Введение к работе
Актуальность проблемы. Сегодня накоплен большой массив данных,
касающийся изучения процесса адаптации в горах на уровне целостного
организма и его систем (Барбашова З.И., I960; Френкель ГЛ., 1961; Сломим
А.Д., 1978; Газенко Г.О., 1987; Агаджанян Н.А., 2002 и другие). Эти авторы
определили закономерности нейро-эндокриниой интеграции,
газотранспортного обеспечения, гемодинамики, реакций сердечно-сосудистой системы.
Работы, освещающие закономерности системного приспособительного или дизадаптационного ответа, должны быть дополнены изучением мембранных, модификаций, развивающихся в организме при воздействии на него новой среды обитания, поскольку, ни адаптация, ни любой патологический процесс немыслимы без изменения структуры и функций мембран. Клеточные мембраны, являясь динамическими структурами, быстро реагируют на отклонения в условиях существования и способны к модификации своей структуры, что в свою очередь, определяет функциональные, а значит, и приспособительные возможности организма (Болдырев А.А., 1990).
Еще больше вопросов связано с ролью систем внутриклеточных коммуникаций. Хотя понятно, что ни один биологический процесс, начиная с молекулярного его уровня, не может осуществляться без компонента регулирования, причем во многих случаях этот компонент значительно более важен и сложен, чем конечный физиологический акт (Кухарь В.П., 1991).
В последние два десятилетия были показаны изменения в молекулярных структурах, путях метаболизма и биоэнергетики при адаптации к экстремальным факторам среды (Чотоев Ж.А., 1992; Ильина Л.Л., 2000). Уже появились, пока немногочисленные работы, посвященные структуре мембран при адаптационных, предпатологичееких и патологических состояниях (Погорелопа Т.Н. и соавт., 1990; Аирова Н.Ф. и сопят., 1993; Яковлев В.М. н соавт., 1994; Ильин В. А, и соавт., 2000). Значение этих работ велико, поскольку было впервые показано, что а высокогорье в плазматических и митохоидриальных мембранах происходят глубокие приспособительные изменения структуры. В тоже время, не все данные, полученные этими авторами, поддаются убедительной физиологической интерпретации. Большая их часть носит феноменологический характер, другая позволяет высказывать лишь предположения и гипотезы. Кроме того, многие молекулярные аспекты приспособительного процесса остаются не изученными. Например, характер модуляции мембранных сигнальных систем, их взаимоотношения в процессе адаптации, определение индикаторов резистентности к физическим факторам гор, идентификация маркеров повреждения при различных формах днзадаптацин, корреляционные связи между структурными изменениями в биомембранах и свободно-радикальными процессами, взаимодействие эндокринных и мембранных сигнальных систем, методы коррекции структуры и функций биомембран с помощью физиологически активных веществ (ФАВ) и диетических средств. Решение этих непростых вопросов требует комплексного
Подхода. Поэтому, большинство экспериментов данной работы было
поставлено с привлечением исследователей различных специальностей:
молекулярных физиологов, электрофизиологов, патофизиологов,
эндокринологов, морфологов, клиницистов.
Факторы внешней среды вызывают в многоклеточном организме сложную гамму нейрогуморальных сигналов. В клетках восприятие внешних сигналов и их реализация в форме эффекторного ответа является функцией мембранных сигнальных систем. Пока еще не отдифференцированы все механизмы сопряжения работы двух основных мембранных сигнальных (мессенджерных) систем: Са2+-мобилизующей фосфоинозитидной и аденилатциклазной при адаптации к физическим факторам гор. И, по-видимому, ответы здесь не могут быть однозначными, поскольку обе мессенджерные системы находятся в центре физиологических эффектов многих гормонов, нейромедиаторов, биологически активных веществ и электрических импульсов. Кроме того, сама мембрана способна к различным перестройкам, носящим как адаптивный, так и предпатологический и патологический характер (Sutphen R. et al., 2004; Аврова Н.Ф. и соавт.,1993; Горло Е.И., 2000). Чтобы разобраться в последствиях этих модификаций и выяснить возможные индикаторы резистентности и маркеры повреждений, мы исследовали активность мембранных сигнальных систем и структурные особенности биомембраны при изолированном и сочетанном воздействии физических факторов высокогорной среды.
