Введение к работе
Актуальность темы. Контроль состояния природной среды и качества продукции - наиболее важные направления биотехнологии. В настоящее время в научной и производственной практике, наряду с аналитическими методами, широко применяются экспрессные методы биотестирования с использованием живых организмов для мониторинга состояния окружающей среды, определения токсичности пищевых продуктов, кормов и сырья животного происхождения, что, в конечном счете, способствует формированию экологически доброкачественной среды обитания человека и животных. Существуют различные методы определения качества окружающей среды с помощью биотестовых систем (Мелехова, 2007), однако их широкое применение в практике медико-биологических исследований сдерживается из-за отсутствия научно-обоснованных критериев для использования тех или иных биологических объектов в реакциях биотестирования. В существующей практике использование микроорганизмов в качестве тест-объектов носит преимущественно рекомендательный характер, так как отсутствуют критерии комплексной оценки чувствительности микроорганизмов к определенным экотоксикантам (в частности, к солям тяжелых металлов и гербицидам), не определены точные механизмы их токсического действия на организмы на клеточном и молекулярном уровнях, не разработаны технологические режимы выращивания многих тестовых микроорганизмов, как объектов длительного культивирования, нет научной основы, доказывающей правомочность использования одноклеточных микроорганизмов в качестве тестовых объектов для предварительной оценки безопасности и эффективности лекарственных и биологически активных веществ (БАВ).
Разработке тестовых объектов уделяется огромное внимание во всем мире. Наибольшее распространение в качестве тест-объектов получили организмы, способные реагировать на загрязнение водной среды. К таким организмам относятся гидробионты различных таксономических групп, от позвоночных до прокариот, среди которых наиболее перспективными считаются одноклеточные микроорганизмы (Виноходов, 2007). Значительно меньше внимания уделяется поиску новых тестовых объектов для нужд пищевой и медицинской биотехнологии (Шульгин, 2006). Связано это с широким использованием в научно-исследовательской практике культур клеток позвоночных, которые, по сути, выполняют функции тест-объектов, позволяя исследователям значительно ускорить процедуру токсикологического исследования in vitro (Teeguarden et al, 2007). Анализ литературы свидетельствует, что техника культивирования клеток in vitro продолжает совершенствоваться, получение данных анализов автоматизируется, а сфера применения расширяется (Адаме, 1983; Никольский и др., 1984; Червонская и др., 1991, 1998; Visser, Zuschratter, 2011). Культуры клеток широко используются в биотехнологии
и научных исследованиях для изучения закономерностей протекания внутриклеточных процессов, общих для всех типов клеток, механизмов регуляции ионного транспорта, метаболизма, клеточного цикла, внутриклеточной сигнализации (Епифанова и др., 1983, 1988; Никольский и др., 1984; Крутецкая и др., 2003), для исследования процессов внутриклеточного паразитизма (Бейер и др. 1978; Белостоцкая, Шемарова, 1991; Chini et al., 2005), а также для выявления токсического и мутагенного действия химических веществ на клетки (Еськов и др., 1987; Альберт, 1989; Teeguarden et al., 2007). Сейчас культивируются практически все типы клеток человека, животных, рыб, насекомых, растений (Червонская и др., 1998). Считается, что использование клеточных культур является свидетельством высокого уровня эксперимента в любой сфере фундаментальных и прикладных народохозяйственных отраслях. Однако, отдавая должное культуральным тестам, не следует забывать и о дополнительных возможностях альтернативного моделирования с использованием одноклеточных свободноживущих микроорганизмов. Преимуществами методов биотестирования, основанных на применении одноклеточных организмов в качестве тест-объектов, является их простота, низкая себестоимость проведения анализов и большая экспрессность (Шемарова, 2007а). Однако внедрение свободноживущих микроорганизмов в качестве тест-объектов в практику токсикологических и ме дико-биологических исследований ограничено по двум основным причинам. Во-первых, из-за недостаточности экспериментальных данных, свидетельствующих о высокой чувствительности биотестов с использованием микроорганизмов. Во-вторых, из-за отсутствия научно-теоретического обоснования возможности экстраполяции и частичного переноса экспериментальных данных, полученных в реакциях биотестирования с использованием одноклеточных микроорганизмов на позвоночных.
Цель и задачи работы. Целью настоящего исследования является изучение сенсорных систем Tetrahymena pyriformis GL и научно-методологическое обоснование их использования в биотестировании экотоксикантов и биологически активных веществ.
Поставленная цель определила следующие задачи:
1. Изучить действие экотоксикантов (солей тяжелых металлов и
комплексонов) на инфузорий Tetrahymena pyriformis GL на популяционном, организменном и молекулярном уровнях. Определить острую и хроническую токсичность тяжелых металлов (Cd2+, Cu2+, Zn2+, Ni2+) и ряда комплексонов (пиколиновой кислоты и ее производных) методом биотестирования на Tetrahymena pyriformis GL. Изучить механизм их цитотоксического действия. Сравнить токсичность свободного и хелатированного кадмия и оценить возможность применения хелатирующих соединений для
детоксикации промышленных загрязнений, содержащих тяжелые металлы.
