Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Влияние температуры на эмбриональное и постэмбриональное развитие рыб 9
1.2. Формирование фонда первичных половых клеток у рыб в норме и в экстремальных условиях окружающей среды 17
1.3. Влияние токсикантов на ранний онтогенез рыб 23
1.4. Методы повышения жизнестойкости рыб в раннем онтогенезе 31
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
Глава 3. Морфологическая характеристика сиговых рыб и формирование фонда половых клеток 45
3.1. Морфологические характеристики сиговых рыб на этапе вылупления 45
3.2. Характер формирования фонда ППК в эмбриогенезе тугуна и чира в норме и при повышенных температурах 55
3.3. Состояние фонда половых клеток у сиговых рыб в постэмбриональный период 58
Глава 4. Влияние ВРФН на эмбриогенез вьюна и его модификация слабыми импульсными магнитными полями 66
Глава 5. Влияние нефтепродуктов на становление фонда половых клеток в постэмбриогенезе сиговых рыб и их активизация СИМП 77
5.1. Влияние ВРФН на формирование генеративной системы сиговых рыб и их активизация СИМП 77
5.2. Влияние фенольного загрязнения на формирование генеративной системы сиговых рыб 91
Глава 6. Состояние жизненно важных органов молоди сиговых рыб в условиях загрязнения среды нефтепродуктами. Протекторное действие слабых импульсных магнитных полей 100
6.1. Видоспецифическая резистентность молоди и сиговых рыб к нефтяному загрязнению 100
6.2. Влияние слабых импульсных магнитных полей на молодь сиговых рыб в условиях хронического нефтяного загрязнения... 115
6.3. Влияние фенольного загрязнения на морфофункциональные показатели молоди сиговых рыб 127
ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ 137
ВЫВОДЫ 156
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 158
ПРИЛОЖЕНИЕ 178
- Влияние температуры на эмбриональное и постэмбриональное развитие рыб
- МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Морфологические характеристики сиговых рыб на этапе вылупления
Введение к работе
Актуальность темы. Многофакторное антропогенное воздействие на
гидроэкосистемы Обь-Иртышского бассейна приняло угрожающие
масштабы. В отдельных участках Средней и Нижней Оби количество
нефтепродуктов и других токсикантов неорганической и органической
природы превышает ПДК в десятки и сотни раз [Экологич. состояние ...,
1996-2003]. Это сопровождается радикальными изменениями
гидрохимического режима, вызывает деградацию экосистем, снижение
биоразнообразия, замену высокопродуктивных биоценозов
малопродуктивными. Рыбы, как конечное трофическое звено водных экосистем, часто являются их ключевыми компонентами и принимают на себя основную тяжесть техногенной нагрузки. В последние годы многими исследователями отмечались вызванные различными загрязнениями патоморфологические изменения печени, гонад, почек, жаберного аппарата и других органов сиговых рыб [Селюков и др., 1994; Селюков, 1997, 2002 а,б; Савваитова и др., 1995; Чеботарева и др., 1996, 1997; Моисеенко, Лукин, 1999; Лукин, Шарова, 2002 и др.]. Уровень аномалий и гибель рыб возрастают, если объектами поражения становятся ранние стадии развития [Данильченко, 1977; Миронов и др., 1992; Кошелева и др., 1994; Таликина и др., 1999-2004; White et al, 1999; Smoker et al, 2000; Руднева и др., 2003 и др.]. В проводимых исследованиях авторами выявлялось состояние функциональных систем организма, определялись степень и характер поражения, его критические нагрузки, изучались механизмы происходящих нарушений. Принимая безусловную необходимость подобных работ, считаем не менее важным проведение поиска высокоэффективных методов реабилитации, не оказывающих на организмы и экосистемы побочных патогенных влияний.
Внимание исследователей неоднократно обращалось на эффекты малых и сверхмалых доз - низкие и сверхнизкие концентрации БАВ, низкоинтенсивные излучения [Казначеев, Михайлова, 1981; Цой и др., 1985;
5 Бурлакова, 1994; Кузин, 1997; Рорр, Chang, 1998; Бурлаков и др., 1999, 2000 и др.]. Применение электромагнитных полей, близких по амплитуде и частоте к естественным, нормализующее развитие живых организмов в экстремальных условиях, может рассматриваться в качестве одного из подходов, повышающих их устойчивость.
Цель. Исследование формирования систем органов экологически различных видов сиговых рыб под влиянием природных и антропогенных факторов разной интенсивности.
