Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Современное экологическое состояние залива Петра Великого 9
1.2. Биотрансформация и детоксикация загрязняющих веществ у морских организмов 13
1.2.1. Монооксигеназная система морских рыб и двустворчатых моллюсков 14
1.2.2. Вторая фаза биотрансформации токсикантов 17
1.2.3. Антиоксидантная система морских организмов 18
1.3..Сезонные изменения молекулярных биомаркеров у гидробионтов 27
1.4. Использование молекулярных биомаркеров в мониторинге функционального состояния водных организмов 30
ГЛАВА 2. РАЙОН РАБОТ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
2.1. Район работ 38
2.2. Объекты исследования 43
2.3. Методы исследования 47
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 53
3.1. Молекулярные биомаркеры у полосатой камбалы 53
3.1.1. Сезонная динамика биохимических показателей в печени полосатой камбалы 53
3.1.2. Возрастная динамика биохимических показателей в печени полосатой камбалы 65
3.1.3. Пространственная вариабельность молекулярных биомаркеров у полосатой камбалы из Амурского залива 68
3.1.4. Активность антиоксидантной системы и биотрансформации поллютантов у полосатой камбалы из Амурского и Уссурийского заливов..69
3.2. Молекулярные биомаркеры мидии Грея 75
3.2.1. Биохимические показатели состояния мидии Грея из разных районов Амурского залива 75
3.2.2. Биохимические показатели состояния мидии Грея из разных районов Уссурийского залива 86
3.3. Межгодовая динамика молекулярных биомаркеров у полосатой камбалы и мидии Грея 97
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 100
ВЫВОДЫ 103
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105
- Современное экологическое состояние залива Петра Великого
- Район работ
- Сезонная динамика биохимических показателей в печени полосатой камбалы
Введение к работе
В настоящее время оценка качества морской среды в условиях антропогенного загрязнения, как правило, проводится химико-аналитическими методами. Однако этот подход, в связи с расширением списка поллютантов и увеличением стоимости аналитической аппаратуры, является достаточно трудоемким и дорогостоящим. Кроме того, результаты химических анализов говорят о качестве морской воды непосредственно в момент её отбора и могут значительно изменяться в связи с переносом водных масс. Биологические методы оценки качества водной среды (биотестирование) менее затратны, чем химико-аналитические, однако они дают информацию, главным образом, о последствиях загрязнения и, как правило, не указывают на причину.
Мониторинг состояния биоты в условиях загрязнения состоит из нескольких уровней, которые определяются структурой организации биологических систем (Израэль, Цыбань, 1981). На субклеточном уровне проводится изучение состояния внутриклеточных и генетических структур. На тканевом, органном и организменном уровнях - физиолого-биохимических и морфологических характеристик гидробионтов. На популяционном и биоценотическом уровнях базируется экологический мониторинг, контролирующий изменения состояния соответствующих сообществ гидробионтов.
Важным аспектом проблемы является влияние загрязнения на организм на субклеточном уровне, поскольку молекулярные эффекты являются основой неблагоприятных последствий для организмов в будущем (Walker, 1995). Химический стресс в биологических системах в настоящее время определяют с помощью молекулярных биомаркеров - "количественных показателей, измеряемых в полостных жидкостях, клетках или тканях, которые на биохимическом или клеточном уроне указывают на присутствие токсиканта и/или величину ответной реакции организма" (McCarty, Shugart, 1990). В основе изучения биомаркеров лежит использование известных
5 биохимических и физиологических реакций, которые предшествуют видимым организменным и популяционным изменениям, т.е. являются индикаторами первых стадий токсичности и патологии (Anderson et al., 2003). Такие реакции поддаются точному измерению и обеспечивают получение достоверной информации о воздействии поллютантов на организм. Изменение биомаркеров не всегда предполагает ухудшение состояния особей, как считалось ранее (Livingstone et al., 1988). В современных исследованиях биомаркеры являются в первую очередь инструментом прогнозирования состояния биоты под влиянием тех или иных факторов среды (Лукьянова, 2001).
