Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Антиоксидантная система млекопитающих 10
1.2. Биологически активные вещества и их влияние на организм млекопитающих 14
1.2.1. Витамин А 16
1.2.2. Витамин Е 18
1.2.3. Витамин С 20
1.2.4. Селенит натрия 23
1.2.5. Мелатонин и мелакрил 25
1.2.6. Тироксин и мерказолил 28
1.3. Особенности биологии хищных млекопитающих, введенных в зоокультуру 31
Глава 2. Материалы и методы исследований 38
2.1. Объекты исследования 38
2.2. Схемы постановки экспериментов 38
2.3. Методы исследования 40
2.4. Статистическая обработка данных 41
Глава 3. Результаты исследований 42
3.1. Влияние дополнительного витамина А на антиоксидантную систему лисиц и песцов 42
3.1.1. Лисицы 42
3.1.2. Песцы 45
3.2. Влияние дополнительного витамина Е на антиоксидантную систему лисиц и песцов 50
3.2.1. Лисицы 50
3.2.2. Песцы 53
3.3. Влияние дополнительного витамина С на антиоксидантную систему норок 59
3.3.1. Норки стандартной породы 59
3.3.2. Норки породы сапфир 63
3.4. Влияние селенита натрия на антиоксидантную систему хищных млекопитающих 65
3.4.1. Норки стандартной и сапфировой пород 65
3.4.2. Лисицы 73
3.4.3. Песцы 16
3.5. Влияние мелакрила на антиоксидантную систему норок и песцов 19
3.5.1. Норки стандартной породы 79
3.5.2. Норки серебристо-голубой породы 82
3.5.3. Норки породы пастель 83
3.5.4. Песцы 87
3.6. Влияние тироксина и мерказолила на антиоксидантную систему песцов 90
Обсуждение результатов 94
Заключение 124
Выводы 127
Благодарности 128
Литература
- Антиоксидантная система млекопитающих
- Биологически активные вещества и их влияние на организм млекопитающих
- Схемы постановки экспериментов
- Влияние дополнительного витамина Е на антиоксидантную систему лисиц и песцов
Введение к работе
Актуальность проблемы. К настоящему времени накоплен огромный фактический материал, свидетельствующий об участии антиоксидантной системы (АОС) в приспособительных реакциях. Основной функцией АОС является поддержание на стационарном уровне концентрации активных форм кислорода (АФК), необходимых для перекисного окисления липидов (ПОЛ) и ряда других процессов жизнедеятельности клетки (дифференцировка, пролиферация и др.) (Владимиров, 2000; Меньшикова и др., 2006). Баланс между системами генерации и тушения АФК необходим для сохранения гомеостаза при действии на организм разнообразных факторов среды (Хавинсон и др., 2003).
Чаще всего при изучении реакции АОС на биологически активные вещества (БАВ) объектами исследования являются лабораторные или сельскохозяйственные животные. В подобных экспериментах не учитываются видовые особенности млекопитающих, связанные с их экологической специализацией (экогенез). Норки, лисицы и песцы клеточного содержания сохранили биологические черты своих диких предковых видов (Ильина, 1975). Вследствие чего для выяснения видовых особенностей функционирования АОС является важным исследование реакции данной системы указанных хищных млекопитающих на БАВ в сравнительно-видовом аспекте.
Витамины А, Е и С, участвующие во многих обменных процессах организма, селенит натрия, являющийся источником микроэлемента селена, мелакрил, имплантируемый препарат мелатонина, ускоряющий созревание зимнего меха животных, используются в практике пушного звероводства для улучшения физиологического состояния хищных млекопитающих и увеличения показателей некоторых хозяйственно-полезных признаков. Гормон щитовидной железы тироксин и тиреостатик мерказолил влияют на интенсивность метаболизма. Поскольку все указанные БАВ в той или иной степени обладают антиоксидантной способностью, изучение их воздействия
на функционирование АОС хищных животных будет способствовать выяснению взаимодействий между эндогенными и экзогенными .., антиоксидантами.
В доступной нам литературе, касающейся влияния БАВ на АОС млекопитающих, в качестве материала исследования, в основном, используются кровь, печень и почки, а также либо органы, являющиеся мишенью действия определенных гормонов, либо задействованные в метаболизме препаратов. В нашей работе изучено состояние АОС тканей шести основных органов (печени, почек, лёгких, селезёнки, сердца и скелетной мышцы) под влиянием БАВ, что позволяет в более полной мере оценить возможное воздействие того или иного препарата на АОС организма.
