоксилазы манометрическим методом 53
П.2.2. Измерение активности гистидиндекарбоксилазы после высоковольтного электрофореза
ІІ.2.3. Определение активности гистидиндекар.б оксида зыпосле электрофореза в полиакриламидном геле .54
П.З. Определение активности каталазы 56
П.3.1. Спектрофотометрическое определение каталазной активности 56
П.3.2. Манометрическое определение активности каталазы .57
П.3.3. Визуализация зон, обладающих активностью каталазы после электрофореза в полиакриламидном геле 57
П.4. Определение активности гиотидин аммиак-лиазы 57
П.5. Определение активности гистаминазы 58
П.6. Выделение гистидиндекарбоксилазы (схема I) 58
П.6.1. Анализ чистоты препаратов гистидиндекарбоксилазы .60
П.7. Электрофорез нативных белков в полиакрилами дномгеле 60
П.8. Электрофорез в поякакриламидном геле диссоциированных препаратов белков 62
П.9. Гель-фильтрация 63
П. 10. Анализ аминокислотного состава .63
П.П. Определение N-концевой последовательности аминокислот 65
П.12. Спектрофотометрирование белковых растворов 68
Глава III. Результаты исследований .69-119
П.І. Влияние условий выращивания на активность гистидиндекарбоксилазы и каталазы 69
П.І.Х. Множественные формы ферментов каталазы и гистидиндекарбоксилазы .74
П.І.2. Выделение гистидиндекарбоксилазы и каталазы,
фиксированных на клеточной матрице 75
П.І.З. Свойства гистидиндекарбоксилазы и каталазы, фиксированных на клеточной матрице ." 78
П.2. Испытание модификаций схемы выделения и очистки водорастворимой гистидиндекарбоксилазы 79
П.З. Выделение каталаз 82
П.З.І. Физико-химическая характеристика каталаз 90
П.4. Протеолитическая устойчивость каталаз и гистидиндекарбоксилазы 108
П.5. Терглостабильность гистидиндекарбоксилазы и каталазы.112
П.6. Инактивация гистидиндекарбоксилазы субстратом каталазы; действие гистидина и гистамина на каталазу ИЗ
Глава IV. Обсуждение результатов 120
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 140
ВЫВОДЫ 142
- Гистидиндекарбоксилаза
- Микробиологический материал
- Влияние условий выращивания на активность гистидиндекарбоксилазы и каталазы
- Обсуждение результатов
Гистидиндекарбоксилаза
Гистидиндекарбоксияаза Гистидкндекарбоксилаза ( L-гистидин-карбоксилиаза, КФ 4,1.1.22.) осуществляет ферментативное расщепление L-гис-тидина с образованием биогенного амина гистамина и углекислого газа. Вследствие того, что гиотамин обладает высокой и разносторонней биологической активностью, ферментативное де-карбоксилирование гиотидина играет важную роль в жизнедеятельности различных организмов. Эти факты, в свою очередь, обуславливают интенсивное, комплексное изучение функций гистамина как в эксперименте, так и в клинике. І.І.Х. Гистидин и гистамин Гистидин, А-4(5)-имидазолил-с -аминопропионовая кислота, является единственной аминокислотой, содержащей имидазольное кольцо, константа ионизации которого (рК) лежит в области "физиологических значений". Эти особенности гисти-Дина обуславливают ряд его уникальных свойств: комплексооб-Разование с металлами, поливалентными катионами и электро-фидышш агентами; способность легко образовывать водородные связи и входить в состав активных центров многих ферментов - химотрипсина, рибонуклеази, трипсина и других /92,93, 124,172/. У млекопитающих гистидин является незаменимой аминокислотой. Нарушение метаболизма гистидина у человека выражается в форме гистидинемии. При этом отмечаетсязначительное, и, как правияо, необратимое отставание умственного развития, в особенности - речевые недостатки /85,125, 218,236/. Разъяснение роли гистидинового метаболизма в развитии речи может быть значительным шагом в понимании химии мозга. Гистидин является прямым предшественником, из которого образуется гистамин в результате ферментативного декарбо-ксилирозания.