Цель и задачи исследования
Цель работы - идентификация и оценка мембранных и мессенджерных механизмов ответа организма на воздействие физических факторов высокогорной среды и выяснение возможности коррекции приспособительных и дизадаптационных изменений мембран.
В ходе исследований решались следующие задачи:
-
Определить уровни и особенности структурно-функциональных изменений в биомембранах при адаптации к физическим факторам гор и оценить характер влияния мембранных модификаций на функциональное состояние организма.
-
Исследовать закономерности активации мембранных сигнальных систем и их взаимоотношения при изолированном и сочетанном воздействии физических факторов высокогорной среды.
-
Изучить характер фосфоинозитидиого ответа при изменении активности гипоталамо-гигюфизарно-адренокортикальной и симпато-адреналовой систем в условиях высокогорья.
-
Оценить роль свободно-радикальных процессов в физиологическом и предпатологическом формировании структурных перестроек в биомембранах и возможность их коррекции.
-
Установить особенности воздействия ряда физиологически активных веществ (пропранолола, Li\ норадреналина, панангина и других) на мембранный и мессенджерный ответы при адаптации к физическим факторам высокогорья.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Обратимые процессы происходящие в Са2*-мобилизуюшей мембранной сигнальной системе (сдвиг от фосфатидилинозитола (PI) к полифосфоинозитидам (poly-PI) и обратно: (РІ^їроІу-РІ) - один из мембранных механизмов, регулирующий эффекторный ответ клеток на различные по характеру, силе и длительности внешние экстремальные воздействия.
-
Снижение активности гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и симпато-адреналовой систем во второй фазе адаптации в высокогорье (3200 м над ур. м.; +10 С; 14 суток) сопровождается увеличением доли полифосфоинозитидов в мембране (сдвиг от РІ к poly-PI), что является основой повышения уровня трансдукции внешнего сигнала и приводит к возникновению новых координационных отношений между гормонами и Са*"-мобилизующей фосфоинозитидной системой.
-
Повышение содержания лизоформ фосфолипидов (lyso-PL) вызывает перестройки молекулярной структуры биомембраны. Уровень lyso-PL в мембране является индикатором интенсивности структурных изменений бислоя при воздействии физических факторов высокогорной среды.
Научная новизна
Впервые показано, что снижение активности эндокринных каскадов во второй фазе адаптации в высокогорье сопровождается изменением соотношения между мембранными компонентами: фосфатидилинозитолом (PI) и его производными - полифосфоинозитидами (poly-PI). Сдвиг от PI к poly-PI и обратно (PI poly-PI) определяет определяет уровень трансдукции внешнего сигнала, соответствующий изменившимся условиям среды и, следовательно, новые координационные отношения между клеточными сигнальными системами и эндокринными каскадами,
Выявлен синергичкый характер взаимодействия двух мембранных сигнальных систем: Са2*-мобилизующей фосфоинозитидной и аденилатцнклазной при воздействии барокамериой гипоксии и в высокогорье. Показан реципрокный характер активностей этих систем при адаптации к пониженной температуре.
Получены новые данные об особенностях активации Са2'-мобнлнзующей фосфоинозитидной системы при различных сроках экспозиции в условиях барокамеры (6000 м). В начальном периоде (6 часов) модуляция всех мембранных фосфоинозитидов при воздействии барокамериой гипоксии однотипна: происходит снижение их базального уровня, причем для РІ этот процесс проходит интенсивнее (выраженный «инозитольный» ответ). Длительное воздействие данного фактора (до 30 суток) ведет к инициации фосфорилирования РІ до полифосфоинозитидов - poly-PI. Результатом этих процессов является сдвиг в спектре иноэитольных фракций фосфолипидов в сторону повышения доли poly-PI и инициация экспрессии инозитольных мессеиджеров и диацилглицерола.