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
Изучить видоспецифичность морфологических параметров тугуна, пеляди, муксуна, сига-пыжьяна и чира на этапе вылупления методами многомерной статистики.
Проанализировать цитоморфологические особенности и формирование фонда первичных гоноцитов в эмбриогенезе короткоциклового тугуна и длинноциклового чира при субпороговых температурах.
Исследовать динамику эмбрионального развития вьюна, как модельного объекта, в условиях нефтяного загрязнения под влиянием слабых импульсных магнитных полей (СИМП).
Охарактеризовать специфику гонадогенеза у интактной и активированной СИМП молоди сиговых рыб в условиях загрязнения среды нефтепродуктами.
Оценить влияние СИМП на развитие головного и спинного мозга, сердца, печени, кишечника и туловищной мускулатуры в постэмбриональном онтогенезе сиговых рыб при их содержании в растворах нефти и фенола.
Научная новизна. Проведено сравнительное исследование особенностей распределения и цитоморфологии первичных гоноцитов в эмбриогенезе короткоциклового планктофага-тугуна и длинноциклового бентофага-чира при инкубации в контрастных температурных режимах.
Исследовано влияние водорастворимой фракции нефти (ВРФН) и фенола на формирование жизненно важных органов в раннем онтогенезе
сиговых - планктофагов тугуна и пеляди, планктобентофага-муксуна, бентофагов сига-пыжьяна и чира - и выявлена их видоспецифическая реакция на данные токсиканты. Установлены режимы применения слабых импульсных магнитных полей, повышающих неспецифическую резистентность молоди сиговых рыб. Показана возможность нивелирования слабыми импульсными магнитными полями поражения сиговых рыб фоновыми концентрациями нефтепродуктов на ранних этапах онтогенеза. Положения, выносимые на защиту:
В эмбриогенезе сиговых рыб количество первичных гоноцитов, их цитометрические параметры и темп миграции в область формирования гонад варьируют в широком диапазоне у разных видов и в значительной степени обусловлены температурными флуктуациями.
Влияние фоновых концентраций ВРФН и фенола на гонадогенез молоди сиговых рыб видоспецифично, наименьшей токсикорезистентностыо характеризуется репродуктивная система тугуна, наибольшей - муксуна.
Системы органов молоди разных видов сиговых рыб различаются степенью токсикорезистентности, которое возможно повысить воздействием на предличинок слабых импульсных магнитных полей.
Практическая значимость. Показана благоприятная, повышающая устойчивость молоди сиговых рыб к экстремальным абиотическим факторам (ВРФН и фенол), роль слабых импульсных магнитных полей определенных диапазонов и интенсивности. Технические системы (Т-101 и Т-102), генерирующие слабые импульсные магнитные поля, целесообразно включать в схемы производственного цикла на действующих и проектируемых рыбоводных предприятиях, в особенности расположенных в зонах повышенного экологического риска. Установленное их положительное влияние на ранние стадии наименее резистентных и наиболее чувствительных к воздействию токсикантов рыб открывает
7 перспективы распространения данного подхода для их реабилитации в наиболее кризисных регионах.
Результаты исследований используются при чтении лекций и проведении практических занятий по спецкурсам «Экология рыб» и «Антропогенное воздействие на гидробиоценозы» на кафедре зоологии и ихтиологии Тюменского госуниверситета.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на VI Всероссийском научно-производственном совещании «Биология, биотехника разведения и промышленного выращивания сиговых рыб» (Тюмень, 2001); VIII и IX Международном симпозиуме «Биология и разведение сиговых рыб» (Рованиеми, Финляндия, 2002; Ольштын, Польша, 2005); I—III Международных Форумах по проблемам науки, техники и образования (Москва 2003, 2004, 2005); XVI Всероссийской научно-практической конференции «Словцовские чтения» (Тюмень, 2004); на конференции молодых ученых «Экология в меняющемся мире» (Екатеринбург, 2006); на заседаниях кафедры зоологии и ихтиологии Тюменского государственного университета (2003-2006). Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 18 работ.
Благодарности. Выражаю глубокую сердечную благодарность своему научному руководителю Александру Германовичу Селюкову, за наставления, чуткость, внимание и понимание, проявленное при планировании, проведении и оформлении исследований по теме диссертации, а также всем сотрудникам кафедры зоологии и ихтиологии ТюмГУ.