Морские организмы, обитающие в импактных акваториях, реагируют
на большое разнообразие различных факторов, определяющих качество
воды, суммируют эффекты одновременного действия смеси различных
загрязняющих веществ (Христофорова, 1989). Поэтому изучение
биохимических маркеров должно включать характеристику
фундаментальных механизмов регуляции ответных реакций на молекулярном уровне (Wu et al., 2005). Для этого необходимо изучать как биохимический статус организмов, обитающих в условиях повышенной антропогенной нагрузки, так и динамику соотношения процессов перекисного окисления липидов и антиокислительной активности в разные сезоны у животных различных экологических групп (Garcia et al., 2000). При этом для каждой конкретной акватории принципиально важно использовать в качестве биоиндикаторов аборигенных представителей фауны, учитывая необходимость обеспечения «экологического соответствия» состояния экосистемы состоянию ее биоты, которая является ее частью (Холодкевич, 2007).
Рыбы и моллюски признаны удобными и репрезентативными объектами для биомониторинга с использованием молекулярных биомаркеров (Goldberg, 1986; Bright et al., 2002; Немова, Высоцкая, 2004; Бельчева, Челомин, 2006). Кроме того, многие виды являются объектами
промысла и используются в пищу человеком, и изучение влияния загрязнения на их метаболизм имеет практическое значение.
Целью работы являлась оценка молекулярных биомаркеров антиоксидантной системы и биотрансформации загрязняющих веществ у полосатой камбалы Liopsetta pinnifasciata и мидии Грея Crenomytilus. grayanus из прибрежных акваторий залива Петра Великого с разным уровнем антропогенного воздействия.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Определить активность антиоксидантных ферментов, величину показателей биотрансформации и уровень перекисного окисления липидов в печени полосатой камбалы в годовом репродуктивном цикле. Исследовать половые и возрастные изменения этих показателей.
Провести сравнительный анализ указанных биохимических маркеров у полосатой камбалы из разных акваторий залива Петра Великого Японского моря.
Изучить активность антиоксидантных ферментов, величину показателей биотрансформации и уровень перекисного окисления липидов в органах мидии Грея из районов залива Петра Великого с разным уровнем антропогенной нагрузки.
Оценить межгодовую динамику молекулярных биомаркеров у рыб и моллюсков. Установить наиболее информативный показатель для оценки состояния гидробионтов при антропогенном загрязнении водоемов.
Научная новизна:
Впервые исследованы биохимические показатели биотрансформации и
окислительного стресса у полосатой камбалы в заливе Петра Великого. Показана пригодность этого вида в качестве регионального индикатора для биохимического мониторинга прибрежных акваторий. У мидии Грея, традиционного биоиндикатора загрязнения прибрежных вод, выявлены адаптивные изменения биохимических показателей в отдельных районах в
7 разные сезоны. Установлена межгодовая динамика исследованных биомаркеров у рыб и моллюсков.
Практическая значимость.
Молекулярные биомаркеры являются наиболее ранними индикаторами токсичности и экологического неблагополучия, поэтому результаты могут быть использованы для научного обоснования ПДК загрязняющих веществ для рыбохозяйственных акваторий, для оценки и прогноза состояния популяций промысловых видов, а также при комплексной экотоксикологической характеристике прибрежных акваторий.
Защищаемые положения.
1. Исследованные молекулярные биомаркеры антиоксидантной системы
и биотрансформации как индикаторы биологического эффекта загрязняющих
веществ дают адекватную информацию о состоянии индикаторных видов
рыб и моллюсков в импактных районах залива Петра Великого.
2. Глутатион-Б-трансфераза как специфический биомаркер 2-й фазы
биотрансформации проявляет высокую чувствительность и незначительную
индивидуальную вариабельность у региональных индикаторных видов рыб и
двустворчатых моллюсков — L. pinnifasciata и С. grayanus, что позволяет
использовать активность этого фермента в мониторинге состояния
гидробионтов в морских прибрежных экосистемах.
Апробация работы. Результаты и основные положения работы были представлены и обсуждены на XIV ежегодной рабочей встрече North Pacific Marine Science Organization (PICES) (Владивосток, 2005); Международной конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2005); Международных научных чтениях «Приморские зори» (Владивосток, 2005; 2007); Чтениях, посвященных 200-летию МОИП «Биотехнология, экология, охрана окружающей среды» (Москва, 2005); SETAC Asia/Pacific (Пекин, 2006); Международной научно-практической конференции «Экологические проблемы использования прибрежных морских акваторий» (Владивосток,
8 2006); Международной конференции молодых ученых РІСЕЗЛСЕБ «New Frontiers in Marine Science» (Балтимор, 2007); Научной конференции с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004; 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ.
