Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 Терминология 10
1.2 Структура и формирование биопленок 12
1.2.1 Структура биопленок 12
1.2.2 Стадии формирования биопленок 14
1.2.3 Социальное поведение микроорганизмов в биопленке 16
1.3 Факторы, влияющие на образование биопленок 18
1.3.1 Биотические факторы 18
1.3.2 Абиотические факторы 20
1.4 Физиолого-биохимическая и экологическая активность биопленок 29
1.5 Участие биопленок в формировании биоминералов 35
1.6 Практические проблемы биологического обрастания 36
Глава 2. Объекты и методы исследования 40
2.1 Объекты и место исследования 40
2.2 Материалы исследования 42
2.3 Микробиологические исследования 43
Глава 3. Образование биопленок при трансформации гидрофобных углеводородов микробными комплексами поверхностных вод 49
3.1 Загрязнение реки Амур полициклическими ароматическими углеводородами 50
3.2 Активность микробиологической трансформации нафталина и фенантрена на трансграничном участке р. Амур 53
3.2.1 Развитие микробных комплексов на нафталине 53
3.2.2 Развитие микробных комплексов на фенантрене 63
3.3 Продукты трансформации нафталина и фенантрена 67
Глава 4. Экологические предпосылки образования биопленок в железосодержащих подземных водах 71
4.1 Роль микроорганизмов в миграции ионов железа 72
4.2 Физиолого-биохимические характеристики штаммов, выделенных из биопленок 73
4.3 Образование биопленок в присутствии органических веществ и Fe(OH)3 78
4.4 Анализ электронных изображений и элементного состава биопленок 83
Глава 5. Влияние гуминовых веществ на образование биопленок в подземных водах 90
5.1 Загрязнение подземных вод органическими веществами 90
5.2 Сезонная динамика численности физиологических групп в подземных водах 93
5.3 Особенности роста микробоценозов из подземных вод на пептоне и гуминовых веществах 96
5.4 Формирование биопленок микробоценозами подземных вод in vitro 102
Заключение 114
Выводы 116
Список литературы
- Социальное поведение микроорганизмов в биопленке
- Микробиологические исследования
- Активность микробиологической трансформации нафталина и фенантрена на трансграничном участке р. Амур
- Образование биопленок в присутствии органических веществ и Fe(OH)3
Социальное поведение микроорганизмов в биопленке
Сложная архитектоника биопленок обеспечивает возможность метаболической кооперации клеток и создает условия, способствующие симбиотическим взаимоотношениям между бактериями разных видов, при которых образование или потребление какого-либо субстрата в биопленке происходит с большей интенсивностью, чем в случае свободных (планктонных) популяций (Flemming, Wingender, 2010).
Зрелая, полноценная биопленка высоко гидратирована и состоит из колоний микроорганизмов (15% объема), окруженных экзополимерным матриксом (85% объема) (Kokare et al, 2009; Смирнова и др., 2010). Биополимерные соединения действуют как молекулярный фильтр, сорбируя и концентрируя питательные вещества из внешней среды, а также ограничивая проникновение антимикробных средств к микроорганизмам. Физиологическое значение экзополимерного матрикса (ЭПМ) бактерий состоит в создании и поддержании благоприятных условий для их существования (Watnick et al., 2000; Sutherland, 2001; Николаев, 2011). Биополимерный матрикс, окружающий биопленку, неоднороден в разных слоях, и у различных видов бактерий не одинаков по физическим свойствам и химическому составу (Ras et al., 2011). Он меняется в результате адаптации бактерий к условиям внешней среды и состоит из смеси природных полимеров -экзополисахаридов, экзолипополисахаридов, гликопротеинов, протеогликанов, аналогичных веществу клеточной стенки, гликокаликса белков, полипептидов, нуклеиновых кислот и др. В состав экзополисахаридов входят уроновые кислоты (главным образом, глюкуроновая) и аминосахара (Flemming et al., 2007; Занина и др., 2009). ЭПМ прикрепляется и удерживается на поверхности благодаря межмолекулярным ковалентным и внутримолекулярным водородным связям, а также действию сил Ван-дер-Ваальса (рисунок 1) (Flemming, 2008).
Силы, удерживающие и предотвращающие распад ЭПМ: 1 -водородные связи, 2-катионные мостичные связи, 3-силы Ван-дер-Ваальса, 4 силы отталкивания (Mayer et al., 1999). Матрикс пронизан каналами, по которым циркулируют питательные субстраты, ферменты, сигнальные метаболиты, кислород, продукты метаболизма бактериальных клеток (Li et al., 2008). Поры и каналы, пронизывающие всю биопленку образно сравнивают с кровеносной системой (Dong et al., 2001). При использовании гранулометрических методов было доказано движение потока жидкости через эти каналы. Измерение in situ растворенного кислорода с использованием микроэлектродов показало, что кислород, как и субстраты, доступен в любой точке биопленки (Beer et al., 1994).