Микробиологический материал
В основное пространство сосудика аппарата Варбурга (В. Braun Melsungen , ФРГ) /24/ ВНОСИЛИ 2,4 мл ОД М К-фосфатно-го буфера рН 5,5 и ОД мл исследуемого материала. В пространстве бокового отростка находилось 0,5 мл 65 мМ раствора гистиди-на на том е буфере.
После термос та тирования (в результате преинкубации 10 мин при 37) смешивали содержимое бокового отростка и основного пространства и отмечали по манометру количество мкл СО , выделившееся в ходе 10 мин реакции декарбоксилирования. Активность фермента выражали в международных единицах - каталах (кат), учитывая, что в ходе ферментативной реакции из одной молекулы гистидина образуется I молекула 00 и I молекула гистамина. I катал соответствует скорости реакции I моль-сек /10/. Удельную активность выражали в кат/мг белка. Концентрацию белка определяли по методу Лоури /164/.
Влияние условий выращивания на активность гистидиндекарбоксилазы и каталазы
Предпринятое нами определение изменений активностей ферментов в зависимости от трех-типов питательной среды - составы А, Б и Г (табл.7, 8, 9) было проведено при трех различных уровнях кислородной обеспеченности клеток: строгий анаэробиоз, аэробные условия и интенсивная аэрация. В случае анаэробных условий, питательную среду после стерилизации автоклавированием сохраняли под слоем вазелинового масла. Внесение посевного материала и выращивание проводили также под слоем масла. В случае аэробных условий масла не применяли, культуру выращивали при слабом перемешивании без вспенивания. Аэрация icy ль туры достигалась подачей стерильного воздуха с расходом 25-30 мл в I мин на I л культуры.
Определение активностей ферментов в образцах микробиологического материала, выращенного на питательных средах всех .типов, показало, что имеется четко выраженная зависимость активностей изучаемых ферментов от уровня кислородной обеспеченности питательной среды. Клетки обладали наивысшей гистидинде-карбоксилазной активностью, если выращивание проходило с минимальным кислородным обеспечением питательной среды. В силу того, что максимальная величина гистидиндекарбоксилазной активности в клетках, выращенных анаэробно, практически не зави-сила от типов питательных сред, эта величина была условно принята за ЮО -ное содержание активности ГДК в клетках. Аналогичным образом, наивысшее содержание каталазной активности в клетках, выращенных в ."условиях аэрации, условно принимали за 100$ .
Обсуждение результатов
Клетки исследуемого микроорганизма являются факультативными аэробами и способны размножаться и существовать как в (анаэробных условиях, так и в присутствии кислорода. Сравнительный анализ величин гистидиндекарбоксилазной и каталазно.й ак тивностей клеток в процессе выращиваний при различных уровнях обеспеченности кислородом питательной среды позволил обпару . жить выраженную индукцию каталазы при культивировании в условных аэрации. Каталазная активность клеток, выращенных при аэра ( ции, увеличена более чем на 2 порядка (в І05-ІГ0 раз) по сраз нению с активностью клеток, существующих в условиях анаэробиоза.
Вышеотмеченная эффективная индукция фермента позволила нам впоследствии поставить и решить задачу препаративного зы-деления и структурно-функционального исследования каталаз из Micrococcus єр, п. , наряду с разносторонней характеристикой взаимосвязи ГДК и каталазы. В частности, установлено, что при выращивании на всех типах питательной среды (на фоне индукции гистидином), отмечается обратная корреляция активностей ГДК и каталэзи и наибольший биосинтез ГДК наблюдается в условиях строгого анаэробиоза (рис.:?7). Промежуточные по уровню обеспеченности Kvic.iopor.o.v. условия - аэробные, являются также прс.ме-:куточными и по уровню активности ферментов.
Выбор условий выращивания имеет принципиальное значение, как показано, для индукции того или иного фермента и во многом обуславливает специфику всех последующих стадий выделения, по-Ькольку может приводить к получению водорастворимого или не-/экстрагируемого фермента. С целью получения препаративных количеств ГДК и ката лазы, по-видимому, наиболее целесообразно использовать питательную среду состава Г (таблица 3)t не имею-;щую в числе компонентов мясного бульона, что позволяет сделать ; процесс выращивания более экономичным, хотя и приводит, в сред-, нем, к 10$-ному уменьшению выхода биомассы.