Структура и объем работы: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов. Список цитируемой литературы включает 225 источников, в том числе 138 иностранных. Общий объем работы 128 страниц. Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 28 рисункам.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н. О.Н. Лукьяновой за всестороннюю помощь, ценные советы и рекомендации; д.б.н. Н.Н. Ковалеву и к.б.н. Н.В. Колпакову за проявленный интерес к работе, конструктивные замечания и предложения; д.б.н. В.П. Чел омину за критический просмотр рукописи и полезные замечания; сотрудникам лаборатории ресурсов рыб прибрежных вод ТИНРО-Центра за помощь в отборе проб; сотрудникам лаборатории экологической биохимии Института Биологии КарНЦ РАН за предоставленную возможность прохождения стажировки, а также всем сотрудникам сектора экосистемных исследований биоресурсов прибрежных вод ТИНРО-Центра, лаборатории прикладной экологии и токсикологии ТИНРО-Центра и лично зав. лаб., к.б.н. В.В. Щеглову за постоянную поддержку.
Современное экологическое состояние залива Петра Великого
Залив Петра Великого — крупнейший из заливов в северо-западной части Японского моря. По обилию и разнообразию обитающих здесь видов морских организмов залив относится к богатейшим и наиболее продуктивным районам Дальневосточных морей (Адрианов, Кусакин, 1998). Здесь развито прибрежное рыболовство (Вдовин и др., 2004), функционируют марикультурные хозяйства (Вышкварцев и др., 2005), в промышленных объемах добываются водоросли (Кулепанов, 2005). В заливе отмечены скопления таких ценных промысловых объектов, как камчатский краб, брюхоногие и двустворчатые моллюски, креветки и шримсы, кукумария, морские ежи (Надточий и др., 2005). Практически по всему побережью располагаются рекреационные зоны. Водосборный бассейн залива относится к наиболее освоенным в хозяйственном отношении в Приморском крае. После временного спада хозяйственной активности в 1990-е гг. прибрежная зона южного Приморья вновь становится объектом интенсивного промышленного освоения, причем не только как район с существенными биологическими и другими сырьевыми ресурсами, но и как место реализации крупных гидротехнических проектов, включая строительство новых портов. Деятельность промышленных, сельскохозяйственных, судоремонтных предприятий без надлежащей очистки сточных вод в последние десятилетия привела к ухудшению экологической ситуации в большей части прибрежных акваторий. Основные источники загрязнения залива - неочищенные промышленные и бытовые стоки г. Владивостока и его пригородов, морской транспорт, сельскохозяйственные стоки и сточные воды г. Уссурийска, поступающие в залив с водами р. Раздольная (Огородникова, 2001).
На протяжении последних лет объем сточных вод, поступающих в Амурский залив, составлял ежегодно около 70 млн м , из них более 80% неочищенных и недостаточно очищенных. При этом со сточными водами поступает около 45000 т загрязняющих веществ. Приоритетными загрязняющими веществами (по массовой доле сброса) являются органические (по БПКП0ЛН), взвешенные и биогенные неорганические вещества (азот общий, азот аммонийный, нитриты, нитраты, фосфор общий). Наибольшее количество загрязняющих веществ сбрасывается со сточными водами водно-коммунального хозяйства (Нигматулина, 2005).
По данным многолетних наблюдений, наиболее экологически неблагополучными районами являются бухта Золотой Рог, пролив Босфор Восточный, внутренние части Амурского залива и залива Находка (Ващенко, 2000). Экологическая ситуация в прибрежных водах Владивостока была признана критической более 10 лет назад (Долговременная программа..., 1992). В настоящее время качество вод бухты Золотой Рог и пролива Босфор Восточный относится к V классу (грязные) и к IV классу (загрязненные) соответственно. Класс качества воды в бухте Диомид и относится к IV классу, заливов Уссурийского, Амурского и Находка - к Ш классу. Однако индекс загрязненности вод в Амурском и Уссурийском заливах за год увеличился почти на 10% (Информационный бюллетень..., 2007).
Накопление в донных отложениях большого количества органического вещества привело к их постепенному заилению, особенно в мелководной прибрежной зоне (Климова, 1988; Преображенский и др., 2000). Это вызвало изменения в составе фауны бентосных сообществ, где в настоящее время преобладают типичные обитатели мягких грунтов, адаптированные к высокому содержанию органики, такие как полихеты Tharyx pacifica и Dipolidora cardalina, и двустворчатые моллюски Raeta pulchella, Callithaca adamsi, Mya arenaria (Belan et al., 2003; Олейник и др., 2004; Надточий и др., 2005).