При этом важно отметить, что биопленки непроницаемы для достаточно крупных молекул (большинство антибиотиков), так как пропускают лишь вещества с низким молекулярным весом (Романова, Гинцбург, 2011).
Дисперсия (выброс бактерий), при которой периодически от зрелой биопленки отрываются отдельные клетки, способные вновь прикрепиться к поверхности и образовать новые колонии.
Начальные элементы биопленки могут сформироваться в течение двух часов инкубации, достигая максимальной интенсивности уже через 24 часа (рисунок 2).
Первым этапом формирования биопленки на незаселенной поверхности является адгезия (прикрепление) на ней отдельных бактериальных клеток. Адгезия является ключевым моментом в образовании биопленки, а адгезины способствуют преодолению сил отталкивания, при взаимодействии одноименно заряженных поверхностей, участвуя в переходе к необратимой стадии формирования биопленки (Lappin-Scott, 2001; Singh, 2006).
Микробиологические исследования
Образование биопленок при микробиологической трансформации ПАУ. Для определения роли биопленок в трансформации ПАУ планктонными и бентосными микробными комплексами р. Амур проводили культивирование на минеральной среде М9. В колбы объемом 250 мл с горячей стерильной средой М9 в условиях асептики добавляли нафталин и фенантрен, в виде тонкоизмельченной пудры из расчета 100 мг на 100 мл. После остывания питательной среды вносили 1 мл водной пробы. Инокулят из ДО готовили из расчета 1 г сырой навески на 100 мл дистиллированной воды, встряхивали на шейкере в течение 20 минут. Затем 1 мл суспензии вносили в колбы со 100 мл стерильной питательной среды, с предварительно внесенными источниками углерода. Учитывая сезонный фактор, характер трансформации ПАУ оценивали при трех вариантах температурного режима: 1 вариант: 2С — имитация зимнего периода; 2 вариант: 23С — условия, приближенные к теплому периоду года (середина лета); 3 вариант: переходный температурный режим — 30 суток культивировали при 2С, затем до конца эксперимента при 23С.
Длительность эксперимента составляла 80 суток. Для оценки активности трансформации ПАУ проводили описание культуральных характеристик 72 модельных комплексов (на 7, 14, 30, 60, 80 сутки), учитывали следующие показатели: изменение цветности культуральной жидкости (КЖ), разрыхление частиц субстрата, образование биопленок, адгезию на стекле (на дне колб). Качественные показатели выражали в баллах от 0 до 2. Такой подход позволяет определить: активность биосорбции микроорганизмов на гидрофобных углеводородах; влияние температурного фактора на характер трансформации; адаптационный потенциал к загрязнению местообитаний выше и ниже устья р. Сунгари. Идентификацию продуктов трансформации ПАУ проводили в 36 образцах с выраженным образованием биопленок в аналитической лаборатории Хабаровского краевого центра экологического мониторинга природной среды методом хроматомасс-спектрометрии на приборе GCMS-QP 2010 «Shimadzu» по полному ионному току (аналитик Рапопорт В.Л.). В диссертации приведена лишь часть хроматограмм1 подтверждающих основные выводы, полученные в результате этих исследований. Построение графиков осуществляли при помощи программы Microsoft Excel 2010.
Формирование микробных пленок на частицах Fe(OH)3. В данном эксперименте были использованы биопленка (БП-8) из скважины пилотной установки Тунгусского месторождения подземных вод и музейный штамм из коллекции лаборатории Гидрологии и гидрогеологии (ИВЭП ДВО РАН) Caulobacter sp., Т-20. В качестве источника азота, углерода и других компонентов для роста и развития микроорганизмов использовали дрожжевой экстракт (ДЭ), который представляет собой сложную смесь органических веществ из предварительно гидролизованных или подвергшихся автолизу дрожжевых клеток. Дрожжевые клетки содержат значительное количество различных протеолитических ферментов, под действием которых в определенных условиях происходит автолиз клеток и высвобождение из них белков в виде пептонов, альбумоз, а также аминокислот, нуклеиновых кислот и др. Эти компоненты определяют состав автолизата, который сопоставим с триптическим гидролизатом других белков, в том числе и по содержанию аминного азота. Содержание аминного азота дрожжевого автолизата достигает 1000 - 1200 мг%. В эксперименте ДЭ имитировал поступление природных органических веществ в водную среду в результате сукцессии микробных комплексов и лизиса бактериальных клеток.