В связи с вышеизложенным изучение реакции на БАВ АОС хищных млекопитающих, различающихся по экогенезу, является актуальным и представляет не только научный интерес, но и практическую значимость.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Президента РФ НШ - 4310.2006.4 и НШ - 306.2008.4.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение реакции ферментативного и неферментативного звеньев АОС тканей различных органов хищных млекопитающих на БАВ.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
исследовать в сравнительно-видовом аспекте реакцию АОС на БАВ (витамины А, Е, С, селенит натрия, мелакрил, тироксин, мерказолил) у трёх видов хищных млекопитающих, различающихся по экогенезу (норка, лисица, песец);
изучить внутривидовые особенности реакции системы антиоксидантной защиты различных пород норок на витамин С, мелакрил и селенит натрия;
оценить реакцию АОС тканей различных органов (печени, почек,
7 лёгких, селезёнки, сердца и скелетной мышцы) животных на БАВ;
изучить степень чувствительности ферментативного и неферментативного компонентов системы антиоксидантной защиты хищных млекопитающих к исследованным БАВ;
оценить возможность использования показателей АОС в качестве индикатора эффективности применения различных БАВ.
Научная новизна. Впервые изучена реакция системы антиоксидантной защиты тканей органов трёх видов хищных млекопитающих на БАВ, применяемые в звероводстве, а также на тироксин и мерказолил. Анализ межвидовых различий чувствительности АОС к БАВ показал высокую устойчивость данной системы у песцов, дикий предковыи вид которых адаптирован к суровым арктическим условиям. Выявлена тканевая специфика реакции антиоксидантов на БАВ, определяемая функциональной ролью органов, а таюке влиянием того или иного препарата на метаболизм в различных тканях. На хищных млекопитающих нами подтверждены данные, полученные ранее на лабораторных животных и свидетельствующие об антиоксидантных способностях использованных БАВ. Мелакрил не во всех случаях оказывал антиокислительное действие.
Практическая значимость работы. Высокая чувствительность АОС к факторам среды позволяет использовать её для целей физиолого-биохимического мониторинга. Практическая значимость разрабатываемой проблемы определяется использованием в практике пушного звероводства полученных нами результатов для контроля за состоянием здоровья хищных млекопитающих и корректного проведения профилактических и терапевтических мероприятий с применением БАБ.
Данные, полученные в ходе изучения воздействия витаминов на состояние системы ферментативных и низкомолекулярных антиоксидантов, могут быть использованы для оценки физиологической потребности организма хищных млекопитающих в БАБ.
8 Апробация работы. Материалы работы представлены и обсуждены на научно-практических конференциях студентов и аспирантов эколого-биологического факультета Петрозаводского государственного университега (г. Петрозаводск, 2004, 2005); на III Международном симпозиуме «Физиологические основы повышения продуктивности млекопитающих, введенных в зоокультуру» (г. Петрозаводск, 2005); на 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино, Московская область, 2006); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы природопользования, охотоведения и звероводства» (г. Киров, 2007); на конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экологии и эволюции в исследованиях молодых ученых» (г. Москва, 2008); на Всероссийской научно-практической конференции «50 лет мелатонину: итоги и перспективы исследований» (г. Санкт-Петербург, 2008); на II Съезде физиологов СНГ (г. Кишинев, Молдова, 2008), а также на заседании Учёного совета Института биологии КарНЦ РАН (г. Петрозаводск, 2008).
Положения, выносимые на защиту:
Видовые особенности реакции системы антиоксидантной защиты на БАВ у хищных млекопитающих (норка, лисица и песец) обусловлены экогенетическими различиями диких предковых видов животных.
Тканеспецифичность реакции АОС на изученные БАБ связана с функциональной ролью органа и особенностями влияния препаратов на метаболизм.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста, содержит 8 таблиц и 29 рисунков. Работа состоит из
9 введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследование, 6 глав результатов собственных исследований, обсуждения, заключение, выводов и списка литературы, который включает 205 наименований, из них 145 иностранных.
Антиоксидантная система млекопитающих
Кислород необычайно важен для высших форм жизни: реакция восстановления его до воды составляет основу биоэнергетики человека и животных. Вместе с тем во всех клетках вследствие неполного (1- или 2-электронного) восстановления молекулы кислорода или изменения спина одного из его электронов, находящихся на внешних орбиталях, образуется гетерогенный по своим физико-химическим свойствам класс АФК -высокореакционных, преимущественно радикальных, кислородных соединений. К ним относятся супероксидный анион-радикал (0 2), синглетный кислород (Ог), перекись водорода (Н2О2), гидроксильный радикал (НО), гипохлориты (ОСГ), органические радикалы и др. (Меньшикова, 2006). Выявлен широкий спектр физиологических эффектов АФК - соединения играют важную роль в модуляции активности некоторых ферментов, в процессах клеточной пролиферации, дифференцировки, сигналинга, генной экспрессии, разборки и обновления ядерной мембраны и др. (Хавинсон и др., 2003).