Глубоко признательна сотрудникам ФГУП «Госрыбцентр» и специалистам Тобольского инкубационного цеха за помощь в осуществлении экспериментальных работ.
Влияние температуры на эмбриональное и постэмбриональное развитие рыб
Температура - один из важнейших факторов окружающей среды оказывает существенное влияние на продолжительность развития и выживаемость эмбрионов рыб и личинок [Гулидов, Попова, 1979; Битюкова, 1984; Игумнова, 1985; Batty, Blaxter, 1992; Мухин и др., 2003], рост и созревание взрослых особей [Буцкая, 1980; Володин, Гречанов, 1985; Емельянова, Макеева, 1988; Чернокожева, Чмилевский, 1993].
В основе действия температуры на скорость развития пойкилотермных животных лежит кинетика протекающих в клетках реакций, описанная Вант Гоффом и Аррениусом. Согласно правилу Вант Гоффа, при повышении температуры в пределах оптимума на 10С скорость химической реакции увеличивается в 2-3 раза, т.е. температурный коэффициент Qio для биологических процессов составляет 2-3. Анализ зависимости Q]0 от температуры показывает, что у всех животных значения температуры, при которых Qio приближается к 1, являются пороговыми и соответствуют верхним границам размножения [Детлаф, 2001].
Неодинаковую зависимость темпа развития от температуры на разных этапах эмбриогенеза неоднократно подчеркивали исследователи критических периодов развития у рыб [Владимиров, 1975]. С другой стороны, Леман и Хадорн [цит. по: Детлаф, 2001] на зародышах Tubifex показали, что при трех разных температурах промежутки времени, соответствующие разным одноименным периодам, с изменением температуры изменяются пропорционально друг другу. Это дало основание Т.А. Детлаф предложить в качестве универсальной меры развития продолжительность наименьшего митотического цикла в период синхронных делений дробления зародыша -т0. А отношение времени наступления какого-либо этапа развития тх к т0 -«числом т0», или «числом детлафов» (по предложению А.А. Нейфаха в 1961 г.). Однако использование данного критерия для определения сопоставимых стадий развития животных возможно только в зоне оптимальных температур [Детлаф, 2001].
Графики зависимости т0 от температуры могут выступать, по мнению Т.А. Детлаф, в качестве «экологических паспортов» пойкилотермных животных. Кривые зависимости т0 от температуры используются для решения вопроса о генетическом закреплении температурных адаптации вида, а также для определения оптимальных условий развития при постановке экспериментов по воспроизводству животных [Детлаф, 1998].
Эти графики имеют гиперболический вид. Если построить такую кривую в полулогарифмических координатах, она примет вид прямой с двумя переломами, которые соответствуют границам температурного оптимума. Показанные границы температурного оптимума на примере тепловодных видов [Детлаф, 2001] установить для холодноводных рыб, к которым относятся и сиговые с продолжительным эмбриогенезом, невозможно. Определение температурных оптимумов развития таких видов производится при регистрации температурных режимов в местах нереста или в лабораторных условиях.
В монографии Т.А. Детлаф [2001] представлены кривые зависимости т0 от температуры и для таких видов сиговых рыб, как пелядь {Coregonus peled), сиг {Coregonus lavaretus) и чир {Coregonus nasus). В зоне оптимальных для эмбрионального развития сиговых температур, близких к нулю [Черняев, 1990; Богданов, 1997 и др.], значение т0 у пеляди составляет около 720 минут, у сига - 450 мин., чира - 700 мин. При температуре +6С у пеляди то=250 мин., у чира при +5С - 300 мин. Таким образом, продолжительность одного митотического цикла в период синхронных делений дроблений у пеляди сокращается в 2,9 раза, а у чира - в 2,3 раза.
По данным О.А. Лебедевой [1980], у пеляди и чира верхние температурные пределы развития были 6 и 5С соответственно. При этих температурах инкубации продолжительность эмбриогенеза составила у пеляди - 62-90 сут, а у чира - 62-81 сут. По сравнению с природными и заводскими условиями, соответственно, 150-170 и 159-171 сут - у пеляди; 180-200 и 154-171 - у чира. Следовательно, при повышенных температурах продолжительность эмбриогенеза у пеляди сокращается в среднем в 2,2 раза, у чира-в 2,5.