Выявлены групповые особенности мессеиджерного ответа у крыс с различной высотоустойчивостью. В низкоустойчивой группе не наблюдалось
существенных колебаний содержания poly-PI во все сроки барокамерной тренировки, в то время как у высокоустойчивых к гипоксии животных уровень poly-PI к 3-им и 30-м суткам повышался.
Получены новые факты, показывающие, что изменение мембранных потенциалов при введении физиологически активного вещества панангина, сопровождается активацией двух основных универсальных систем вторичных мессенджеров, для которых в этих условиях наблюдается реципрокный характер первичного взаимодействия.
Продемонстрирована положительная корреляция в последовательной цепи событий: высотная гипоксия — активация свободно-радикальных процессов — повышение уровня мембранных лизофосфолипидов (lyso-PL) —* изменение структурно-функциональных параметров биомембраны —> модификация эффекторного ответа организма.
Оценена роль lyso-PL как индикаторов интенсивности структурных изменений биомембран при экстремальных воздействиях среды. Повышенный уровень lyso-PL приводит к структурно-функциональным перестройкам биомембраны, и, следовательно, оказывает влияние на эффекторный ответ всего организма.
Получены новые данные о мембрано-протекторных эффектах физиологически активного вещества унитиола, Применение данного ФАВ нивелирует увеличение содержание lyso-PL и диеновых коиыогатов при экспозиции животных в условиях повышенного радиационного фона.
Практическая значимость
Выявленные изменения структуры клеточных биомембран и мессенджерного ответа и влияние на них физиологически активных веществ позволяют разработать критерии эффективности применения средств коррекции. В частности, показано, что структурно-функциональные изменения эритроцитарных мембран у людей больных хроническими обструктивными заболеваниями легких нивелируются после прохождения курса спслеотерагши в соляных шахтах и курсов КВЧ-терапии. В этой связи, теоретически обосновано применение диетических и фармакологических средств, регулирующих содержание lyso-PL в мембранах.
Результаты работы используются в учебном процессе на кафедре зоологии, физиологии человека и животных Кыргызского Национального университета им. Ж. Баласагыиа (КНУ, г. Бишкек); в Международной Высшей Школе Медицины (ISM college, г. Бишкек).
Полученные в ходе исследований данные использованы при разработке методических рекомендаций по применению мембрано-протекторных средств в целях обеспечения успешного приспособления и жизнедеятельности в высокогорье (утверждены Министерством Здравоохранения Кыргызской Республики от 18 ноября 1999 г.). Варианты указанных рекомендаций распространены и используются в подразделениях Министерства Экологии и Чрезвычайных Ситуаций Кыргызской Республики.
Апробация диссертации
Материалы работы были представлены на II Международном симпозиуме "Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма" (Чолпои-Ата, 1995 г.) на Бишкекском семинаре "Сотрудничество и защита окружающей среды" (Бишкек, 1996 г.); на Международной конференции и Приэльбрусских Беседах (Киев, 10-12 июня, Терскол, 6-12 августа 1998 г.); на Международной конференции "Итоги и перспективы развития современной медицины в контексте XXI века" (Бишкек, 1998 г.); на Международной конференции "Адаптация организма к природным и эко-социальным условиям среды" (Бишкек, 1998 г.); на Международной конференции "Горные регионы Центральной Азии. Проблемы устойчивого развития" (Душанбе, 1999 г.); на Всероссийской конференции с международным участием "Проблемы экологии человека" (Архангельск, 2000 г.); на Международной конференции "Современная медицина на рубеже XX-XXI веков" (Бишкек, 2000 г.); на Международном симпозиуме по Горной медицине (Бишкек, 2000 г.); на Международном симпозиуме "Актуальные проблемы адаптации к природным и эко-социальным условиям среды" (Ульяновск, 2002 г.); на Международной конференции "Молекулярные механизмы патологических процессов" (Санкт-Петербург, 2003 г.); на Юбилейной Научной Конференции посвященной 50-ти летию HAH КР и 10-тн летию Кыргызско-Российского Славянского Университета "Проблемы адаптации и устойчивого развития горных регионов" (пер. Туя-Ашу, Кыргызстан, 28-31 июля 2004 г.); на Российской конференции (с международным участием) «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 39 основных работ. В том числе монография "Молекулярные основы адаптации", Бишкек, івд-во КНУ им, Ж. Баласагына, 2003 г. (в соавторстве с В.М. Яковлевым).