Вместе с тем высокая реакционная способность АФК и малые значения времён жизни в биологических субстратах делают их эффективным инструментом локального действия. К наиболее вероятным последствиям окислительной цитотоксической атаки АФК относятся индукция процессов ПОЛ в биологических мембранах (Владимиров, Арчаков, 1972), инактивация ферментов, повреждение мембрансвязанных белков (Дубинина, Шугалей, 1993) и ДНК клеток (Пескин, 1997).
Тем не менее, свободнорадикальное окисление биологических субстратов, находящееся под контролем антиоксидантов, относится к нормальным метаболическим процессам (Владимиров, 2001; Журавлёв, 1983; Дубинина, Шугалей, 1993). Под антиоксидантами понимают широкий класс веществ, куда входят соединения, которые, присутствуя в концентрациях, низких по сравнению с окисляемым субстратом, значительно ограничивают или предотвращают окисление данного субстрата (Halliwell, Whiteman, 2004).
В нормально функционирующем организме защита клеток от повреждающего действия свободных радикалов и перекисей обеспечивается различными путями: предотвращением образования свободных радикалов; обезвреживанием их посредством связывания и рекомбинации; ингибированием инициации и остановкой разветвления цепи переокисления; повышением (восстановлением) активности антиоксидантных ферментов посредством улучшения их функции и/или синтеза de novo; восстановлением повреждений мембранных липидов, белков, ферментов, репарацией ДНК и других окислительных повреждений биомолекул (Gutteridge, 1995).
Ферментативные антиоксиданты характеризуются высокой специфичностью действия, направленного против определённых форм АФК, специфичностью клеточной и органной локализации, а также использованием в качестве катализаторов металлов, таких как Си, Zn, Mn, Fe, № и металлоида Se (Зенков, Ланкин, Меныцикова, 2001). Воздействия, приводящие к усилению наработки СГ2 и Н202, индуцируют синтез ферментативных антиоксидантов (Hassan, 1988).
Супероксиддисмутаза (СОД; КФ 1.15.1.1) катализирует реакцию дисмутации 0 2 с образованием Н202 и молекулярного 02, фермент имеет три основные изоформы: медь-цинковую (Си,2п-СОД), марганцевую (Мп-СОД) и экстрацеллюлярную (Э-СОД). Первая чувствительна к цианиду и является главным цитозольным ферментом, вторая индуцибельна, резистентна к цианиду и действию Н202, локализована в митохондриях эукариот, а третья содержится во внеклеточном матриксе и характеризуется водорастворимостью и устойчивостью в различных органических растворителях (Fridovich, 1989, 1998; Меньшикова и др., 2006). У млекопитающих самая высокая активность СОД наблюдается в печени и почках (Илюха, 2004; Matkovics et al., 1977).
Широкое участие 0 2 в ферментативных реакциях синтеза простагландинов и метаболизма ксенобиотиков, а также клеточной пролиферации и экспрессии определенных генов, позволяет рассматривать СОД как фермент, выполняющий не только защитную, но и регуляторную функции, будучи ключевым звеном системы регуляции стационарной концентрации 0 2. (Меныцикова и др., 2006). Особое значение СОД отмечают (Закарян, Айвазян, Карагезян, 2002) в формировании адаптивной функции организма, находящегося в зависимости от факторов внешней и внутренней среды.
Каталаза (КФ 1.11.1.6) - гемсодержащий фермент, максимальное содержание которого обнаружено в эритроцитах, а также в печени и почках млекопитающих, в клетках - преимущественно в пероксисомах. Каталаза участвует в реакциях разложения Н202, однако, в окисленном состоянии может работать как пероксидаза (КФ 1.11.1.7), катализируя окисление спиртов, фенолов или альдегидов (Меныцикова и др., 2006).
Для инактивации Н202 и органических перекисей в клетках высших животных присутствует важное семейство ферментов — глутатионпероксидазы (ГПО; КФ 1.11.1.9). Существует семь изоферментов ГПО (Arthur, McKenzie, Beckett, 2003), максимальная активность фермента обнаружена в лёгких и селезёнке (Matkovics et al., 1977). Все ГПО катализируют реакцию восстановления глутатионом нестойких органических гидропероксидов, включая гидропероксиды полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), в стабильные соединения - оксикислоты. Подобно каталазе, ГПО способны также утилизировать Н202. Поскольку сродство классической ГПО к Н202 выше, чем у каталазы, первая более эффективно работает при низких концентрациях Н202, в то же время в защите клеток от окислительного стресса, вызванного высоким содержанием Н202, ключевая роль принадлежит каталазе (Меныцикова и др., 2006).