Инокулят, приготовленный из суспензии микроорганизмов (БП-8 и Caulobacter sp., Т-20) вносили по 1 мл в конические колбы со 100 мл жидкой среды Бромфильда (СБ) (MnS04 - 0,1 г; КН2Р04 - 0,05 г; MgS04 - 0,02 г; (NH4)2S04 - 0,1 г; Са3(Р04)2 - 0,1 г; 1 л воды) с различными добавками: I вариант: СБ + ДЭ (0,1 г/л); II вариант: СБ + Fe(OH)3 (5 г/л); III вариант: СБ + ДЭ+ Fe(OH)3 (в тех же концентрациях). Культивирование микроорганизмов проводили при температуре 22-23С в стационарных условиях. Известно, что для большинства изученных Fe (III) - редуцирующих микроорганизмов оптимальная температура для роста составляет 20-30С, хотя встречаются и психротолерантные, психрофильные, термофильные и гипертермофильные представители железобактерий (Finnerant et al., 2003).
В течение 60 суток наблюдали за характером формирования биомассы (гомогенный или пленочный рост) и особенностью бактериальной адгезии (на стекле или нерастворимых частицах гидрата окиси железа). Через 60 суток были проведены исследования биомассы на электронном микроскопе (EVO-40HV, Carl Zeiss). Для обеспечения необходимой электронной проводимости осуществляли напыление тонким слоем платины. Электронные изображения были получены в режиме вторичных электронов. Для определения элементного состава биомассы (биопленок) использовали кремний-дрейфовый рентгеновский детектор Х-МАХ 80мм2.
Адгезия на стекле в присутствии стойких и биохимически лабильных органических веществ. Для оценки характера адгезии микробных комплексов на стекле в присутствии органических веществ разной степени доступности был использован метод «Стекла обрастания» (Намсараев и др., 2006). В колбы со 100 мл жидкой питательной среды Бромфильда вносили источники углерода и помещали стерильные предметные стекла. В качестве инокулята использовали по 1 мл суспензии, приготовленной из диспергированной в течение 20 мин на шейкере (150 об/мин) биопленки БП-8 и Зх-суточной музейной культуры Pseudomonas sp. Для сравнения активности адгезии и способности к образованию биопленок использовали комплексные микробоценозы из 4-х проб подземной воды (5-2, 2-1, 2-2, 2-3) из скважин пилотной установки Тунгусского месторождения. В качестве источников углерода использовали: препарат растворимых гуминовых веществ (ГВ) (Humic acid sodium salt, H16752, «Sigma-Aldrich», Germany), как аналог трудноминерализуемых органических веществ; пептон (П) (ООО НПО «Порт-Петровск», ГОСТ 13805-76, г. Оболенск, Московская обл., серия 299), представляющий собой смесь полипептидов, свободных аминокислот, ферментов, нуклеиновых кислот и некоторых витаминов. При культивировании микроорганизмов использовали 4 модельных варианта питательных сред с разными добавками: I вариант: СБ+5 г/л FeS04+2 г/л пептона (n+FeS04); II вариант: СБ+5 г/л FeSO4+0,025 г/л препарата гуминовых веществ (rB+FeS04); III вариант: СБ+П (П); IV вариант: СБ+ГВ (ГВ).
Визуальные особенности бактериальной адгезии и формирование БП на 28 стеклах фиксировали на 7 и 30 сутки (проведено 56 описаний). В конце эксперимента производили высев культуральной жидкости на агаризованные питательные среды (РПА, РПА-10, КАА и Мф) для выявления жизнеспособных форм микроорганизмов и выделения отдельных штаммов. Стекла вынимали, фиксировали, окрашивали по Граму генцианвиолетом и фуксином (Герхардт, 1983); проводили световую микроскопию (микроскоп Carl Zeiss Imager-А2). Электронную микроскопию проводили как и в предыдущем эксперименте (EVO-40HV, Carl Zeiss).
Активность микробиологической трансформации нафталина и фенантрена на трансграничном участке р. Амур
Интенсивное образование бурых биопленок к концу эксперимента наблюдали при смене температурного режима с 2С до 23С при участии бактериобентоса из ДО, отобранных в зоне влияния стока р. Сунгари. При температуре 2С активность трансформации фенантрена была слабой и характеризовалась разрыхлением частиц фенантрена лишь на 40-80 сутки.