Структура диссертации
Диссертация изложена на 229 страницах машинописного текста и состоит из введения, шести глав, заключения и выводов. Список литературы включает 387 наименований, в том числе 162 зарубежных. Работа иллюстрирована 13 таблицами, 23 рисунками и 2 схемами.
Материалы и методы исследовании
Изучение мембранных механизмов адаптации к экстремальным воздействиям среды выполнено с применением моделей в лабораторных условиях и непосредственной экспозицией в высокогорье. Па первом этапе исследовали адаптационные эффекты при изолированном воздействии двух основных физических факторов гор: гипоксичеекой гипоксии и пониженной температуры. При этом отмечали функциональные сдвиги в мембранах как в короткие промежутки времени после воздействия физического фактора
(минуты, часы), так и в более длительные периоды приспособительного процесса (до 30 суток).
Адаптационные эффекты изолированного влияния пониженной температуры (+3С) создавали в холодильной камере. Моделирование изолированного влияния высотной гипоксии проводили с помощью барокамеры, создавая в ней давление кислорода, соответствующее высоте 6000 м над уровнем моря.
На втором этапе исследовали структурно-функциональное состояние мембран при влиянии комплекса геофизических факторов высокогорья на высотах 2050 м; 2600 м; 3200 м; 3800-4000 м. Третий этап был посвящен изучению мембранных и мессенджерных эффектов таких физиологически активных веществ (ФАВ) как пропранолол (блокатор бета-адренорецепторов); унитиол (антидот, антигипоксант); литий хлористый (блокатор Са2+-мобилизующей сигнальной системы); панангин (модулятор мембранных ионных потоков); адреналин; норадреналин; витаминные комплексы. При выполнении этих серий опытов ставились две основные задачи: 1-я - изучить мембранные и мессенджерные механизмы регуляции клеточных функций при применении ФАВ в экстремальных условиях; 2-я - классифицировать перечисленные ФАВ по характеру физиологических реакций на мембранном уровне.
На последнем, четвертом этапе исследовали мембранные изменения при различных легочных нарушениях. Эти модели были выбраны для того, чтобы иметь возможность сопоставить характер изменений, имеющих место при данных формах патологии и ряде дизадаптационных состояний, При этом имелось ввиду, что идентичность молекулярных модификаций эритроцитарных мембран при обструктивних легочных заболеваниях, как и схожесть изменений реологических свойств и газотранспортной функции крови, деформируемости эритроцитов обусловлены патогенетической ролью гипоксии при развитии этих заболеваний (Гусев Б.И., 1993;ЯлкутС.И., 1995).