В клетках млекопитающих существуют также мультифункциональные белки - глутатион-Б-трансферазы (ГТ; КФ 2.5.1.18), использующие восстановленный глутатион для конъюгации с гидрофобными соединениями и восстановления органических пероксидов (Кулинский, Колесниченко, 1990). Ферментативные антиоксиданты специализированы преимущественно на внутриклеточной защите от АФК. Вместе с тем в организме во всех водных и липидных фазах могут протекать радикальные окислительные процессы, в ингибировании которых важную роль играют низкомолекулярные антиоксиданты-перехватчики органических радикалов. Например, фенольные антиоксиданты (витамины Е, К, убихиноны, триптофан, фенилаланин и др.), имеющие ароматическое кольцо, связанное с одной или несколькими гидроксильными группами, эффективно ингибируют 0 2, 02, НО и индуцированные последним процессы ПОЛ (Меньшикова и др., 2006). Легкоокисляющиеся пептиды, в состав которых входят аминокислоты, содержащие меркапто-группу: цистеин, цистин, метионин, также играют важную роль в антиоксидантной защите организма. Особое место среди SH-содержащих соединений занимают глутатион-трипептид (цистеин, глутамин и глицин), тиоредоксины и пероксиредоксины, инактивирующие реакционные нерадикальные формы АФК (Н202, НОСІ, ONOOH, 102), а также разлагающие гидроперекиси с образованием спиртов (Меньшикова, 2006).
Биологически активные вещества и их влияние на организм млекопитающих
Биологически (физиологически) активные вещества - это любые вещества, вырабатываемые организмом и получаемые им извне и оказывающие либо стимулирующее, либо подавляющее воздействие на происходящие в организме процессы (Реймерс, 1988). П. П. Андерсон и Я. Я. Аугшкалн (1989) предложили классификацию БАВ, в основе которой лежат следующие характеристики: значение, с которым БАБ используются в составе рациона; их биохимическая и физиологическая роль и функции в обменных процессах организма. «В схеме классификации все основные классы, подклассы, группы, подгруппы и отдельные представители БАВ получают свои постоянные цифровые индексы (подобно классификации ферментов в биохимии). В соответствии с представленной схемой классификации все БАВ разделяются на три основных класса: 1. Дополнительные незаменимые кормовые компоненты - БАВ, которые вводятся в состав рационов для восполнения до оптимальной нормы потребности животных в таких жизненно важных веществах как витамины, аминокислоты и микроэлементы. Полное или частичное отсутствие этих факторов в организме резко снижает продуктивность животных. 1.1. Витамины 1.2. Аминокислоты 1.3. Микроэлементы 2. Стимуляторы - БАВ, которые используются в рационах животных для увеличения интенсивности роста и продуктивности, но отсутствие которых не вызывает нарушения обмена веществ и нормальных физиологических процессов в организме 2.1. Специфические - действуют на определенные этапы обмена веществ в организме (поедание корма, пищеварение, всасывание, регуляция и поддержание нормального метаболизма клеток, тканей и органов) 2.1.1. кормовые антибиотики 2.1.2. ферментные препараты 2.1.3. антиокислители 2.1.4. гормоны, гормоноиды и вещества, подавляющие их действие 2.1.5. поверхностно-активные вещества 2.1.6. вкусовые и ароматические кормовые добавки 2.2. Неспецифические - способствуют адаптации и повышают сопротивляемость организма к неблагоприятному влиянию различных стрессовых факторов, способствуют естественной резистентности 2.2.1. адаптогены 2.2.2. иммуномодуляторы 2.2.3. препараты комплексного стимулирующего действия 3. Фармакологические средства - БАВ, которые используются в специальных составах комбикормов или добавляются в рационы животных с целью предупреждения и лечения болезней или для придания особых желаемых качеств животноводческой продукции, но которые у здоровых животных сами по себе не вызывают значительного увеличения темпа роста и продуктивности. 3.1. противомикробные средства и консерванты кормов 3.2. антигельминтные средства 3.3. антианемические средства 3.4. антистрессовые препараты-транквилизаторы 3.5. средства для лечения незаразных болезней и регуляторы воспроизводства 3.6. адсорбенты 3.7. особые средства (красители и т.д.)» (Андерсон, Аугшкалн, 1989). Нормы питательных веществ и витаминов в зависимости от предъявляемых к ним требованиям бывают физиологические (потребность), зоотехнические, включающие надбавки на хозяйственные условия, плановые (для технических проектов), «страховые» (значительно превышающие потребность). Физиологические нормы, в сущности, отражают потребность организма. Но в практических условиях не исключены технологические потери: разрушение витаминов в процессе кормоприготовления, механические потери готовой кормосмеси и т.д. Поэтому в условиях зверохозяйства рекомендуется пользоваться зоотехническими нормами, которые предусматривают 15%-ный запас по сравнению с физиологическими (Квартникова, 1999).