Для сиговых рыб изучение температурного оптимума сводится только к определению верхней температурной границы развития. Исследования В.Д. Богданова [1997] подтвердили предположения И.Г. Юданова [1939, цит. по Богданов, 1997], теоретические и экспериментальные данные Ж.А. Черняева [1971, 1990] о возможности развития икры сиговых рыб в состоянии «пагона», вмороженной в лед. По данным В.Д. Богданова [1997], зародыши в таком состоянии не только нормально развиваются, но для некоторых видов оно может быть обязательным.
Материал и методы исследования
Исследования проводились в Центре экологических исследований и реконструкции биосистем биологического факультета Тюменского госуниверситета в течение 2001-2005 гг.
В 2002-2003 гг. был поставлен эксперимент по выявлению особенностей формирования генеративной системы у тугуна и чира при повышенных -субпороговых - температурах инкубации (рис. 1). В качестве контроля были использованы зародыши этих же видов из Тобольского инкубационного цеха. Для исследования формирования репродуктивной системы эмбрионов фиксировали в смеси Буэна с интервалом 10-15 суток.
В марте-апреле 2004 и 2005 гг. было поставлено 4 серии экспериментов на модельном объекте - вьюне - с целью выявления характера и глубины поражения ВРФН (0,25 мг/л - 5ПДКрбхз) этого вида в эмбриональный период с проверкой возможности ее ослабления слабыми импульсными магнитными полями (СИМП) подбором необходимых режимов. Выявляли стадии развития, обработка СИМП которых могла повысить устойчивость 1800-5900 эмбрионов вьюна от одной пары производителей в разных вариантах по три повторности в каждом. Оплодотворенные яйцеклетки или зародыши одной и той же стадии по 100-120 экземпляров на повторность помещали в чашку Петри, заполненную слоем воды толщиной 4-5 мм. Инкубацию икры до этапа вылупления проводили при температуре 18-19С. Различия между контрольными и опытными эмбрионами оценивали по динамике отхода до 14-20, 30-33 стадий и на этапе вылупления - 37 стадия [Костомарова, 1975]; учитывали количество особей с патологиями на 30-33 стадии и после вылупления. Синхронность развития оценивали на 14-20 (обрастание желтка бластодермой) и 30-33 (дифференцировка сомитов и обособление хвостового отдела) стадиях эмбриогенеза. Достоверность различий распределения эмбрионов по стадиям определяли с помощью непараметрического критерия А, (лямбда) Колмогорова-Смирнова.
В апреле-июне 2004 и 2005 гг. проводили опыты по воздействию токсикантов (ВРФН, фенол) и влиянию СИМП на развитие ряда органов молоди сиговых рыб с наиболее детальным изучением формирования репродуктивной системы.
16 апреля 2004 г. из Тобольского инкубационного цеха была доставлена молодь сиговых рыб (тугун, пелядь, муксун и сиг-пыжьян) на этапе вылупления. Ее поместили в термостатированную установку (+4...+5,5С) с прозрачной дверцей, обеспечивавшей естественную фотопериодичность. В течение эксперимента молодь содержали в тех же условиях с нарастающим температурным градиентом, по аналогии с природным водоемом (рис. 3).
До начала проведения эксперимента личинок всех видов разделили на три группы (варианта). Первая группа оставалась в качестве контрольной, вторая (1 вариант) и третья (2 вариант) 22 апреля были помещены в стеклянные емкости с водорастворимой фракцией нефти (Рис. 4). Для проявления адаптационного эффекта [Лукьяненко, 1983], в течение первых двух суток предличинок обоих вариантов выдерживали в концентрации ВРФН 0,125 мг/л (2,5 ПДКрбХз)- Несмотря на то, что ВРФН являются не только наиболее токсичными, но и высокоустойчивыми, каждые трое-четверо суток нефтяную эмульсию готовили заново, в которую и переводили подопытную молодь. Для снятия негативного воздействия токсиканта в процессе формирования и активизации механизмов и переводили подопытную молодь. Для снятия негативного воздействия токсиканта в процессе формирования и активизации механизмов неспецифической резистентности личинок всех видов во 2 варианте 21 апреля (т.е. до их перехода на смешанное питание) в течение 80 мин. обрабатывали СИМП с частотами 930-950/230-235 кГц, генерируемыми приборным комплексом «Т-101» (ТУ 4237-001-29646556-99), по технологии «Телос» [Солодилов, 2000, 2001]. Напряженность магнитного поля не превышала 2,0 10"5 А/м. В контрольные и опытные емкости (0,5 л) компрессором TYP APR-200 с умеренной интенсивностью подавался воздух.