Основной блок экспериментов выполнен на базе Института физиологии и ЭПВ НАН КР (г. Бишкек, Кыргызстан). Методические подходы апробированы в Институте физиологии DIPAS (г. Дели, Индия). Организовано 8 основных экспедиций на высокогорные базы Центрального Тянь-Шаня (Кыргызстан): район перевала Туя-Ашу (3200 м над. ур. м.); район перевала Торугарт (3800-4000 м над ур. м.); урочище Кара-Куджур (2600 м над ур. м.); Соляные шахты (Кеминский район, 2050 м над ур. м.); район пос. Каджи-Сай (1700 м над ур. м.). В ходе данных научно-исследовательских работ проведено 9 серий экспериментов. В том числе высокогорные серии (240 крыс ; -83 добровольца); холодовые и барокамерные модели (235 крыс); исследование патологических состояний (90 человек); изучение влияния повышенного радиационного фона (145 крыс); эксперименты с применением ФАВ (260 крыс).
Функциональный тест на физическую работоспособность крыс - поднятие груза проводили по методике Сперанского СВ. (Елизарова О.Н. и соавт., 1974).
белые лабораторные крысы пинии Вистир.
Ориентировочную активность животных - тест «открытое поле» по методу Семеновой Т.П. (1978).
Часть опытных животных разделяли по признаку устойчивости к гипоксии на высоко- и низкоустойчивых (Kugimiya Т. et al„ 1984; Агаджаиян Н.А. и соавт., 1991).
Качественный и количественный состав мембранных фосфолипидов
определяли при помощи хроматографического анализа в тонком слое
силикагеля (Финдлей Д. и соавт., 1990). Уровень вторичных мессенджеров по
методикам Кулинского В.И. и Финдлей Д. (Кулинский В.И. и соавт., 1985;
Финдлей Д. и соавт., 1990) с использованием наборов «Lachema» (Чехия).
Полифосфоинозитиды: фосфатидилинозитол-4-фосфат (PIP) и
фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат (РІРг) выделяли из ткани мозга крыс (полушария) модифицированным методом Т. Nakamura (Nakamura Т. et at., 1989). Жирно-кислотную композицию фосфолипидов анализировали на газожидкостном хроматографе ЛХМ-80, с пламенно-ионизационным детектором, используя стальные колонки (Терновой В.А., 1992). Идентификацию фракций проводили с помощью стандартных препаратов ("Institute for research, production and application" (Чехия)) и по коэффициенту форетической подвижности.
В качестве вспомогательного, применялся метод инфракрасной спектроскопии биомембран. Метод основан на анализе спектров поглощения электромагнитных волн инфракрасного диапазона химическими связями фосфолипидных компонентой клеточных мембран и позволяет получать интегральную количественную информацию о состоянии бислоя (Рыскулова СТ., 1986; Hidetoshi S. et at., 1996; Каргаполов А.В. и соавт., 2002).
Данные для конкретных экспериментальных точек в каждом независимом определении получали в шести - восьмикратной повторності). Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с помощью пакета прикладных программ "Stailab", применяя корреляционный анализ, а также t-критерий Стыодеита.
Автор выражает глубокую признательность руководителям подразделений и коллегам, принявшим участие и оказавшим помощь в работе: доіст. мед. наук, профессору Д.З. Закирову (изучение взаимодействия эндокринных каскадов и мессенджерпых систем); докт. мед. наук, профессору Г.А. Захарову, канд. бнол. наук Г'.И. Гороховой и аспиранту А.А. Берлякову (оценка свободно-радикальных процессов и эксперименты с применением ФАВ); канд. бнол. наук В.А. Терновому (выделение плазматических мембран и оценка жирно-кислотной композиции фосфолипидов); аспирантам З.И. Хабибулловой и Абдивалий к. Сабнре (ИК-спектрапьный анализ биомембраи; КНУ им, Ж. Баласагыиа); канд. бнол. наук И.Р. Тупееву, врачу-терапевту Ф.М, Тойчиевой (изучение биомембран при бронхиальной астме; НИИ курортологии и восстановительного лечения МЗ КР); канд. бнол. наук Ч.С. Давлетовой (влияние повышенного радиационного фона; КГ'ПУ им, И. Арабаева); канд. биол. наук Э.А. Янгалычевой (морфометрический анализ в группах с индивидуальной высотоустойчивостыо).