-
Разработать систему биохимических и клеточных тестов для определения токсичности экотоксикантов. Изучить действие тяжелых металлов на фагоцитарную активность (ФА) инфузорий, их рост, активность глутатион-Б-трансферазы (ГТ), дыхательные ферменты и процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ). Сравнить тест-реакции тетрахимен с реакциями кардиомиоцитов (КМ) лягушки Rana temporaria и митохондрий крысы.
-
Разработать экспериментальную тест-систему для изучения БАВ с использованием инфузорий Tetrahymena pyriformis GL. Изучить митогенное действие на Tetrahymena pyriformis GL биологически активных веществ (EGF, инсулина, ацетилхолина и серотонина).
-
Оценить возможность использования клеточных и биохимических тестов (реакция пролиферативного роста, определение содержания ДНК, ИКД, спектра холинэстераз, субстратной специфичности аминооксидаз) для выявления митотической активности БАВ (EGF, инсулина, ацетилхолина и серотонина).
-
Изучить сенсорные системы тетрахимен, ответственные за передачу митогенных сигналов. Проанализировать и сравнить сигнальные системы одноклеточных микроорганизмов и высших эукариот.
-
Изучить механизм митогенного действия БАВ на Т. pyriformis GL. Определить активность аденилатциклазы и динамику изменений синтеза ДНК в ядрах тетрахимен под действием
9+
активатора и блокаторов Са -каналов, ингибиторов МАР-киназ, РКС, PLC, ERK1 и ЕКК2-киназ. Оценить возможность применения блокаторов Са2+-каналов для снижения митотической активности клеток.
-
Испытать инфузорий Т. pyriformis GL в качестве тест-объектов при биотестировании токсичности кормов и безопасности лекарственных препаратов.
-
Разработать систему мер для стандартизации параметров биотестирования с использованием в качестве тест-объектов инфузорий Т. pyriformis GL.
Положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Инфузории Tetrahymena pyriformis GL проявляют высокую
^) I ^) і 9-І- 9 і
чувствительность к действию тяжелых металлов (Cd , Си , Zn , Ni ), ряда комплексонов (ПК и ее производных), БАВ (EGF и инсулина),
9+
блокаторов и активаторов Са -каналов, ингибиторов ключевых ферментов МАР-киназного и PI-сигнальных путей. В присутствии этих веществ
меняется поведение инфузорий, их метаболизм, скорость прохождения по клеточному циклу, в связи с чем, эти микроорганизмы и их реакции можно рассматривать в качестве диагностических тестовых систем для выявления токсичности тестируемых веществ (ТВ) и митотической активности БАВ.
2. Биологически активные вещества (инсулин и EGF) стимулируют
синтез ДНК. Полученные данные позволяют считать функциональный тест
по определению содержания ДНК в ядрах инфузорий основным
цитохимическим критерием оценки митотического действия веществ на
клетки.
3. Молекулярное сходство сигнальных систем одноклеточных
микроорганизмов с сигнальными системами высших эукариот позволяет
рассматривать одноклеточные микроорганизмы в качестве тест-объектов в
медицинской биотехнологии и использовать их для предварительной
оценки митогенного действия БАВ и веществ направленного синтеза.
4. Данные о биологическом действии веществ, полученные методом
биотестирования с использованием Tetrahymena pyriformis GL, могут быть
экстраполированы и частично перенесены на теплокровных животных, если
сравнение полученных данных проводится на клеточном или
молекулярных уровнях, но не на уровне целого организма.
Научная новизна. Впервые обобщены и систематизированы данные
мировой литературы о сигнальных системах одноклеточных
микроорганизмов. Получены новые экспериментальные данные о
структурно-функциональной организации сенсорных систем
микроорганизмов, которые включены в монографию «Внутриклеточная сигнализация у низших эукариот» (Шемарова, 2010).
Получены данные, свидетельствующие о высокой чувствительности микроорганизмов (инфузорий Т. pyriformis GL, P. caudatum, жгутиконосцев
л і O-i- O-i- О і
A. longd) к действию тяжелых металлов (Cd , Си , Zn и Ni ), хелатирующих соединений, обладающих гербицидной активностью, гормонов и факторов роста позвоночных. Изучены тест-реакции микроорганизмов на действие ксенобиотиков на популяционном, организменном и молекулярном уровнях.
Разработана тест-система для изучения действия БАВ на одноклеточных микроорганизмах. Показаны перспективы и ограничения метода биотестирования для выявления активности БАВ на инфузориях Tetrahymena pyriformis GL. Изучено действие инсулина, EGF, серотонина, ацетилхолина на пролиферацию Tetrahymena pyriformis GL и молекулярный механизм митогенного действия БАВ. Установлена роль ионов Са^ и ряда сигнальных белков, во внутриклеточной передаче сигналов у одноклеточных эукариот. Показано, что первыми на действие БАВ реагируют сигнальные системы, включающие элементы АС- и тирозинкиназной систем, что приводит к стимуляции синтеза ДНК. Полученные данные позволяют считать функциональный тест по определению содержания ДНК в ядрах инфузорий основным
цитохимическим критерием оценки митогенного действия веществ на клетки.