Трансформация фенантрена при температуре 23 С сопровождалась бактериальной адгезией к стеклу (на дне колб) в зоне непосредственного контакта с частицами субстрата. Вместе с интенсивным изменением цветности КЖ за счет образования водорастворимых «цветных» интермедиатов происходило образование слизистых темно-бурых биопленок. Это может быть связано с дифференциацией бактериального сообщества на представителей, способных к необратимой адгезии на стекле (рисунок 14) и развивающихся в виде биопленок в толще КЖ за счет растворенной составляющей фенантрена. Интенсивное образование слизистого матрикса (рисунок 15) можно связать с защитным механизмом против накопления в КЖ токсичных цветных продуктов деградации ПАУ. Ранее было показано, что среди продуктов микробиологической трансформации нафталина, присутствовал 1,4-бензохинон, изменяющий окраску КЖ до интенсивно бурого цвета (Рапопорт, Кондратьева, 2008). Рисунок 14. Биосорбция бентосных микробных комплексов, культивируемых на
Бактериальная адгезия является начальным этапом процесса биотрансформации и ассимиляции органических субстратов (Куюкина и др., 2011). Известно, что микробные комплексы, адаптированные к хроническому загрязнению, характеризуются повышенной адгезивной активностью (Криворучко, 2008). В нашем случае необратимая адгезия и образование крупных слизистых биопленок происходили в вариантах с МК из ДО, отобранных ниже устья р. Сунгари при температуре 23С и смене температурного режима 2-23С. Ранее было отмечено, что чем больше растворимость ПАУ, тем меньше на них образуется биопленок (Johnsen, 2004). Этим можно объяснить различия в интенсивности образования биопленок на частицах нафталина и фенантрена в нашем эксперименте.
Экспериментальные исследования показали, что при трансформации ПАУ накопление цветных продуктов определяется температурным режимом, структурой и адгезивной способностью микробных комплексов, местом отбора проб донных отложений и степенью их загрязнения ароматическими углеводородами (Кондратьева и др., 2013). Ранее, на примере актинобактерий рода Rhodococcus было установлено, что их адгезивные свойства по отношению к жидким углеводородам зависели от штаммовой специфичности, экологической приуроченности и условий культивирования (Рубцова и др., 2009).
Кроме того, было отмечено, что соленость и внесение легкодоступных ОВ может оказывать существенное влияние на метаболизм МК в зависимости от их местообитания. При повышении солености и в присутствии пептона происходило образование слизистого матрикса биопленок на частицах субстрата и интенсивное окрашивание КЖ цветными интермедиатами. Такими свойствами обладали бентосные микробоценозы, сформировавшиеся в зоне влияния р. Сунгари. Адгезивная способность у планктонных микробных комплексов не выявлена.
Показано, что образование токсичных цветных продуктов стимулировало продуцирование бактриобентосом защитного слизистого полимерного матрикса. Изменение абиотических и биотических факторов оказывало существенное влияние на спектр образуемых токсичных продуктов. Так, при трансформации нафталина и фенантрена было отмечено образование диметилбензолов (м- и п 68 ксилолы), они накапливались в КЖ независимо от местообитания бактериобентоса. Причем при трансформации нафталина при низкой температуре, доминировали м- и и-ксилолы. Экспериментальное моделирование процессов трансформации нафталина позволило выявить вероятность образования в природных условиях целого комплекса метилированных производных бензола (Рисунок 16). в присутствии пептона при 2С. Максимальное содержание метилбензола (толуола) было отмечено при трансформации нафталина в присутствии дополнительного источника углерода (0,2% пептона) при 23 С с участием бактериобентоса, испытывающего хроническое загрязнение в зоне влияния реки Сунгари.
Характер трансформации фенантрена пленками бактериопланктона из различных местообитаний зависел от условий температурного режима, присутствия ко-фактора (пептона) и NaCl (Рисунок 17).
Образование биопленок в присутствии органических веществ и Fe(OH)3
Наблюдения за изменением качества природных вод, проведенные в последние десятилетия, свидетельствуют об общей тенденции к его снижению. Важным аспектом сохранения высокого качества поверхностных и подземных вод, является предотвращение их загрязнения органическими веществами различного строения и генезиса (Кондратьева, 2005).
Органические вещества, содержащиеся в природных водах, подразделяются на автохтонные, образующиеся в результате жизнедеятельности и распада водных организмов и растений, и аллохтонные, поступающие извне с атмосферными осадками, хозяйственно-бытовыми и техническими сточными водами. К основным загрязнителям относятся ионы аммония, нитрит- и нитрат-ионы, углеводороды различного строения и происхождения. Вместе с природными соединениями железа и марганца, сероводородом, гуминовыми комплексами они усложняют процессы водоподготовки (Matilainen et al., 2010).