Морфологические характеристики сиговых рыб на этапе вылупления
Все сиговые рыбы рода Coregonus подразделяются на сигов-планктофагов и сигов-бентофагов. Именно по характеру питания происходила межвидовая и внутривидовая дивергенция этой группы [Решетников, 1980]. Так, в пределах вида Coregonus lavaretus малотычинковые, средне- и многотычинковые виды различаются характером питания, а число тычинок является важнейшим систематическим признаком, имеющим наибольший таксономический вес [Андреев, Решетников, 1977; Решетников, 1980]. К промежуточной группе сиговых рыб может быть отнесен планктобентофаг-муксун - многотычинковый вид с нижним ртом. Многотычинковые планктофаги p. Coregonus в водоемах Западной Сибири представлены ряпушкой, тугуном, омулем и пелядью, малотычинковые бентофаги - сигом-пыжьяном и чиром. Детальный анализ морфобиологических параметров сиговых рыб Онежского озера с описанием видовых характеристик и обоснованное изложение позиции относительно сохранения сложившегося статуса этой группы приведен в работе Ю.С.Решетникова и А.А.Лукина [2006].
Ниже излагаются результаты морфометрического анализа пяти представителей сиговых рыб, типичных для Обь-Иртышского бассейна, в период, наиболее достоверный с точки зрения их исходного морфобиологического статуса - этап вылупления.
На данном этапе только что вылупившиеся особи были охарактеризованы по 20 признакам. Самыми мелкими представителями .Coregonus являются тугун и пелядь (прил. 1). Хотя молодь пеляди несколько крупнее, меланиновая пигментация у нее выражена слабо, тогда как у тугуна этот показатель кратно выше.
Молодь муксуна крупнее тугуна и пеляди. У него наблюдается и большее число меланофоров, однако на дорзальной стороне тела количество меланофоров больше у тугуна.
Сиг-пыжьян характеризуется меньшими значениями пластических признаков, чем муксун, но пигментация у него выражена сильнее.
Среди предличинок сиговых молодь чира по большинству анализируемых признаков характеризовалась наибольшими показателями (рО.001). Лишь с предличинками муксуна не было выявлено различий по таким признакам, как высота и длина желточного мешка, межглазничное расстояние и наибольшая толщина тела, а с предличинками сига-пыжьяна - по средней длине грудного плавника. Количество же меланофоров значительно превышает таковое у других видов (прил. 1.).
Кластерный анализ у сиговых на этапе вылупления выявил низкую, реже -среднюю корреляционную связь морфологических признаков (рис. 7). Причем у всех видов наблюдается сильная связь абсолютной длины тела с длиной тела до конца хорды и антеанальным расстоянием. А у муксуна и тугуна высокая корреляция наблюдается и по числу меланофоров: . mjv-mfs (тугун), mfc-mfd и mjv-mfs (муксун).
В программных средствах дискриминантного анализа используются три версии: стандартная - с учетом всех переменных - и пошаговая в двух версиях (вперед и назад). В пошаговых версиях задаются уровни по F-критерию или вероятности включения в дискриминантный анализ переменной и ее исключения.
Результаты дискриминантного анализа с учетом всех переменных приведены в таблице 2. Ведущее значение в разделении видов по частному критерию Вилкоксон-лямбда и непосредственно связанному с ним F-критерию имеет такой морфометрический показатель как длина грудного плавника (PL). Второе по значимости место принадлежит счетному признаку - количеству меланофоров на желточном мешке (mfs), третье - антеанальному расстоянию (АА). В целом наблюдается слабая зависимость видов друг от друга по линейному коэффициенту детерминации. Но некоторые признаки демонстрируют высокую корреляцию и являются избыточными (табл.2.). К ним относятся абсолютная длина тела (L), длина тела до конца хорды (Ы) и антеанальное расстояние (АА).
В таблице 3 приводится оценка различий, оцениваемых по F-критерию и дистанции Махаланобиса. Из нее следует, что по совокупности морфологических признаков наиболее удаленным от остальных видов является чир. В некотором смысле центральным для оставшихся четырех видов можно рассматривать сига-пыжьяна, а ближе всех к нему расположен муксун. В данном случае F-критерий однозначно упорядочивает виды по расстоянию друг от друга: пелядь-тугун-сиг-пыжьян-муксун-чир.