Получены доказательства сходства сигнальных систем низших и высших эукариот, что позволяет рассматривать одноклеточные микроорганизмы в качестве тест-объектов в медицинской биотехнологии. Новые данные о сигнальных системах микроорганизмов дополняют концепцию биотестирования, расширяют представления о перспективах использования метода в биотехнологии, позволяют по-новому взглянуть на биотестирование как на инструментальный экспрессный метод для оценки безопасности и выявления биологической активности веществ направленного синтеза.
Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное
исследование относится к работам, вносящим вклад в теорию
естествознания, расширяет современные представления о сигнальных
системах эукариотических микроорганизмов как молекулярных сенсорах
окружающей среды. В монографии «Внутриклеточная сигнализация у
низших эукариот» (Шемарова, 2010) с грифом «Утверждено к печати
Институтом эволюционной физиологии и биохимии РАН» впервые
обобщены литературные и собственные экспериментальные данные о
структурно-функциональной организации сигнальных систем
эукариотических микроорганизмов, рассмотрены элементы
биохимического и функционального сходства сигнальных систем, ответственных за передачу митогенных, апоптотических, стрессовых сигналов в клетках низших эукариот и позвоночных. В персональной главе "Calcium Signaling in Lower Eukaryotes" книги «Calcium Signaling» (New York, Nova Press, 2011) подробно анализируются механизмы формирования, распространения и тушения внутриклеточных Са2+-сигналов у низших эукариот (Shemarova, 2011). Предложена концепция универсальности механизмов, лежащих в основе внутриклеточной сигнализации у высших и низших эукариот. Данная концепция позволяет систематизировать знания о внутриклеточных сигнальных системах эукариот с позиции их происхождения и эволюционного развития и объясняет причины сходных реакций клеток разного филогенетического уровня на один и тот же раздражитель.
Обобщены и систематизированы данные о действии химических веществ на одноклеточные микроорганизмы на популяционном, организменном и молекулярном уровнях. Определены молекулярные механизмы действия экотоксикантов (тяжелых металлов и комплексонов) на микроорганизмы. Систематизированы данные о выращивании инфузорий Tetrahymena pyriformis GL на искусственных питательных средах и изучены возможности метода спектро фотометрического определения содержания ДНК в ядрах инфузорий для выявления митотической активности БАВ и веществ направленного синтеза.
Исследования реакций инфузорий Tetrahymena pyriformis GL на антропогенные химические воздействия имеют важное практическое значение и включены в «Методические рекомендации по использованию инфузорий Tetrahymena pyriformis GL в качестве тест-объектов в токсикологических, фармакологических и экологических исследованиях» (Шемарова, 2007) с грифом «Утверждены Научным координационным советом по животноводству и ветеринарии Северо-Западного научно-методического центра Россельхозакадемии».
Результаты работы, изложенные в «Методических рекомендациях» внедрены в практическую деятельность ГУ «Санкт-Петербургская городская ветеринарная лаборатория», а также лабораторий ветеринарно-санитарной экспертизы на рынках Санкт-Петербурга.
«Методические рекомендации» используются в учебном процессе при проведении лабораторно-практических занятий по курсу «Токсикология» на ветеринарном факультете СПбГАВМ; их могут применять в своей работе ветеринарные врачи, экологи, специалисты производственных санитарно-гигиенических лабораторий, преподаватели биологических и сельскохозяйственных вузов.
Полученные в работе результаты и обобщения используются при чтении лекций по курсу «Протозоология» на ветеринарном факультете СПБГАВМ и могут применяться в лекционных курсах по биотехнологии, экологии, ветеринарной токсикологии, санитарной гигиене и некоторых специальных разделах зоологии, физиологии и клеточной биологии.
Апробация работы. Основные результаты исследования докладывались на заседаниях Лаборатории сравнительной функциональной биохимии беспозвоночных Института эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова РАН (Санкт-Петербург, 1991 -2001), на Всероссийской конференции «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1991), на семинарах Института эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова РАН (Санкт-Петербург, 2001-2011), III Всероссийском съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), IV Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2005), VIII Международном совещании и VI школы по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), XX Всероссийском съезде физиологов (Москва, 2006), III Съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), научной конференции «Фундаментальная наука - клинике», (Санкт-Петербург, 2007), I Международном конгрессе ветеринарных фармакологов (Санкт-Петербург, 2008), VII Международном Симпозиуме "Биологическая подвижность: достижения и перспективы" (Пущино, 2008), XIV Международном совещании и VII школы по эволюционной физиологии, посвященные памяти академика Л.А. Орбели (Санкт-Петербург, 2011).
Публикации. Результаты исследований по теме диссертации опубликованы в 46 печатных работах, в том числе в двух монографиях, брошюре, 36 статьях в рецензируемых отечественных и зарубежных
изданиях, 7 тезисах докладов на международных и всероссийских съездах, конференциях и школах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 251 странице машинописного текста, включая 36 рисунков и 17 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, 5 экспериментальных и 1 теоретической глав, обсуждения результатов исследования и выводов. Библиография включает 129 отечественных и 301 зарубежных источников.