Быстро подвергаются разложению водорастворимые формы органического азота (NOB), которые могут поступать в природные воды от хозяйственно-бытовых источников и в результате биохимических процессов, связанных с циклами углерода и азота. Органический азот представлен продуктами разложения животных, растительных белков и микробиальной биомассы: низкомолекулярными пептидами и аминокислотами (Lee et al., 2006).
Среди соединений природного происхождения особое место занимают гуминовые вещества (ГВ), которые представляют собой сложные смеси биологически устойчивых, высокомолекулярных соединений, обладающих повышенной комплексообразующей способностью. Они содержатся во всех природных водах, где происходят процессы биотрансформации органических остатков (Перминова, Жилин, 2004; Van Zomeren et al., 2008), а также участвуют в инактивации токсичных металлов (Моисеенко, 2011). В подземных водах растворенный органический углерод варьирует в концентрационных пределах от 0,2 до 15 мг/л. Гуминовые вещества составляют до 90% от растворенного органического углерода (РОУ), поступающего в ПВ с поверхностным инфильтратом, либо в результате биогеохимических процессов, происходящих в водоносном горизонте (ВГ).
В большинстве случаев в подземных водах с низким содержанием РОУ (0,2-1 мг/л) ГВ образуются в результате взаимодействия микроорганизмов с органогенными породами в водоносных горизонтах. Стоит отметить, что даже при низких концентрациях ГВ, их биодеградация влияет на функционирование экосистем подземных вод и на химический состав воды (Thurman, 1985; Young, 2004). Хотя ГВ представляют собой смесь макромолекул переменного состава и нерегулярного строения с высокой степенью устойчивости к разложению, они подвергаются микробиологической трансформации. Сорбция микроорганизмов на частицах гуминовых веществ с высокой молекулярной массой выступает в качестве предварительного шага, предшествующего их ферментативному расщеплению, гидролизу и дальнейшей утилизации. Ключевыми факторами при этом выступают способность микроорганизмов продуцировать внеклеточные полимеры и присутствие двухвалентных катионов, в том числе кальция и магния (Esparza-Soto, Westerhoff, 2003; Rodrigues, 2010; Goode, Allen, 2011). Дальнейшая судьба ГВ зависит от присутствия низкомолекулярных органических кислот, гидрофобности биополимеров и различных элементов, образующих с ними подвижные хелатные комплексы (Huber et al., 2011). В этом отношении значимое место занимают ионы железа, образующие коллоидные соединения с ГВ в природных водах (Перминова, 2008) и в процессе водоподготовки (Букреева и др., 2009;Шиянидр.,2013).
В результате преобразования органических соединений в водных средах и на разделе фаз вода-порода микроорганизмы способны образовывать биопленки. Установлено, что внеклеточные полимерные вещества, включая СПС, производятся в основном в экспоненциальной фазе и служат в дальнейшем источником углерода и энергии, также они определяют внешнюю и внутреннюю структуру БП, поддерживают их целостность (Sutherland, 2001). Формирование биопленок контролируется комплексом взаимосвязанных физических, химических и биологических процессов (Fang et al, 2009; Flemming, 2011; Пуриш и др., 2012). Смена физико-химической обстановки может повлиять на качественные и количественные перестройки в подземных микробных комплексах (МК), которые способны привести к биообрастанию порового пространства вокруг водозаборных скважин и самих скважин, а также к ухудшению качества подземных вод (Карманов, Филимонова, 2011; Singh, 2006). Процессы, связанные с появлением и эволюцией биопленки при много факторных условиях очистки воды, в том числе при периодической обратной промывке, до сих пор остаются недостаточно изученными, находятся в состоянии неопределенности и во многом зависят от предварительных экспериментальных проверок (Gilbert et al, 2013). 5.2 Сезонная динамика численности физиологических групп в подземных водах В связи с тем, что формирование биопленок в значительной степени определяется присутствием ОВ и количеством микроорганизмов в подземных водах, нами была определена численность культивируемых физиологических групп микроорганизмов, принимающих участие в формировании качества воды в разных слоях водоносного горизонта: 2-1 (глубина 26 м); 2-2, 5-2 (глубина 36 м); 2-3 (глубина 47 м). Существенный вклад в разнообразие МК верхнего слоя водоносного горизонта вносили железомарганцевые бактерии (ЖМБ), образующие на среде Бромфильда различные морфотипы колоний. С глубиной увеличивалась численность аммонифицирующих бактерий (АМБ), предпочитающих NOB. Максимальная численность нитрифицирующих бактерий была характерна для среднего слоя ВГ (скважина 2-2) (рисунок 25).