В данном исследовании использовались следующие БАВ: витамины А, Е и С, селенит натрия, имплантируемый препарат мелатонина, тироксин и мерказолил, характеристика которых и сведения об их влиянии на АОС млекопитающих приведены ниже.
Витамин А является жирорастворимым витамином и включает ряд близких по структуре соединений: ретинол, дегидроретинол, ретиналь, ретиноевая кислота, эфиры этих веществ и их пространственные изомеры. Его роль для зрения, нормального развития эмбриона и контроля всех этапов существования клетки невозможно переоценить (Chambon, 1996). Витамин А также способен снижать заболеваемость инфекционными заболеваниями и смертности от них путем активации иммунной системы - эффект частично обусловлен стимуляцией витамином А макрофагов (Hagen et al., 1999). Наряду с выполнением ретинолом и другими ретиноидами антиоксидантных функций, показана их про-оксидантная способность in vitro и in vivo, приводящая к гибели и/или трансформации клетки, связанной с повышенным окислительным повреждением (Gelain et al., 2008).
На сегодняшний день хорошо изучен метаболизм витамина А. Гомеостатическая регуляция концентрации ретинола в плазме у млекопитающих осуществляется посредством ретинол-связывающего белка (РСБ) плазмы крови (Blomhoff R., Blomhoff Н.К., 2006), который синтезируется в паренхимных и звездчатых клетках печени, в клетках Сертоли, в почках, плаценте и жировой ткани (Smeland et al., 1995). Физиологическое значение РСБ состоит в предохранении ретинола от нежелательной фильтрации и выведения почками и в постоянной его доставке к периферическим тканям независимо от флуктуации уровня витамина А в диете (Simms, Ross, 2000). От содержания ретинола в пище зависит его уровень в печени, основном запасающем витамин А органе (Goodman, 1984). Чтобы удовлетворить нужды организма в витамине А, некоторая часть ретинола из паренхимных клеток печени секретируется непосредственно в циркуляторное русло, где связывается с трантиретином, транспортным белком для тироксина (Т4). Комплекс высвобождает ретинол в тканях-мишенях. В захвате клеткой витамина А участвуют специфические рецепторы, высокая связывающая активность которых отмечается для пинеальной железы, плаценты, пигментных эпителиальных клеток сетчатки глаза, костного мозга, почек, а также тонкого кишечника, селезёнки, печени и лёгких (Smeland et al., 1995).
Повышение уровня эфиров ретинила в плазме отмечается в условиях хронической или острой витамин А-интоксикации или как следствие недавнего всасывания витамина (Eckhoff, Collins, Nau, 1991). Однако исследование метаболизма витамина А у разных видов животных позволили опровергнуть это положение по отношению к хищным, поскольку транспорт витамина А в крови большинства видов отряда Carnivora основательно отличается от такового у других животных и человека (Schweigert, Zucker, 1991). Витамин А транспортируется в плазме крови представителей Canidae и Mustelidae не только в виде ретинола, а преимущественно в виде эфиров ретинила (в основном, пальмитат и стеарат) в связанном с липопротеинами очень низкой, низкой и высокой плотности состоянии (Raila et al., 2000). Высокое содержание эфиров ретинила в крови характерно и для представителей семейств Ursidae, Procyonidae, Viverridae и Felidae, у которых, тем не менее, общий уровень витамина А - низок (Schweigert, Zucker, 1991). У человека и крыс симптомы витамин А-интоксикации обнаруживаются при сходном уровне неспецифически связанных эфиров витамина A (Cline et al., 1997).
Физиологические факторы и процессы, отвечающие за низкую чувствительность хищных к потреблению высокого уровня витамина А не до конца выяснены. В связи с чем необходимо особо отметить специфическую функцию почек Canidae в обеспечении плазмы ретинолом и эфирами ретинила, а также в экскреции больших количеств витамина А с мочой, что, по-видимому, является одним из механизмов защиты от интоксикации витамином A (Raila et al., 2000).