Район работ
Залив Петра Великого находится в северо-западной части Японского моря и ограничен со стороны моря условной линией, соединяющей устье реки Туманная с мысом Поворотным (рис. 1). Полуостровом Муравьева-Амурского и группой островов, расположенных к юго-западу от него (Русский, Попова, Рейнеке, Рикорда и др.), зал. Петра Великого разделяется на два больших залива — Амурский и Уссурийский. Кроме того, в берега зал. Петра Великого вдаются еще четыре значительных залива: Посьета, Стрелок, Восток и Находка.
Дно в зал. Петра Великого довольно ровное и плавно повышается с юга на север. Глубины в средней части залива изменяются от 60 до 120 м. Грунт вдоль берегов и в бухтах — песок, ил, встречается камень и ракушка; кроме того, в бухтах он обогащен иловыми отложениями впадающих рек. Берега залива высокие, обрывистые, большей частью скалистые, почти везде приглубые и значительно изрезаны. Протяженность береговой линии, включая острова, около 1500 км. На акватории залива много различных по величине островов, которые сосредоточены главным образом в его западной части (Лоция..., 1984).
Водосборный бассейн зал. Петра Великого сформирован многочисленными водотоками. Как правило, в небольшие бухты впадают горные или полугорные водотоки, в крупные заливы (Амурский, Уссурийский, Находка) - равнинные реки: Раздольная, Артёмовка, Партизанская. Таким образом, внутренние районы залива в теплое время года в значительной степени подвержены влиянию материкового стока.
В результате взаимодействия Приморского и Цусимского течений, а также сложного рельефа в заливах и у островов возникает сложная гидрологическая обстановка.
Сезонная динамика биохимических показателей в печени полосатой камбалы
На активность защитных ферментных систем организма оказывают влияние как экзогенные, так и эндогенные факторы различной природы. В связи с этим у рыб прибрежных экосистем, обитающих в постоянно меняющихся условиях среды, наблюдается значительная вариабельность биохимических показателей (Fitzgeland, 1992; Forlin et al., 1995; Rudneva, 1997). Следовательно, при использовании биохимических показателей в качестве индикаторов воздействия загрязнения нужно знать пределы их естественного варьирования. Специалистами неоднократно подчеркивалась необходимость изучать и учитывать степень влияния различных абиотических факторов на активность используемых биомаркеров у рыб (Bacanskas et al., 2004; Buet et al., 2006).
Предварительные исследования активности молекулярных биомаркеров в печени полосатой камбалы показали, что стандартная ошибка для выборки из 12 рыб составляла не более 10 %, за исключением содержания восстановленного глутатиона - до 34 %. (табл. 4). В литературе, однако, отмечается достаточно высокая индивидуальная вариабельность активности биомаркеров, что, по-видимому, обусловлено разной скоростью поглощения и метаболизирования поллютантов отдельными особями (Webb et al., 2005).Достоверные половые (U 0.05) различия установлены только для активности супероксиддисмутазы (табл. 5).
По литературным данным, биомаркеры биотрансформации и антиоксидантнои системы не проявляют значительной зависимости от пола рыб (Ronisz et al., 1999; Sakamoto et al., 2003; Amado et al., 2006). Исключение составляют цитохром Р450-зависимые монооксигеназы, активность которых может существенно различаться у рыб в период нереста (Lindstrom-Seppa, 1988; Whyte et al., 2000). Активность этих ферментов у нерестящихся самок снижается практически до предела обнаружения, тогда как у самцов остается высокой. В этот период у самок, как правило, значительно возрастает уровень эстрадиола в плазме, который, вероятно, подавляет монооксигеназную активность в печени (Larsen et al., 1992). Такая закономерность в изменении активности этих ферментов отмечена у рыб разных экологических групп - камбал, лососей, бычков, а также пресноводных видов (Goks0yr, Larsen, 1991). Однако отсутствие половых различий в активности этих биомаркеров может быть обусловлено загрязненностью среды обитания гидробионтов. Показано, что при сильном загрязнении его эффекты превалируют над естественными вариациями биохимических показателей (Sakamoto et al., 2003).
Отсутствие значимых половых и возрастных различий активности глутатион-8-трансферазы в кишечнике было показано у камбалы Platichthys flesus, отловленной у побережья Норвегии (Van Veld, Lee, 1988). Возможно, это характерно для всех пищеварительных органов. Данная особенность позволяет исследовать активность этого фермента независимо от пола объектов-индикаторов, что удобно при мониторинговых работах.