Схемы постановки экспериментов
Объектами исследования являлись хищные млекопитающие, принадлежащие к трем видам, — песец (Alopex lagopus L., сем. Canidae) лисица {Vulpes vulpes L., сем. Canidae) и норка (Neovison vison Shr., сем. Mustelidae). Использовались следующие породы животных: вуалевый песец, серебристо-чёрная лисица, а также стандартная (тип тёмно-коричневый), сапфировая, пастелевая и серебристо-голубая норки. Животные содержались в стандартных условиях на звероводческой ферме ОАО «Пряжинское» (Республика Карелия). Для кормления животных применялись рационы, рекомендованные для каждого вида (Балакирев, 2007). Всего было исследовано 114 норок, 77 песцов, 38 лисиц. Проведено более 1300 анализов проб. Действие высоких доз витаминов А и Е на АОС животных исследовали у 6-месячных самок серебристо-чёрных лисиц и вуалевых песцов (п=6 в каждой группе каждого вида), влияние витамина С - у 6-месячных норок двух окрасов (в каждой группе п=8 для стандартных норок, п=4 для сапфировых, при равном соотношении полов). Лисицы и песцы подопытных групп в течение 14 дней в ноябре получали с кормом витамины А (ретинола ацетат) и Е (dl-a-токоферилацетат): лисицы - 10 тыс И.Е. витамина А, 100 мг витамина Е/животное; песцы - 5 тыс и 10 тыс И.Е. витамина А, 50 и 100 мг витамина Е/животное. При этом в базальный рацион не вводили дополнительно витамин А, содержание витамина Е составляло 15 мг/кг корма. Норки подопытных групп получали 100 мг витамина С/животное в течение 20 дней. Суточная потребность животных в указанных витаминах составляет 500-1000 И.Е. ретинола, 50 мг а-токоферола (Сборник..., 1993) и 5 мг аскорбиновой кислоты (Квартникова, 1999).
Эксперимент по влиянию селенита натрия проводился на молодняке норок двух пород (стандарт, пастель), серебристо-чёрных лисиц и вуалевых песцов (п=12 в каждой группе каждого вида). Животные подопытных групп получали препарат с кормом в течение 6 декад (с 1 июля по 18 октября, включительно) с перерывами в 10 дней: для норок из расчета по 0,2 мг/животное, для лисиц и песцов - по 0,2 мг/животное в течение первых двух декад, 0,3 мг/животное - следующих двух декад, 0,4 мг/животное -последних двух декад. Взвешивание животных проводилось ежемесячно с июля по октябрь. Оптимальной дозой селенита натрия в диете животных считается 0,1 мг/кг, токсичной — 5-10 мг/кг (Jacobs, Frost, 1981; Kim, Mahan 2001 a, b).
Опыт по влиянию мелакрила проведен на норках стандартного, серебристо-голубого и пастелевого окрасов в возрасте 1,5 года (п=10 в каждой группе каждой породы, при равном соотношении полов), а также на самках вуалевых песцов в возрасте 1,5 года (п=5 в каждой группе). Особям подопытных групп в конце мая - начале июня подкожно был имплантирован мелакрил из расчета по -5,6 мг и -11,2 мг мелатонина (для норок и песцов, соответственно) на животное. Забой особей подопытных групп происходил в сентябре, контрольных - в конце ноября.
При изучении воздействия тироксина и мерказолила использовались 7-месячные вуалевые песцы (п=6 в каждой группе, при равном соотношении полов). Животные подопытных групп получали тироксин и мерказолил с питьевой водой в течение 5 дней в ноябре в два этапа с перерывом в 5 дней из расчета по 0,05 мг/животное тироксина и 5 мг/животное мерказолила, соответственно. Прерывистый режим введения препаратов, как в случае с селенитом натрия, так и в случае с тироксином и мерказолилом, не способствует привыканию и является удобным при работе в зверохозяйствах.
Контролем во всех экспериментах служили звери того же возраста и пола, отобранные по принципу аналогов (Балакирев, 2007), содержавшиеся на общехозяйственном рационе без добавления препарата.
Образцы тканей печени, почек, сердца, лёгких, селезёнки и скелетной мышцы отбирали в период планового забоя животных на звероферме, заморалшвали и хранили до анализа при -25С. Для проведения хемилюминесцентного анализа, определения активностей антиоксидантных ферментов, измерения уровня соединений, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП)), а также содержания белка гомогенаты тканей готовили в 0,05 М фосфатном буферном растворе (рН 7,0). После центрифугирования (при 6000g в течение 15 мин) в полученных супернатантах проанализированы показатели ферментативного и неферментативного звеньев АОС, измерены активности антиоксидантных ферментов, уровень ТБК-РП и содержание белка.
Для интегральной оценки состояния АОС использовали хемилюминесцентный анализ (ХМЛ) (Klinger et al., 1996) с применением люминола и люцигенина в качестве люминофоров для характеристики ферментативного и неферментативного звеньев системы, соответственно, и Н202 для активации свечения.
Спектрофотометрически измеряли активности антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы (СОД) (К.Ф. 1.15.1.1) - по модифицированной адренохромной методике (Misra, Fridovich, 1972) и каталазы (К.Ф. 1.11.1.6) - по количеству разложенной Н202 (Bears, Sizes, 1952), а также содержание белка по Лоури (Lowry et al., 1951) с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина. Активность каталазы выражали в мкмоль Н202, разложенной за 1 минуту, а за 1 усл. ед. активности СОД принимали количество фермента, способное затормозить реакцию автоокисления адреналина на 50%. Активность ферментов рассчитывали на 1 г сырой ткани, а удельную активность - на 1 мг белка.
Содержание не связанных с белками сульфгидрильных групп определяли спектрофотометрически по методу Эллмана (Sedlak, Lindsay., 1968). Для этого гомогенати тканей органов готовили в 0,02 М ЭДТА Na2: после центрифугирования (в течение 15 мин при 5000g) 1 мл супернатанта смешивали с 4 мл дистиллированной воды и 1 мл 50% ТХУ, затем вновь центрифугировали (15 мин при 3000g). В полученных супернатантах спектрофотометрически определяли уровень небелковых SH-групп и выражали в ммоль/100 г ткани, рН полной реакционной смеси составлял 8,0.
Уровень ТБК-РП, в том числе и малонового альдегида (МДА), как вторичного продукта ПОЛ, измеряли спектрофотометрически и выражали в мкмоль/г ткани (Kitabchi, Challoner, Williams, 1968).
Полученные данные обрабатывали с использованием пакетов программ MS Excel и Statgraphics общепринятыми методами вариационной статистики, сравнение проводили с применением непараметрического критерия (U) Вилкоксона-Манна-Уитни (Коросов, Горбач, 2007).
Влияние дополнительного витамина Е на антиоксидантную систему лисиц и песцов
Биологическое действие ос-токоферола, известного как «витамин плодовитости», преимущественно связывается с его антиоксидантными свойствами (Ricciarelli, Zingg, Azzi, 2001). Потребность тканей органов хищных млекопитающих в витамине Е определяется множеством факторов (физиологическое состояние организма, питательная ценность и состав пищи и др.) (Сборник ..., 1993), в том числе и видовой принадлежностью животных (Меньщикова и др., 2006). Согласно нормам питания, суточная потребность в витамине Е составляет по разным источникам 6-10 мг а-токоферола (Физиологическая потребность ..., 2003) или 50 мг витамина Е на голову лисицам и песцам (Сборник ..., 1993).
В шести тканях органов лисиц и песцов были изучены показатели функционирования ферментативного и неферментативного звеньев АОС (люминол- и люцигенин-зависимая Н202-индуцированная ХМЛ, соответственно). Измерены общая и удельная активности антиоксидантных ферментов — СОД и каталазы, уровень небелковых тиолов, а также содержание белка в тканях. Помимо этого в селезёнке и в скелетной мышце животных определяли содержание ТБК-РП.
Не обнаружено достоверных изменений показателей АОС в печени и почках лисиц, получавших дополнительное количество витамина Е. В сердечной мышечной ткани отмечено снижение активности антиоксидантных ферментов, о чём свидетельствует увеличение интенсивности люминол-зависимой ХМЛ (с -22445,50±976,86 до -18333,10±1,444,32 имп./40 сек/г ткани) (Рис. 4 А). Воздействие витамина Е на АОС селезёнки выразилось в снижении уровня небелковых тиоловых групп (с 0,26±0,01 до 0,18±0,02 ммоль/100 г ткани) (Рис. 5 Б).
Сходное влияние дополнительного витамина Е на неферментативный компонент АОС зафиксировано для лёгких и скелетной мышечной ткани. Снижение интенсивности люцигенин-зависимой ХМЛ (в 15 раз в лёгких и в 5 раз в скелетной мышце) свидетельствует об увеличении уровня низкомолекулярных антиоксидантов. Также снижение интенсивности люцигенин-зависимой ХМЛ (с 23950,40±10342,90 до -16863,50±1972,98 ИМП./40 сек/г ткани) зафиксировано в скелетной мышце лисиц, получавших витамин Е (Рис. 4 Б).
Наряду с этим в лёгких отмечено увеличение активностей как СОД (в 1,8 раз) (табл. 4), так и каталазы (в 1,2 раза) (табл. 4), тогда как в скелетной мышечной ткани - снижение удельных активностей указанных ферментов (СОД - с 2,09±0,20 до 1,54±0,12 у.е./мг белка, каталазы - с 0,37±0,10 до 0,14±0,02 мкмоль Н202/мин/мг белка) наряду с увеличением количества белка (в 1,7 раз) под влиянием витамина Е (табл. 4). Не обнаружено достоверных изменений уровня ТБК-РП в селезёнке и скелетной мышце лисиц, получавших витамин Е (Рис. 6 А). В целом, наблюдаются сходства в реакции АОС песцов на разные дозы витамина Е, тем не менее, степень его влияния прямо пропорциональна величине дозы. Потребление меньшей (50 мг) дозы витамина Е не оказало значительного воздействия на АОС печени, лёгких и скелетной мышечной ткани песцов, однако привело к усилению синтеза белка в печени и в скелетной мышечной ткани (увеличение содержания протеина в 1,3 раза и в 1,8 раз, соответственно) (табл. 5).
В печени песцов, получавших дополнительный витамин Е, отмечено увеличение содержания белка (в 1,3 раза в обоих случаях) (табл. 5), помимо этого под влиянием более высокой дозы витамина наблюдается более низішй уровень небелковых SH-групп (0,34±0,02 ммоль/100 г ткани) как по сравнению с контрольными животными (0,42±0,03 ммоль/100 г ткани), так и с песцами, получавшими меньшую дозу витамина (1,05±0,59 ммоль/100 г ткани) (Рис. 5 А), что может быть обусловлено проявлением витамином антиоксидантных свойств. Известно, что восстановителями а-токофероксил-радикала (образующегося при восстановлении витамином Е фосфолипидных пероксил-радикалов) до а-токоферола являются витамин С и глутатион, от их присутствия в клетке зависит проявление антиоксидантных свойств витамином Е (Rojas et al., 1996).
В почках песцов под влиянием дополнительного витамина отмечено снижение уровня белка (в 1,3 раза в обоих случаях) (табл. 5). Потребление более низкой дозы витамина Е привело к увеличению уровня антиоксидантных ферментов (снижение интенсивности люминол-зависимой ХМЛ с -2083,37±1158,41 до -5897,8±1380,89 имп./40 сек/г ткани) (Рис. 7 А) наряду с увеличением удельной активности СОД (с 0,98±0,08 до 1,31 ±0,09 у .е./мг белка) и снижением активности каталазы (в 1,3 раза) (табл. 5) в почках животных. Потребление более высокой дозы витамина привело к увеличению удельной активности каталазы (с 0,91±0,04 до 1,20±0,10 мкмоль Н202/мин/мг белка) в почках животных по сравнению с контролем и к увеличению активности данного фермента (в 1,3 раза) по сравнению с песцами, получавшими более низкую дозу витамина (табл. 5), что говорит о различной степени выработки Н202 в почках песцов, чья пища содержала разное количество витамина Е.
Скелетная мышца 0 68,85±П,98 13,01±1,13 31,27±5,88 69,10±9,26 16,08±1,02 5б,18±3,42 100 79,04±6,47 17,76±0,78 51,26±3,98 Условные обозначения: - различия достоверны по сравнению с контролем (р 0,05); 0 - различия достоверны между группами, получавшими разные дозы витамина (р 0,05). Уровень небелковых SH-групп также претерпел изменения под воздействием дополнительного витамина Е - наблюдалось его увеличение с 0,35±0,01 до 0,41±0,02 ммоль/100 г ткани в первой группе и до 0,43±0,01 ммоль/100 г ткани во второй (Рис. 5 А), что, возможно, свидетельствует о сдвиге редокс-равновесия в сторону восстановления. Вероятно, данные изменения компонентов АОС указывают на увеличение активности ГПО, использующей в качестве ко-фактора глутатион и обезвреживающей органические перекиси и Н202.
Значительное влияние на АОС лёгких оказала только более высокая доза витамина Е. Зафиксировано снижение уровня небелковых SH-групп (с 0,23±0,02 до 0,17±0,01 ммоль/100 г ткани) (Рис. 5 А), а таюке снижение как общей (в 1,9 раза) (табл. 5), так и удельной (по сравнению с контролем - с 1,02±0,06 до 0,65±0,08 у.е./мг белка, по сравнению с первой подопытной группой - с 0,99±0,05 до 0,65±0,08 у.е./мг белка) активности СОД.
